多重荧光定量pcr同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物和探针的制作方法
【专利摘要】本申请属于分子生物学领域，公开了一种多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物和探针、及方法。本发明的多重荧光定量PCR检测方法，不仅可以快速明确感染的病原体，减少检测费用，而且解决了临床小儿呼吸道病毒感染病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。
【专利说明】
多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣 原体的引物和探针
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，是涉及一种多重荧光定量PCR同时检测肺 炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物和探针。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体(M. Pneumonia)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变 以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜 伏期2~3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽 痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬 时节。
[0003] 人类的肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)感染是世界普遍性的。肺炎衣原体传 染途径是通过呼吸道分泌物的人-人传播。因此，在半封闭的环境如家庭、学校、军队以及其 他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。肺炎衣原体的感染还可能与哮喘、冠心病及 动脉粥样硬化的发病、慢性阻塞性肺疾病的急性发作和恶化有关。目前，肺炎衣原体已是继 肺炎双球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的主要病原体，与嗜肺军团菌和肺炎 支原体一起成为社区获得性肺炎的三种非典型病原体，占社区获得性肺炎的10%~20%。
[0004] 《伯氏系统手册》（1984)的记载，将沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)分为3个 生物型，即小鼠生物型(biovar mouse)、沙眼生物型(biovar trachoma)和性病淋巴肉芽肿 生物型（biovar lymphogranulomavenereum，LGV)。后二者与人类疾病有关。用间接微量免 疫荧光试验，沙眼生物型又分43、8 &、(：、0、0&3、？、6、!1、1、1&、1、1(14个血清型，11^生物型又 有LI、L2、L2a、L34个血清型。沙眼衣原体是一类在细胞内寄生的微生物，大小约250~ 450nm。衣原体不耐热，在室温下迅速丧失其传染性，加温至50 °C，30分钟即可将其杀死。但 是衣原体耐寒，-70°C下能存活数年。四环素、红霉素、氯霉素对它有抑制作用，而链霉素、新 霉素对它则无效。常用的消毒剂如0.1%甲醛、0.5%石炭酸可将衣原体迅速灭活。
[0005] 由于这些病原体引起的呼吸道感染症状不典型，影像学检查不易快速鉴别诊断。 目前这3种病原体的检测主要有免疫学方法和分离培养法，而免疫学方法特异性不高，分离 培养比较耗时，都不易快速确定病原体，影响临床早期诊断和有效治疗，也导致了耐药菌株 的不断增加。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎 衣原体和沙眼衣原体的引物、探针及方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物，所述引 物序列为：
[0010]多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的探针，所述探 针序列为：
[0012]具体方法为：
[0013] (1)采用沙眼衣原体(VR-879D)、肺炎衣原体(VR-1360D)和肺炎支原体（15531D)的 核酸DNA为模板，根据合成的引物序列分别扩增获得沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体 的基因片段，然后克隆入T载体中，转化DH5a菌株进行扩增培养，抽提重组质粒，测序确认病 原体序列。沙眼衣原体(VR-879D)、肺炎衣原体(VR-1360D)和肺炎支原体（15531D)的核酸 DNA 来自 ATCC。
[0014] (2)按照1:10的比例分5个梯度稀释3种病原体基因片段的重组质粒，分别进行扩 增检测每对引物和探针的特异性、灵敏度、稳定性和扩增效率，建立对应的标准曲线。
[0015] 扩增条件是:95°C预变性30s然后95°C，5s和60°C，35s进行40个循环的扩增。
[0016] (3)在上述PCR扩增体系中，分别加入解脲支原体、大肠杆菌、金葡菌、肺炎克雷伯 杆菌的核酸DNA为模板，同时加入灭菌水、生理盐水抽提物和阳性质控品作为阴性和阳性对 照模板，采用同样的条件进行扩增反应，检测多重荧光定量PCR的特异性。
[0017] 与现有技术相比，本发明所述的多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原 体和沙眼衣原体的引物、探针及方法，达到了如下效果：
[0018] 本发明的多重荧光定量PCR检测方法，不仅可以快速明确感染的病原体，减少检测 费用，而且解决了临床小儿呼吸道病毒感染病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和 治疗具有重要的指导意义。
【附图说明】
[0019] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020] 图1A-1C为每对引物和探针的的扩增曲线，其中A，B，C代表的病原体分别CT，CP， MP;
[0021] 图2A-2D为MP、CP、CT阳性样本扩增和阳性对照扩增情况，其中，VIC代表MP扩增， ROX代表CP扩增，FAM代表CT扩增，CY5代表阳性对照扩增。
【具体实施方式】
[0022] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应 可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名 称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通 篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为一开放式用语，故应解释成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述 技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述 描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围 当视所附权利要求所界定者为准。
[0023]以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
[0024]实施例1、设计合成引物和探针序列
[0025] 根据NCBI数据库中收录的沙眼衣原体(HE603232.1)、肺炎衣原体(CP001714.1)和 肺炎支原体(CP010547.1)的核酸序列，采用PRIMER5.0分别设计合成3种病原体的引物和探 针序列，阳性对照引物和探针序列参考其他文献，具体信息如表1所示。
[0026]表1种病原体和内标的引物和探针序列
[0028]实施例2、单个PCR扩增体系的优化检测：
[0029] 采用沙眼衣原体(VR-879D)、肺炎衣原体(VR-1360D)和肺炎支原体（15531D)的核 酸DNA为模板，根据合成的引物序列分别扩增获得沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体的 基因片段，然后克隆入T载体中，转化DH5a菌株进行扩增培养，抽提重组质粒，测序确认病原 体序列。沙眼衣原体(VR-879D)、肺炎衣原体(VR-1360D)和肺炎支原体（15531D)的核酸DNA 来自ATCC 〇
[0030] 按照1:10的比例分5个梯度稀释3种病原体基因片段的重组质粒，分别进行扩增检 测每对引物和探针的特异性、灵敏度、稳定性和扩增效率，建立对应的标准曲线。
[0031] 每对引物和探针的扩增体系表2,扩增条件是：95°C预变性30s然后95°C，5s和60 °C，35s进行40个循环的扩增，每对引物和探针的的扩增曲线如图IA，IB，IC所示，扩增效率 分别达到112.8%，116.9%和 109.2%。
[0032]在上述PCR扩增体系中，分别加入解脲支原体、大肠杆菌、金葡菌、肺炎克雷伯杆菌 的核酸DNA为模板，同时加入灭菌水、生理盐水抽提物和阳性质控品作为阴性和阳性对照模 板，采用同样的条件进行扩增反应，检测多重荧光定量PCR的特异性，结果显示本实施例中 的引物和探针序列与其他病原体均不存在交叉反应，具有较强的特异性。
[0033] 表2对引物和探针的单个PCR扩增体系
[0036] 实施例3、多重PCR扩增体系的优化检测
[0037] 根据单个PCR的扩增体系，采用多重荧光定量PCR同时进行3种病原体和阳性对照 的扩增反应，根据扩增结果不断调整反应体系中3种病原体的引物和探针的加入量以及阳 性对照引物和探针的加入量，检测多重反应的扩增效率和稳定性，最后确认多重PCR扩增体 系中每对引物和探针的加入量如表3所示。扩增条件是95°C预变性30s然后95°C，5s和60°C， 35s进行40个循环的扩增。
[0038] 表3对引物和探针的多个PCR扩增体系
[0040] 实施例4、多重PCR检测临床咽拭子样本：
[0041] 收集临床疑似呼吸道感染患儿的咽拭子样本151例，采用口腔拭子基因组DNA提取 试剂盒(天根生物)提取样本中的核酸序列，以其为模板，进行多重荧光定量PCR扩增，检测 咽拭子样本中是否有沙眼衣原体、肺炎衣原体和肺炎支原体的基因片段。多重荧光定量PCR 的检测结果显示，在151例咽拭子样本中分别检测出MP、CP和CT阳性样本36例、27例和4例， 检出率分别为23.8%、17.8 %和2.65 %，同时检测出MP和CP双阳性样本5例，检出率为 3.9 %，具体数据和扩增图分别见表4和图2A-2D。
[0042]表4.实时荧光定量PCR方法同时进行三种病原体检测的结果
[0044]实施例5、多重荧光定量PCR在呼吸道感染中的应用评价：
[0045]根据收集样本的临床资料，151例样本中有128例样本同时进行了血清学的MP-IgM 和CP-IgM检测，因此选择128例样本的荧光定量PCR检测结果与对应的血清学检测结果相比 较。
[0046] 结果如表5所示：128例样本中MP-PCR的阳性检出率为27.3% ,MP-IgM的阳性检出 率为22.65% ;CP-PCR的阳性检出率为17.97% ,CP-IgM的阳性检出率为14.06%。128例血清 学检测样本中有51例样本进行了针对支原体感染的冷凝集试验检测，其中有10例样本的检 测效价>1:32,冷凝集试验的阳性检出率为19.6%，具体的病原体扩增和统计结果分别见图 2和表5。
[0047]结果表明，多重实时荧光定量PCR方法作为高通量、特异性强的检测方法，可以作 为呼吸道感染早期诊断的一个重要手段，与血清学等检测方法结合起来，提高病原体的检 出率，为临床合理有效的治疗提供诊断依据。
[0048] 表5.实时荧光定量PCR方法和MP-IgM/CP-IgM的检测结果比较
[0050] SEQUENCE LISTING <no>湖州市中心医院 <120>多重荧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣
[0051] 原体的引物和探针 <130> 201') <160> 3 < 170> PatentIn version 3 5 <210> 1 <211> 106 <2\2> DNA <2丨3:>沙眼衣原体 <400> 1 ctggatttat cggaaacctt gataaaggct atttctcttg accacagcga atctttgttt 60 aaaatcaagt ctGtagatgt ttt aitg aaagttgttt cagagg 106 <2 i 0> 2 <2il> 130 <212> DNA <213>肺炎衣原体 <400> 2 Cagcatggat aagtttagta ttctegacaa aatcgtcagc gtataatgcc ttagcataet 60 atgaactatt tatcggtctc ccaagcaaga acgaacaact tftactacaa tclattccat 120
[0052] ataaagctgc 130 <2!0> 3 <211> 118 <212> DNA <213>肺炎支原体 <400> 3 cttggaagta tgarggtggc ttagtccaat acatccacca cctcaacaac gaaaaggaac 60 ctttatttga ggacattatc tttggtgaaa aaaccgatac tgitaaatca gttagccg 118
[0053] 上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种多重巧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物，其特 征在于，所述引物序列为：2. -种多重巧光定量PCR同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体的探针，其特 征在于，所述探针序列为：
【文档编号】C12N15/11GK106086198SQ201610521166
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】戴利成, 李静, 李海华
【申请人】湖州市中心医院