一种用于dgge分析混合中药粉末组成物种的引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于DNA条形码结合DGGE分析方法鉴定中药混合物物种组成的引物。所述引物的正向引物为GCITS2_2F(5`?CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT?3`)；反向引物为：ITS2_3R(5`?GACGCTTCTCCAGACTACAAT?3`)。该引物能有效针对性地引导植物中药粉末混合物中物种DNA的PCR扩增。本发明的引物是根据高等植物的核基因片段ITS2的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物可扩增出长度为540bp左右的特异性目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可提供样品混合粉末组成的物种信息。
【专利说明】
一种用于DGGE分析混合中药粉末组成物种的引物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于DNA条形码结合DGGE技术分析中药混合物物种组成的引物。
【背景技术】
[0002] DGGE技术是一种基因突变检测手段，系通过变性梯度凝胶电泳来分离鉴别基因突 变，理想的实验条件可以鉴别出DNA片段中单个碱基突变。DGGE的技术原理是基于在变性梯 度凝胶中DNA的解链行为差异导致DNA的迀移速度差异，从而达到分离野生型与突变型DNA 片段的目的。利用微生物通用的16S rRNA作为标记物，DGGE技术常被用于检测微环境生物 样品中的微生物多样性，分离结果以凝胶上的电泳条带呈现，非常直观，可以达到初步的定 性和定量目的。DGGE分析被广泛地应用于土壤、沿海环礁湖表层沉积物、牛奶、人类口腔、肠 道(或肠容物)等微环境中的微生物多样性分析中。而DGGE技术中，样品的基因组DNA的PCR 成功扩增是重要的环节，而对于引物的设计更关键的一步。目前尚未有将DGGE技术应用于 中药粉末混合物鉴定的报道，也未有关于中药粉末混合物DGGE分析的合适标记物。
【发明内容】
[0003] 本发明公开了一种引物，能有效针对性地引导植物中药粉末混合物中物种DNA的 P C R扩增。所述引物的正向引物为：G C I T S 2 _ 2 F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3');反向引物为： ITS2_3R(5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3')。该引物应用于DGGE技术鉴定中药混合物组成物 种方法中样品基因组DNA的PCR扩增中。本发明的引物是根据高等植物的核基因片段ITS2的 序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物可扩增出长度为540bp左右的特异 性目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可获得清晰度，分离度较高符合要求的分离条带， 提供样品混合粉末组成的物种信息。
【附图说明】
[0004] 图1是实施例1样品的PCR产物电泳图；
[0005] 图2是实施例1样品的DGGE分析结果图；
[0006] 图3是实施例2样品的PCR产物电泳图；
[0007] 图4是实施例2样品的DGGE分析结果图；
[0008] 图5是实施例3样品的PCR产物电泳图；
[0009] 图6是实施例3样品的DGGE分析结果图。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步说明。
[0011] 实施例1:玉屏风散的中药组分物种鉴定分析。
[0012] 1、选取并制备样品
[0013] 以玉屏风散(药物组成:黄芪、防风、白术)为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混 合均匀，作为实验样品。
[0014] 2、基因组DNA的提取(改良CTAB法）
[0015] 称取样品IOOmg，置于2 .OmL离心管中，加入2颗Φ 5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质 仪以6.Om/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入1000 yL CTAB free缓冲 液（IOOmMTris-HCl，20mM EDTA，1 ·4Μ NaCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，l，3000rpm离心 3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800yL CTAB缓冲液（3%CTAB， 1 OOmMTri s-HCI，20mM EDTA，1.4M NaC 1)，充分震荡混匀，65 °C金属浴中孵育3h，期间每隔 IOmin左右颠倒混勾数下。加入600yL氯仿-异戊醇(24:1，v: V)，充分震荡混勾，静置5min，1， 3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20°C预冷的异丙 醇，-20°C放置10min，l，3000rpm离心15min，弃上清。加800yL-20°C预冷的75%乙醇，上下颠 倒混勾数次，1，3000印111离心151]1；[11，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温瞭干51]1；[11，加 入50yL 65°C预热的ddH20,小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基 因组DNA。
[0016] 3、PCR 扩增
[0017] PCR体系：Taq DNA酶预混溶液 12.5yL，引物GCITS2_2F(5'_CGCCCGCC GCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3');反向引物：I TS2_3R(5 '-6厶06(：1'1'(^0^6厶(7^0厶厶1'-3')各1.(^1^，步骤2所得的基因组0嫩2.(^1^，(1(1!12〇补足体积 至25.(^匕反应程序 ：95°(：，2111丨11;95°(：，3〇8,52°(：，2〇8,72°(：，5〇8,35个循环 ；72°(：，511^11。 [0018]用1%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右）出现清晰条带为阳 性。结果如图1所示。
[0019] 4、DGGE 分析
[0020]将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统。分析所用的 凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为6%，变性剂的浓度范围 为40 % -60 %。电泳条件为80V，60 °C下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5yg/mL的 溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于凝胶成像仪中做成像检测。结果如图2所示。
[0021] 6、DNA凝胶回收
[0022]用解剖刀将上述凝胶中每个独立的条带切出来，称重，置于1.5mL离心管中。按所 切出的凝胶重量的3倍体积加入Binding Buffer，55°C孵育5min，期间每隔Imin取出离心管 并颠倒数次。加入5yL Silica Powder Suspension，混勾后55°C孵育5min，期间每隔Imin取 出离心管并颠倒数次。I，3000rpm离心30s，小心弃去上清。加入500yL Washing Buffer，震 荡使沉淀重新混悬，I，3000rpm离心30s，小心弃去上清，重复洗涤一次。快速离心5s，用移液 枪吸走残留液体，室温晾干l〇-15min。加入50yL ddH20,震荡使沉淀重新混悬，室温孵育 5min，I，3000rpm离心30s，吸取上清，即得DNA回收液。
[0023] 7、第二轮PCR扩增
[0024] PCR 体系：2XPower Taq PCR MasterMixl2.5yL，用本发明引物各 1.0yL，DNA 模板 2 · OyL，CldH2O补足体积至25 · OyL。温度程序：94°C，2min; 94°C，30s，52°C，20s，72°C，50s，35 个循环;72°C，5min。
[0025] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(500bp左右）出现清晰条带为阳 性。
[0026] 8、测序和数据分析
[0027] 将上述第二轮的阳性PCR产物送检测序。测序得到的数据经过序列拼接、裁切，得 到ITS2片段约220bp。将该片段提交至基因库(Genbank)与中药材DNA条形码鉴定系统，与公 共数据库中的数据做序列比对，进而得出物种鉴定结果。序列比对结果如表1，物种相似度 为 100%〇
[0028] 表 1
[0030]实施例2:北沙参、人参、三七和桔梗混合中药粉末鉴定 [0031 ] 1选取并制备样品
[0032]以北沙参、人参、三七、桔梗为例，每味药材单独粉碎成细粉，等重混合均匀，作为 实验样品。
[0033] 2、基因组DNA的提取(改良CTAB法）
[0034] 称取样品IOOmg，置于2 .OmL离心管中，加入2颗Φ 5mm的灭菌钢珠，用生物样品均质 仪以6.Om/s震荡30s，重复震荡2次，每次间隔30s。向离心管中加入1000 yL CTAB free缓冲 液（IOOmMTris-HCl，20mM EDTA，1.4M N aCl)，剧烈震荡，旋转混匀5min，l，3000rpm离心 3min，弃上清液；重复该步骤1-2次。向离心管中加入800yL CTAB缓冲液（3%CTAB， I OOmMTri s-HCI，20mM EDTA，1.4M NaC 1)，充分震荡混匀，65 °C金属浴中孵育3h，期间每隔 IOmin左右颠倒混勾数下。加入600yL氯仿-异戊醇(24:1，v: V)，充分震荡混勾，静置5min，1， 3000rpm离心15min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。加入等体积-20°C预冷的异丙 醇，-20°C放置10min，l，3000rpm离心15min，弃上清。加800yL-20°C预冷的75%乙醇，上下颠 倒混勾数次，1，3000印111离心151]1；[11，重复1次。弃尽上清，打开离心管盖子室温瞭干51]1；[11，加 入50yL 65°C预热的ddH20,小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中，即得样品的基 因组DNA。
[0035] 3、第一轮PCR扩增
[0036] PCR体系：Taq DNA酶预混溶液12 · 5yL，引物GCITS2_2F(5 '-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3');反向引物：IT S2_3R(5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3')各1 · OyL，步骤2所得的基因组DNA2 · OyL，ddH2〇补足体积至 25.(^匕反应程序：95。(：，2111丨11;95。(：，3〇8,52。(：，2〇8,72。(：，5〇8,35个循环 ；72。(：，511^11。
[0037] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，目的区域(540bp左右）出现清晰条带为阳 性。结果如图3所示。
[0038] 4、DGGE 分析
[0039] 将上述PCR产物用于DGGE分析，所用仪器为DCode基因突变检测系统。分析所用的 凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺为变性剂，凝胶浓度为6%，变性剂的浓度范围 为40 % -60 %。电泳条件为80V，60 °C下电泳12h。电泳结束后，将凝胶置于400mL 0.5yg/mL的 溴化乙锭溶液中染色25min。取出凝胶，置于凝胶成像仪中做成像检测。结果如图4所示。
[0040] 5、经DNA凝胶回收处理，第二轮PCR扩增，所得阳性PCR产物送检测序，序列比对结 果各物种相似度为100 %。
[0041] 实施例3:丹参、党参、红景天、决明子、罗布麻叶、当归、菊花和玫瑰花8种组份混合 中药粉末的鉴定。
[0042] 参照实施例1的方法，进行样品基因组DNA提取，PCR扩增，DGEE分析，比对。实施例3 样品的PCR产物电泳图如图5所示;DGGE分析结果图如图6所示。所得的序列比对结果为各物 种相似度为100 %。
【主权项】
1.一种用于DGGE技术鉴定混合中药粉末组成物种的引物，所述引物用于样品基因组 D N A的P C R扩增中，其特征在于：所述引物的正向引物为：G C I T S 2 _ 2 F ( 5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3');反向引物： ITS2_3R(5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3')。
【文档编号】C12N15/11GK106086228SQ201610735841
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月26日
【发明人】郑夏生, 陈士林, 成金乐, 赖智填
【申请人】中山市中智药业集团有限公司