一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，包括盒体，在盒体内装有用于装RT?PCR反应液的试剂瓶、用于装RT?PCR酶的试剂瓶、用于装无RNA酶水的试剂瓶、用于装样品裂解液的试剂瓶、用于装阳性对照的试剂瓶、用于装阴性对照的试剂瓶、用于装标准品稀释液的试剂瓶、用于装样品处理液的试剂瓶，盒体内底部装有冰盒，冰盒顶部上设有用于固定安放试剂瓶的凹槽，8个试剂瓶插在凹槽中。本实用新型用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒的测定，测定灵敏度高、选择性强，操作简单，制作成本低，在批量样品的定量检测中具有巨大的应用前景。
【专利说明】
一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型涉及检测试剂盒，具体说是一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002]戊型肝炎(Hepatitis E)是由戊型肝炎病毒病毒(Hepatitis E virus,HEV)临床上以急性肝炎为特征。人感染后表现出从不明显到暴发的不同严重程度，死亡率为I %-4%，孕妇死亡率可达25%。戊型肝炎病毒主要通过粪-口途径、污染的水源以及食用未煮熟的猪肉、野猪肉和鹿肉等制品进行传播。尽管HEV只有一个血清型，但是不同毒株具有高度的遗传多样性。目前普遍认可分类方法是将HEV分为4个基因型，比较认可基因I型和2型主要感染人类，基因3型和4型是人畜共患病病原。由于我国人民饮食结构和饮食习惯的，中国成为世界猪肉消费大国。猪肉是HEV通过食源性途径传播的主要来源，食用来自疫区的猪肉及其产品对公共卫生安全存在潜在风险。尤其值得注意的是，2014年底英国每日邮报报道称在英国超市约四分之一的猪肉检出HEV阳性，这对所有进口国的食品安全和公共卫生造成威胁。
[0003]目前，检测HEV的方法主要有免疫电镜、免疫荧光、血清中和试验、ELISA方法和聚合酶链式反应等。这些方法在各有优缺点，但是都不能满足特定要求。荧光定量PCR技术由于其具有敏感性高、特异性好、高通量、操作简便省时等优点同时可对待检样品进行精确定量，非常适用于大批量样品中病毒感染的检测。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型要解决的问题是，提供一种操作简单、使用方便、可高效用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒。
[0005]为了解决这一问题，本实用新型的方案是:一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，包括盒体，在盒体内装有用于装RT-PCR反应液的试剂瓶、用于装RT-PCR酶的试剂瓶、用于装无RNA酶水的试剂瓶、用于装样品裂解液的试剂瓶、用于装阳性对照的试剂瓶、用于装阴性对照的试剂瓶、用于装标准品稀释液的试剂瓶、用于装样品处理液的试剂瓶，盒体内底部装有冰盒，冰盒顶部上设有用于固定安放试剂瓶的凹槽，8个试剂瓶插在凹槽中。
[0006]所述盒体为硬质塑料盒体，盒盖为无色透明塑料材质。
[0007]所述用于RT-PCR反应液的试剂瓶、用于装RT-PCR反应酶的试剂瓶、用于装无RNA酶水的试剂瓶、用于装阳性对照的试剂瓶、用于装阴性对照的试剂瓶和用于装标准品稀释液的试剂瓶的规格为1.5mL，所述用于装样品裂解液的试剂瓶和用于装样品处理液的试剂瓶的规格为15mL，材料均为聚乙稀。
[0008]所述带凹槽的冰盒为圆柱形的塑料盒，其中填充物为多元丙烯酸多元酸的聚合体制冷剂，冰盒上凹槽与试剂瓶大小一致。
[0009]所述盒盖为透明聚乙烯材质，与盒体通过螺纹相连。
[0010]本实用新型具有的有益效果为:所需的所有试剂都存放在一个试剂盒内，盒内以低温冰盒盛放试剂瓶，保证运输和使用过程中各试剂的稳定性。此外，试剂盒为圆柱形，体积小，易于携带、存放和使用。
【附图说明】
[0011]图1为本实用新型的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒组成示意图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和【具体实施方式】对本实用新型作进一步详细说明:
[0013]如图1所示，本实用新型的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，包括盒体I，在盒体内装有用于装RT-PCR反应液的试剂瓶2、用于装RT-PCR酶的试剂瓶3、用于装无RNA酶水的试剂瓶5、用于装样品裂解液的试剂瓶6、用于装阳性对照的试剂瓶7、用于装阴性对照的试剂瓶8、用于装标准品稀释液的试剂瓶9、用于装样品处理液的试剂瓶10，盒体I内底部装有冰盒4，冰盒4顶部上设有用于固定安放试剂瓶的凹槽，8个试剂瓶插在凹槽中。
[0014]所述盒体I为硬质塑料盒体，盒盖为无色透明塑料材质。
[0015]所述用于RT-PCR反应液的试剂瓶2、用于装RT-PCR反应酶的试剂瓶3、用于装无RNA酶水的试剂瓶5、用于装阳性对照的试剂瓶7、用于装阴性对照的试剂瓶8和用于装标准品稀释液的试剂瓶9的规格为1.5mL，所述用于装样品裂解液的试剂瓶6和用于装样品处理液的试剂瓶1的规格为15mL，材料均为聚乙烯。
[0016]所述带凹槽的冰盒4为圆柱形的塑料盒，其中填充物为多元丙烯酸多元酸的聚合体制冷剂，冰盒上凹槽与试剂瓶大小一致。
[0017]所述盒盖为透明聚乙烯材质11，与盒体通过螺纹相连。
[0018]所述RT-PCR反应液中荧光探针浓度为ΙμΜ，引物浓度为0.4μΜ，dNTP浓度为0.25mM。
[0019]所述酶混合物，包括逆转录酶和PCR酶，两种酶活力单位均为5U/yL。
[0020]所述无RNA酶水为经过DEPC处理的灭菌三蒸水。
[0021 ] 所述阳性对照的浓度为109copies/mL
[0022]所述阴性对照为基因3型HEV阴性样本。
[0023]所述样品处理液中SDS浓度为0.5%，蛋白酶K浓度为5mg/mL。
[0024]所述样品裂解液为Tr izol。
[0025]实验原理:本实用新型通过荧光定量RT-PCR技术对基因3型猪戊型肝炎病毒0RF3上目的基因片段进行实时检测，从而实现猪肉及其产品中基因3型猪戊型肝炎病毒检定性和定量检测目的。荧光定量RT-PCR技术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光结合物质或荧光标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。只要获得未知样品的Ct值，便可通过标准曲线计算出待测样本的初始拷贝数。
[0026]为进一步了解本实用新型的技术内容、特征和作用，兹例举以下实施例，详细说明如下。
[0027]I)制作标准曲线:
[0028]采用发射波长520nm激发波长480nm通道，测定一系列不同浓度的0RF3标准品为模板的荧光定量RT-PCR产物循环阈值，并设立阴性对照；以反应循环数为纵坐标，标准品拷贝数为横坐标，绘制标准曲线；
[0029]上述一系列不同浓度的标准品由权利要求书所述检测猪肉及其产品中基因3型猪戊型肝炎病毒检测试剂盒中的阳性对照梯度稀释而得;上述标准品的浓度依次为102，103，I O4，15，106，107，108copies/mL。
[0030]2)检测待测样品中基因3型猪戊型肝病毒含量:
[0031]待测样品前处理:将待测猪肉样品10mg用样品处理液漩涡震荡混匀55°C孵育30min，取250yL至EP管中，然后向EP管中加750yL样品裂解液。然后依据Trizol法提取样品RNA0
[0032]将步骤I)中所述标准品替换为前处理后的待测样品，按照所述步骤I)所述方法检测的待测样品RNA在发射波长为520nm处的通道，记为CTii，将所述CT测带入所述步骤I)所得标准曲线，得到所检测样品中基因3型猪戊型肝炎病毒的拷贝数。
[0033]利用本实用新型的试剂盒测定猪肉及产品中基因3型组戊型肝炎病毒，具有很好的灵敏度和特异性。本实用新型检测时间仅需90min，并且可以实现高通量检测，适用于大批量样品的检测。本实用新型无需液氮研磨处理样品，避免了实验人员在处理样品过程中冻伤，大大节省样品处理时间。造价低，经济实惠，生产工艺简单，有利于推广使用。
[0034]以上所述的实施例仅用于说明本实用新型的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本实用新型的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本实用新型的专利范围，即凡本实用新型所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本实用新型的专利范围内。
【主权项】
1.一种用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，包括盒体(I)，其特征在于，在盒体内装有用于装RT-PCR反应液的试剂瓶(2)、用于装RT-PCR酶的试剂瓶(3)、用于装无RNA酶水的试剂瓶(5)、用于装样品裂解液的试剂瓶(6)、用于装阳性对照的试剂瓶(7)、用于装阴性对照的试剂瓶(8)、用于装标准品稀释液的试剂瓶(9)、用于装样品处理液的试剂瓶(10)，盒体(I)内底部装有冰盒(4)，冰盒(4)顶部上设有用于固定安放试剂瓶的凹槽，8个试剂瓶插在凹槽中。2.根据权利要求1所述的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述盒体(I)为硬质塑料盒体，盒盖为无色透明塑料材质。3.根据权利要求1所述的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述用于RT-PCR反应液的试剂瓶(2)、用于装RT-PCR反应酶的试剂瓶(3)、用于装无RNA酶水的试剂瓶(5)、用于装阳性对照的试剂瓶(7)、用于装阴性对照的试剂瓶(8)和用于装标准品稀释液的试剂瓶(9)的规格为1.5mL，所述用于装样品裂解液的试剂瓶(6)和用于装样品处理液的试剂瓶(10)的规格为15mL，材料均为聚乙烯。4.根据权利要求1所述的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述带凹槽的冰盒(4)为圆柱形的塑料盒，其中填充物为多元丙烯酸多元酸的聚合体制冷剂，冰盒上凹槽与试剂瓶大小一致。5.根据权利要求3所述的用于猪肉及其产品中基因3型戊型肝炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述盒盖为透明聚乙烯材质(11)，与盒体通过螺纹相连。
【文档编号】C12Q1/70GK205635607SQ201620425652
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】陈小金, 董志珍, 赵祥平, 王建华, 王玉玲, 陈本龙, 王乃福, 刘洋, 赵丹, 张俊哲
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心