专利名称：一种理想的血细胞髓过氧化物酶染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及是用于血细胞髓过氧化物酶(MPO)染色的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
血细胞MPO染色是国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的最重要、最常用的血细胞化学染色方法之一，对急性白血病分型诊断有重要的临床意义。同时血细胞MPO染色对尿液中管型、异常淋巴细胞的鉴别以及遗传性髓过氧化物酶缺陷症的诊断也有一定的临床意义。
血细胞MPO染色方法以Washburn法与Pereira法报道最多，Washburn法染色效果良好，具有定位准确、不会扩散、不易褪色等优点，但缺点是在试剂配方中含有致癌作用的联苯胺成分。Pereira法则试剂安全，但该法有染色时间不易控制，经常因扩散而致假阴性，容易褪色需及时检查并不能回顾性阅片，以及因阳性产物易溶于水不能流水冲洗影响结果观察等缺点，因此Pereira法虽然受到一些学者推荐，而在临床上应用较少。
1997年，国内首次推荐试剂安全、染色效果理想的3-氨基-9-乙基咔唑法以取代Washburn法。但3-氨基-9-乙基咔唑法并没有引起重视，据了解在临床上应用不多，也未见试剂盒可购买。其原因可能是推荐的3-氨基-9-乙基咔唑法中，固定液(由甲醛、丙酮以及pH6.6磷酸盐缓冲液组成)、工作液(由pH5.0～5.2醋酸盐缓冲液、二甲基亚砜、3-氨基-9-乙基咔唑、过氧化氢组成)、Mayer苏木素染液(由苏木素、无水乙醇、硫酸铝钾及黄色氧化汞等组成)所用试剂较多，配制麻烦，工作液临用配制后，需过滤才能使用，比Washburn法与Pereira法要繁琐多(叶应妩，王毓三主编.全国临床检验操作规程.第2版.南京.东南大学出版社，199775.)目前，血细胞MPO染色的试剂盒及临床应用，仍以Washburn法为主(李顺义.急性白血病实验室分型诊断程序[J].中华检验医学杂志，2003，26(9)575～577)，不仅联苯胺试剂污染了环境，也使操作该项目实验工作者的健康受到伤害。另一方面，上述3种方法染色步骤要固定、工作液作用及复染分别进行，染色前要配制新鲜的稀过氧化氢溶液，方法较为麻烦。而稀过氧化氢溶液的浓度与用量对染色的成功与否影响极大，经常因这两方面的不准确性造成染色失败。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种用于血细胞MPO染色的试剂安全、稳定简便而且染色效果理想的试剂盒，为此，本发明还要提供一种该试剂盒的制备方法。
本发明试剂盒的原理是Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液对血细胞有固定与染色作用，陈旧的并且与空气有经常接触过的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液还有过氧化氢样作用。粒细胞和单核细胞中的髓过氧化物酶分解Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液中的过氧化氢样的物质，产生新生态的氧，后者与底物3-氨基-9-乙基咔唑作用产生黄棕色的复合物而定于胞浆中。
为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案(1)工作液每升工作液中由0.5-10.0g3-氨基-9-乙基咔唑和1000mlWright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液组成。
(2)缓冲液浓度为0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸盐缓冲液。
所述的工作液中的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液的制备方法为3种染液均按常规方法进行配制，但配制之后应与空气有经常接触过，染液越陈旧过氧化氢样作用越强，MPO染色效果越好。判断上述3种染液是否达到MPO染色要求的标准为成熟粒细胞MPO反应应为强阳性。若不符合则应继续放置一段时间待观察。
所述的工作液的制备方法为取符合MPO染色要求标准的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液1000ml加入0.5-10.0g 3-氨基-9-乙基咔唑后，颠倒混匀3-5min即可。
本发明所能达到的有益效果是固定、显色及复染一步操作完成，使用时无需配制新鲜的稀过氧化氢溶液。试剂安全简单、配制方便，染色效果具有定位准确、不会扩散、不易褪色、各类细胞容易鉴别等优点。与Washburn法相比试剂安全，与Pereira法相比染色效果理想，与3-氨基-9-乙基咔唑法相比试剂简单、配制方便、操作容易，是一种非常理想的血细胞MPO染色方法。
具体实施例方式
1、一种理想的血细胞MPO染色试剂盒，由以下物质组成
工作液(由3-氨基-9-乙基咔唑和Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液组成) 1瓶缓冲液(浓度为0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸盐缓冲液) 1瓶2、本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现(1)Wright染液、Wright-Giemsa染液、Giemsa染液的制备方法3种染液均按常规方法进行配制，但配制之后应与空气有经常接触过，染液越陈旧过氧化氢样作用越强，MPO染色效果越好。试剂安装前，应进行预试验，观察染液是否达到MPO染色标准要求成熟粒细胞MPO反应应为强阳性，若符合即可安装；若不符合则应继续放置一段时间待观察。
(2)工作液的制备方法取符合MPO染色标准要求的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液1000ml加入3.0g3-氨基-9-乙基咔唑后，颠倒混匀3-5min即可安装。
(3)缓冲液浓度为0.067mol/L、pH＝5.5磷酸盐缓冲液，常规方法进行配制。
3、染色步骤在干燥新鲜骨髓涂片或外周血涂片上滴加工作液5-10滴，盖满血膜，约30s后，滴加缓冲液10-20滴，与工作液混和，在室温下作用5-10min后，流水冲洗2-3min，滤纸吸干或待干，镜检。
4、结果判断本法血细胞MPO反应阴性细胞着色与染色时间有关，染色时间较短时胞核呈浅蓝色，较长时胞核相近于常规血细胞Wright染色或Wright-Giemsa染色或Giemsa染色，细胞浆多呈蓝色，各类细胞容易鉴别。血细胞MPO反应阳性产物为黄棕色或棕黑色的颗粒或沉淀，定于细胞浆内，有时盖在核上。各类血细胞MPO反应情况与Washburn法、Pereira法相同分化差的原粒细胞为阴性，分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性；而且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强，但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性。嗜酸性粒细胞呈强阳性，嗜碱性粒细胞则为阴性。单核细胞系统为阴性或阳性。淋巴细胞系统、红细胞系统以及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞呈阴性反应，有的吞噬细胞呈阳性反应。
权利要求
1.一种理想的血细胞髓过氧化物酶染色试剂盒，其特征在于，它由下列试剂组成(1)工作液每升工作液中由0.5-10.0g 3-氨基-9-乙基咔唑和1000mlWright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液组成。(2)缓冲液浓度为0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的血细胞髓过氧化物酶染色的试剂盒，其特征在于，工作液的制备方法可以在临用时，取5ml Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液加入2.5-50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，颠倒混匀3-5min后，备用。此时，血细胞髓过氧化物酶染色的试剂盒试剂组成为(1)Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液；(2)3-氨基-9-乙基咔唑；(3)浓度为0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸盐缓冲液。
全文摘要
一种理想的血细胞髓过氧化物酶(MPO)染色试剂盒，是用于血细胞MPO染色检测使用的。只有工作液和缓冲液组成，工作液是选择一种对血细胞有固定、染色，并具有过氧化氢样作用的染液为溶剂，与底物制备而成。固定、显色及复染一步操作完成，使用时无需配制新鲜的稀过氧化氢溶液。试剂安全简单、配制方便，染色效果具有定位准确、不会扩散、不易褪色、各类细胞容易鉴别等优点。
文档编号C09B69/00GK1811370SQ200510137889
公开日2006年8月2日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者潘智勇, 潭映霞 申请人:温州医学院