专利名称：：溴代苯并噻唑类发光试剂及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种发光试剂，特别是指一种具有溴代苯并噻唑结构的鲁米诺衍生物的制备方法。技术背景化学发光分析不使用光源，可避免光谱法中普遍存在的杂散光干扰。常用的化学发光体系的发光过程仅在数秒(甚至更短)时间内完成，加之发光微弱和机理复杂，客观上要求严格控制操作条件，因此极大地影响了化学发光法在实际工作中的应用。然而，随着发光检测技术的改善和电脑技术的飞速发展，进样和试剂混合全由微处理机控制以及反应系统全部自动化的化学发光分析仪器的问世，使化学分析法在分析速度、灵敏度和准确度方面显著提高，在环境、临床、药物、免疫和生物等相关领域发挥着越来越重要的作用(ZhangYim,GregoryJ.Phillips,andEdwardS.Yeung.AnalyticalChemistry,2007，79(14):5373;D.WhitneyKing,WilliamJ.Cooper,StevenA.Rusak,BarrieM.Peake，JamesJ.Kiddle,DanielW.O'Sullivan，MeganL.Melamed，ChrisR.Morgan,andStephenM.Theberge.AnalyticalChemistry,2007,79(11):4169)。化学发光体系的发光强度即反应灵敏度决定于跃迁时量子产率的高低，寻找新的更高效的发光试剂倍受分析工作者关注。尽管近年来许多有机化合物，如吖啶酯类、二氧环乙垸类和洛粉碱类也被合成与应用于化学发光分析(林旭聪，.郭良洽，谢增鸿，世界科技研究与发展，2004,26(4):136;雷春华，李承志应用化工，2005，34(11):680)，但鲁米诺仍被普遍采用。由于鲁米诺化学发光体系发光强度不够高，且易受反应介质酸度等因素的影响，不能满足现代生物和环境分析中超痕量组分的准确检测。为了进一步改善鲁米诺试剂的发光性能，人们相继开发出多种鲁米诺衍生物，大部分新试剂在化学发光强度方面获得不同程度的改进(StefanB，TomaszK.AnalyticaChimicaActa,2007,585(1):147;ManabuN，TakaeH，KiyoshiZaitsu.JournalofPhotochemistryandPhotobiologyA:Chemistry,2007，186(1):99;Jong-WooCheon,Chil画WonLee，Myoung-SeonGong.NeriGeum，DyesandPigments,2004,61:23;Chil-WonLee,Sang-WooJoo,OhyoungKim，JaejungKo,Myoung-SeonGong.DyesandPigments,2002，52:37;高文达，理化检验-化学分册，2004，40(4):226;匡永清，孙晓莉，何炜，尉琳，第四军医大学学报，2002，23(11):1037;JunichiIshida,MakiTakada，TomohiroYakabe,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1》1;HideyukiYoshida,KiyoshiUreshino,JunichiIshida,HitoshiNohta,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1999，41:177;HideyukiYoshida,RyujiNakao，HitoshiNohta，MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,2000，47:239)。其中，日本福冈大学MasatoshiYamaguchi教授合成的含有苯并噻唑结构的鲁米诺衍生物化学发光强度达到鲁米诺化学发光体系的数十倍(JunichiIshida，MakiTakada,TomohiroYakabe,MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1):1)。基于我们长期对溴原子特殊的电子效应对有机化合物的光谱性能影响规律的深入研究(LiZaijun，PanJiaomai,TangJan.TheAnalyst,2001,136(7):1154;LiZaijun，ChenYepu，PanJiaomai,TangJian.AnalyticalLetters,2002,35(13):2157;LiZaij叫ZhuZhenzhong,ChenYepu，HsuChunggin，PanJiaomai.Talanta,1999,48(3):511)，希望将溴原子引入苯并噻唑结构中开发出发光性能更为优异的新型发光试剂。
发明内容本发明的目的在于合成一类具有苯并噻唑结构的鲁米诺衍生物，该材料发光性能优质、稳定性好、使用寿命长。本发明的另一目的在于提供一种制备含有溴代苯并噻唑结构的鲁米诺衍生物的方法，该方法简单实用，可操作性强。本发明提供的具有溴代苯并噻唑结构的五种新型发光试剂，通过发光性能检测，其发光强度为鲁米诺的数十倍，甚至达230倍左右。本发明提供的制备上述材料的方法为-a、硝化，300~400mL浓硫酸和60~80mL发烟硝酸加入到反应瓶中，置于冰浴中冷却到01(TC;在剧烈搅拌下加入5060g邻苯二甲酰亚胺，控制体系温度不高于15'C;反应45小时，停止搅拌并撤去冰浴，室温下静置过夜；次日，将反应物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黄色悬浊物，用布氏漏斗抽滤，将滤出物再洗涤抽滤35次，用95%乙醇重结晶，过滤，然后在508(TC下千燥得到淡黄色固体4-硝基邻苯二甲酰亚胺淡黄色固体；b、还原，150~200gSnCl2溶于150~300mL浓盐酸中，再加6080mL水，恒温在5060°C;分批加入3050g4-硝基邻苯二甲酰亚胺，体系温度不断上升，大约反应继续进行20~50分钟时，温度开始下降；继续加热两小时，室温下放置过夜，次日过滤，用大量去离子水洗涤沉淀，用吡啶重结晶，烘干得到产品4-胺基邻苯二甲酰亚胺；c、巯基化，15~20g的4-胺基邻苯二甲酰亚胺和1520g的硫氰酸钠溶于200300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷却至05'C;另将1518mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中；当烧瓶中溶液温度达到05'C时，开始逐滴滴加溴的甲醇溶液；滴加完后，继续在零度下搅拌两小时，然后室温反应810小时；用布氏漏斗抽率得黄色沉淀，真空干燥得产品4-胺基-6-巯基邻苯二甲酰亚胺；加入巯基时所采用的试剂为硫氰化钠；反应温度05'C，并且在含液溴的甲醇溶液中搅拌进行；d、酰肼化，由4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰亚胺制备4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼(简称AMHP);反应恒温在6070'C进行，加入的试剂为85%水合肼；反应结束后，减压蒸馏得到粗产品，再用无水乙醇重结晶，得中间产物4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼。e、合成，将AMHP分别与4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羟基苯甲醛、3,5-二溴-2-羟基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3,4,5-三溴苯甲醛縮合，得到终产物4-(4-溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼和4-(3,4,5-三溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼(简称p-B-AMHP、DB-;-H-AMHP、DB-o-H-AMHP、DB-p-MO-AMHP和TB-AMHP);反应时，分别将AMHP和4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羟基苯甲醛、3，5-二溴-2-羟基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛及3,4，5-三溴苯甲醛溶于N,N-二甲基甲酰胺，反应恒温在506(TC进行；溴代苯并噻唑类发光试剂的结构通式如下，其中Ar代表不同结构的芳基，上述a、b、c、d、e反应的路线如下:本发明与现有技术相比具有的优点是1.本发明所采用的原料易得，且产率高在2-溴代芳烃苯并噻唑类试剂的合成中，AMHP的制备最为关键。工作之初，我们参照文献(JunichiIshida,MakiTakada,TomohiroYakabe，MasatoshiYamaguchi.DyesandPigments,1995,27(1):1)相似的方法操作，结果不仅产率低，而且经常导致AMHP及2-溴代芳烃苯并噻唑类试剂合成失败。经过对合成路线的仔细分析和大量实践，我们发现问题主要存在于巯基化步骤。由于NaSCN/B^巯基化工艺中所使用液溴具有很强的氧化性，它既可破坏巯基，还能分解最终产物。为了克服以上问题，一方面我们严格控制巯基化反应的温度在o。c左右，尽量减少溴对中间产物中巯基的氧化，另一方面AMHP粗产品采用无水甲醇反复洗涤，直到流出液没有颜色为止，以确AMHP中残留溴去除完全。如此，AMHP的总产率达50%，明显高于文献值。在此基础上，合成的五种溴代苯并噻唑类发光试剂的意产率分别为DB-p-H-AMHP:47°/。，DB-p-MO-AMHP:50%,TB-AMHP:42%,/-B画AMHP:50%和DB-o-H-AMHP:47%。2.产品性能稳定试剂可在室温下贮藏半年后，其发光性能基本不变。3.发光性能好通过对五种溴代芳烃苯并噻唑类化学发光反应动力学研究发现发光强度迅速上升到最大值，然后很快下降至基线。然而，试剂的发光动力学曲线与试剂的初始浓度有关。通常，试剂浓度越大发光强度上升或下降所需要的时间越长，反之就越短(这是因为试剂浓度大化学反应完成需要更多的时间)。当试剂浓度为lxlO-slxlO"mol/L时，化学发光反应在0.51.0min内进行完全，发光强度达到最大值，发光强度的衰减比较缓慢；当试剂浓度为lxlO—7mol/L时，化学发光反应在l3s内进行完全，发光强度的衰减迅速，化学发光反应动力学曲线呈现尖峰状。由于在实际分析应用时，发光试剂的浓度是非常低的，优异的发光动力学特征不仅可提高化学发光分析方法的灵敏度，而且还能增加样品分析频次，这些对生化反应机理探讨和实时分析都是至关重要的。对五种试剂发光试剂的化学发光强度进行测定，结果列于表1。从表1中可以看出五种新试剂的发光强度明显高于传统发光试剂一鲁米诺，其中DB-p-H-AMHP化学发光强度是传统试剂鲁米诺的230倍，具有很好的分析应用前景。另一方面，实践进一步证实在苯并噻唑类试剂中同时引入多个供电子基团或多种供电子基团组合可获得性能更为优异的发光试剂。具体实施方式1.发光试剂的制备(1)350mL浓硫酸和60mL发烟硝酸加入到反应瓶中，置于冰浴中冷却到l(TC左右。在剧烈搅拌下加入50g邻苯二甲酰亚胺，控制体系温度不高于15°C。反应4小时，停止搅拌并撤去冰浴，室温下静置过夜。次日，将反应物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黄色悬浊物，用布氏漏斗抽滤，将滤出物再洗涤抽滤四次，用95%乙醇重结晶，得到淡黄色固体4-硝基邻苯二甲酰亚胺。(2)173gSnCl2溶于175mL浓盐酸中，再加66mL水，恒温在5060。C。分批加入30g4-硝基邻苯二甲酰亚胺，体系温度不断上升，大约反应继续进行20分钟时，温度开始下降。继续加热两小时，室温下放置过夜，次日过滤，用大量去离子水洗涤沉淀，用吡啶重结晶，烘干得到产品4-胺基邻苯二甲酰亚胺。(3)19.5g的4-胺基邻苯二甲酰亚胺和18.34g的硫氰酸钠溶于300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷却至0X:。另将15.5mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中。当烧瓶中溶液温度达到0"C时，开始逐滴滴加溴的甲醇溶液。滴加完后，继续在零度下搅拌两小时，然后室温反应8小时。用布氏漏斗抽滤得黄色沉淀，真空干燥得产品4-胺基-6-巯基邻苯二甲酰亚胺。(4)12g4-胺基-6-巯基邻苯二甲酰亚胺悬浮于200mL的乙醇溶液中，搅拌并恒温至6(TC。将45mL水合肼逐渐向悬浊液中滴加，滴加两小时，然后回流48小时。反应结束，减压蒸馏乙醇一水溶剂，无水乙醇重结晶，得鲜红的粉末状产品AMHP。(5)将4.2gAMHP溶于40mL的N,N-二甲基甲酰胺，称取与AMHP等摩尔的3，5-二溴-4-羟基苯甲醛溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，在搅拌下加入三口烧瓶，恒温至52。C，滴加溶有1.5g亚磷酸氢钠的浓度为1.5mol/L的稀硫酸溶液50mL。继续搅拌2小时，然后室温搅拌3小时。0'C冷却，过滤沉淀，无水乙醇重结晶产品。避光环境下自然挥发溶剂乙醇，得淡黄色固体粉末DB，H陽AMHP。其它四种溴代苯并噻唑类发光试剂的制备按上述操作进行，仅在反应步骤(5)中用不同的芳醛替代3,5-二溴-4-羟基苯甲醛(4-溴苯甲醛、3，5-二溴-2-羟基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3,4,5-三溴苯甲醛)，即可得到4-(4-溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼和4-(3，4,5-三溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼(简称p画B-AMHP、DB-o-H誦AMHP、DB卞誦MO-AMHP和TB陽AMHP)。五种发光试剂的结构和纯度均被红外、紫外、核磁、电喷雾质谱和元素分析结果所证实。2.化学发光强度的测定在毛细管电泳电化学发光监测仪上，以1.0xl(T7mOl/L的各种发光试剂溶液为流动相(管内径为l.Omm)，加入50nL铁氰化钾或过氧化氢溶液(釆用注射阀进样)，记录化学发光强度。表l:不同溴代苯并噻唑类发光试剂化学发光强度的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1.一种溴代苯并噻唑类发光试剂，其特征是溴代苯并噻唑类发光试剂的结构通式如下，其中Ar代表不同结构的芳基，2、如权利要求1所述溴代苯并噻唑类发光试剂，其特征是该发光试剂包括4-(4-溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3，5-二溴-4-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3，5-二溴-2-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼和4-(3,4，5-三溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼。3、一种溴代苯并噻唑类发光试剂的制备方法，其特征在于，a、硝化，300400mL浓硫酸和60~80mL发烟硝酸加入到反应瓶中，置于冰浴中冷却到01(TC;在剧烈搅拌下加入5060g邻苯二甲酰亚胺，控制体系温度不高于15t:;反应45小时，停止搅拌并撤去冰浴，室温下静置过夜；次日，将反应物慢慢倒入冰水混合物中，形成大量黄色悬浊物，用布氏漏斗抽滤，将滤出物再洗涤抽滤35次，用95%乙醇重结晶，过滤，然后在5080。C下干燥得到淡黄色固体4-硝基邻苯二甲酰亚胺淡黄色固体；b、还原，150200gSnCl2溶于150~300mL浓盐酸中，再加6080mL水，恒温在5060°C;分批加入30~50g4-硝基邻苯二甲酰亚胺，体系温度不断上升，大约反应继续进行20~50分钟时，温度开始下降；继续加热两小时，室温下放置过夜，次日过滤，用大量去离子水洗涤沉淀，用吡啶重结晶，烘干得到产品4-胺基邻苯二甲酰亚胺；c、巯基化，15~20g的4-胺基邻苯二甲酰亚胺和1520g的硫氰酸钠溶于200~300mL的甲醇溶液中，冰浴中冷却至05"C;另将1518mL液溴溶于150mL的甲醇置于滴液漏斗中；当烧瓶中溶液温度达到05'C时，开始逐滴滴加溴的甲醇溶液；滴加完后，继续在零度下搅拌两小时，然后室温反应810小时；用布氏漏斗抽率得黄色沉淀，真空干燥得产品4-胺基-6-巯基邻苯二甲酰亚胺；加入巯基时所采用的试剂为硫氰化钠；反应温度05'C，并且在含液溴的甲醇溶液中搅拌进行；d、酰肼化，由4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰亚胺制备4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼AMHP;反应恒温在607(TC进行，加入的试剂为85%水合肼；反应结束后，减压蒸馏得到粗产品，再用无水乙醇重结晶，得中间产物4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼；e、合成，将4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼分别与4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羟基苯甲醛、3，5-二溴-2-羟基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3，4，5-三溴苯甲醛縮合，得到终产物4-(4-溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-4-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3,5-二溴-2-羟基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼、4-(3，5-二溴-4-甲氧基苯)苯并噻唑邻二甲酰肼和4-(3，4，5-三溴苯)苯并噻唑邻二甲酰肼；反应时，分别将4-胺基-5-巯基邻苯二甲酰肼和4-溴苯甲醛、3,5-二溴-4-羟基苯甲醛、3,5-二溴-2-羟基苯甲醛、3,5-二溴-4-甲氧基苯甲醛及3,4，5-三溴苯甲醛溶于N，N-二甲基甲酰胺，反应恒温在506(TC进行。全文摘要本发明属于有机合成的范畴，具体为具有溴代苯并噻唑结构的发光试剂及制备方法。以邻苯二甲酰亚胺为原料，经硝化(HNO<sub>3</sub>/H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)、还原(SnCl<sub>2</sub>)、巯基化(NaSCN/Br<sub>2</sub>)和酰肼化反应(NH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>/CH<sub>3</sub>CH<sub>2</sub>OH)合成4-胺基-6-巯基苯二甲酰肼(AMHP)。AMHP分别与4-溴苯甲醛、3，5-二溴-4-羟基苯甲醛、3，5-二溴-2-羟基苯甲醛、3，5-二溴-4-甲氧基苯甲醛和3，4，5-三溴苯甲醛反应制备不同的2-溴代苯并噻唑类发光试剂(依次简称为p-Br-AMHP，DB-p-H-AMHP，DB-o-H-AMHP，DB-p-MO-AMHP和TB-AMHP)。通过对试剂光谱行为研究表明，苯并噻唑类发光试剂的化学发光性能明显高于传统发光试剂—鲁米诺，尤其是DB-p-H-AMHP发光强度超过鲁米诺的230倍，可广泛应用于食品安全中的免疫化学检测定，大大降低方法的检出限。文档编号C09K11/06GK101240166SQ20081001849公开日2008年8月13日申请日期2008年2月15日优先权日2008年2月15日发明者孙秀兰,李在均,骥胡申请人:江南大学