专利名称：：一种脂溶性茶多酚的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种脂溶性茶多酚的制备方法，特别是，本发明涉及以碳酰化方法来制备脂溶性茶多酚。技术背景目前常用的脂溶性抗氧化剂主要有BHA(丁基羟基茴香醚)、朋T(二丁基羟基甲苯)、PG(没食子酸丙酯)及TBHQ(叔丁基对苯二酚)、维生素E、维生素C棕榈酸脂、迷迭香提取物等。其中BHA、BHT、PG、TBHQ都为化学合成抗氧化剂，且以TBHQ抗氧化效果最好，化学合成抗氧化剂具有一定毒性。在天然抗氧化剂中以迷迭香提取物效果较好。有资料报道，在日本，TBHQ己不允许应f于油脂类抗氧化剂中，而都用迷迭香提取物。但迷迭香提取物价格昂贵，在国内不易推广使用。因此现有的抗氧化剂已不能完全满足我国日益增长的油脂、食品工业发展的需要。茶多酚作为一种天然保健食品已普遍被人们认识，由于其特异的抗氧化和抗脂质过氧化性能而具有的许多药理功能也有越来越多的报道，但由于茶多酚具多酚羟基，是极性较大的物质，易溶于水，难溶于油中，而限制了其在油脂类产品中的应用和发挥更好的人体生理活性作用。为了增加茶多酚在油脂中的溶解度，有研究者用羧酸脂酶酯化茶多酚，再用0DS层析柱和聚酰胺层析柱分离得到3—酰化(-)-表儿茶素(EC)或(_)-表没食子儿茶素(EGC)，参见专利文献JP6279430和JP91934/93。但该方法是对表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行氧酰化，即在EGCG的3位羟基上进行脂肪酸酯化，得到的产品使EGCG的3位损失一个羟基，此外，制备过程还需要纯化的羧酸脂酶以及纯化的儿茶素单体，两者的制备成本都很高，很难有实际使用价值。也有用化学法对儿茶素进行氧酰化制备脂溶性茶.多酚，以增加儿茶素的脂溶性，扩展其食用途径。按现有技术制备脂溶性茶多酚是以氧酰化方法，其反应机理是一种亲电加成反应，一般以脂肪酰氯作为酰化剂，与儿茶素分子上的酚羟基作用，酚羟基上的氢原子被酰基所取代，而得到具有R-C00R型结构的酯类化合物，为防止反应过程中产生的氯化氢而发生取代羟基的副反应，通常用碱性试剂中和生成的氯化氢，此外，为防止酰氯分解，反应通常在非髙温或室温下进行，按现有技术方法可用混合儿茶素作为原料制备脂溶性茶多鼢，不需用纯化的EGCG以及纯化羧酸脂酶。与羧酸脂酶酯化茶多酚相比，其制备成本可大大降低，也是一种优良的方法。从产品的抗氧化性能考虑，与其它抗氧化剂相比,茶多酚具有较强的抗氧化作用，主要原因是其具有多个酚羟基，能提供更多的氢质子，接受自由基，从而阻断油脂因自动氧化引起的自由基链式反应。儿茶素被氧酰化酯化后，必然损失具有抗氧化活性的酚羟基，使其抗氧化效果相应降低。在羧酸脂酶酯化茶多酚制备的脂溶性茶多酚产品中，因其是酶反应，是定向酯化，仅损失EGCG的3位羟基(被酰化)，而在化学法制备脂溶性茶多酚过程中，因氧酰化脂化反应不是完全定向酯化，其反应产物是一种混合物，会有单酯、双酯甚至多酯产物以及未反应的儿茶素成分，且在儿茶素分子上每多一个酯基就使儿茶素分子损失一个酚羟基，从理论上看，其酯化程度越高，被酯化的酚羟基越多，其产品抗氧化作用降低程度也就越大，且失去的酚羟基又是相对活性较强的。参见文献CatherineA.Rice-Evans，NicholasJ.MillerandGeorgePagangaAntioxidantpropertiesofphenoliccompourmstrendsinpplantscienceApril1997，Vol2，No,4152157。而碳酰化是将引入的脂肪酰基直接与儿茶素芳香核相连，其反应机理与氧酰化不同，它是一种亲核加成反应。在芳核上引入酰基生成芳酮，形成的是碳一碳键，具有R-COR型结构的酮类化合物，反应为碳酰化反应，不损失儿茶素分子中的酚羟基。本发明是按碳酰化方法制备的脂溶性茶多酚，按本发明方法制备的脂溶性茶多酚不仅有脂溶性能，而且能最大限度地减少儿茶素因酯化而引起的抗氧化能力的下降。
发明内容'本发明涉及一种脂溶性茶多酚的制备方法，其发明目的在于以水溶性茶多酚为原料制备脂溶性茶多酚，以扩展茶多酚用途，本发明是以碳酰化方法制备脂溶性茶多酚。更准确地说，本发明制备的产品——脂溶性茶多酚，不损失原料茶多酚的酚羟基，从而使产品在增加脂溶性能的基础上，保持原有的抗氧化性能，本发明产品能溶于油脂及有机溶剂，而不溶于水；其抗氧自由基及抗脂质过氧化性能与茶多酚相近。实现上述发明目的的解决方案是本发明制备脂溶性茶多酚涉及两个反应，即脂肪酰氯的制备和茶多酚的碳酰化。本发明在研究脂肪酰氯制备过程中，针对反应物比例、反应时间、反应温度进行优化。本发明在研究茶多酚碳酰化过程中，针对酰化剂比例、催化剂、反应溶剂比例、反应温度、反应时间等进行优化。本发明优化了脂溶性茶多酚制备工艺条件，并以脂溶性试验、紫外光谱分析、总多酚含量(UV测定)、抗脂质过氧化、抗自由基等评价本发明产品的脂溶性能和抗氧化性能。图1是条件未优化的制备脂肪酰氯紫外图谱(其中250nm左右处为脂肪酰氯；280nm左右处为未反应的亚硫酰氯)；图2是条件优化后制备的脂肪酰氯UV扫描图，其中280nm处已无吸收峰；图3是纯亚硫酰氯UV扫描图(其中280nm处有吸收峰)；图4是碳酰化脂溶性茶多酚和氧酰化脂溶性茶多酚的紫外图谱；图5是碳酰化LTP、氧酰化LTP以及TP的薄层层析对比图；图6是DPPH抑制率比较；图7是98'C下不同时间的抗氧化性能。具伴实施方案l.脂肪酰氯制备以酰化剂、12碳以上脂肪酸为反应物，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为催化剂，在一定温度范围内常压反应。制备12碳以上脂肪酰氯。反应必须完全。反应完成后的反应液中不能含有未反应的酰化剂，利用紫外扫描进行鉴定，具体见图l,其中250nm2fc右处为脂肪酰氯；280nm左右处为未反应的亚硫酰氯。在脂肪酰氯制备中，最佳的反应条件是必须的，否则产物中会有未反应的亚硫酰氯，导致后续制备脂溶性茶多酚反应中反应物脂肪酰氯加量不准确，且最终产物中产生较多副产物。所述反应的酰化剂为羧酸、醋酐、酰氯如五氯化磷、三氯化磷、氧氯化磷、亚硫酰氯，其中最佳酰化剂为亚硫酰氯。所述的反应物比例为脂肪酸酰化剂-l:0.55.0;最佳比例为l:所述的温度在0'C8(TC之间；最佳温度范围为12'C50'C。所述的反复反应是指在指定温度范围内反复逐渐升、降温并搅拌，直至反应$仝.兀王；所述反应时间为320小时；最佳反应时间为5小时8小时.；所述催化剂DMF用量为亚硫酰氯DMF=1.0:0.0070.1(摩尔比)。最佳比例为1.0:0.030.08(摩尔比)。2.脂溶性茶多酚制备在另一反应器中，先在低温下将lewis酸或质子酸与上述反应制得的脂肪酰氯溶于反应溶剂中，使脂肪酰氯与lewis酸或质子酸形成络合物(使反应过程中脂肪酰氯逐渐释放，进行酰化反应)。再逐渐加入固体儿茶素原料(原料加入过快会使反应激烈而溢出)，加完后，反应由较低的起始温度开始，慢慢升温至反应温度，反应持续89小时，反应结束后(反应体系产生大量固体)，加入与反应液等体积的带冰去离子水，静置，使分层，分离后弃去反应溶剂，过滤水与固体的混悬体系，再用适量去离子水洗涤，在滤饼中加入乙酸乙酯和水和盐酸，静置，使分层，弃去水层，浓縮乙酸乙酯层至干，回收溶剂，干燥，即得产品。所述反应的催化剂，可以是各种lewis酸，诸如三溴化铝、三氯化铝、三氯化铁、四氯化锑、五氯化钽、三氟化硼、四氯化钒、四氯化锡、二氯化锌、三氯化锑等和各种质子酸诸如氟化氢、'硫酸、五氧化磷、磷酸等，最佳的催化剂是三氯化铝、三氯化铁和三氟化硼。所述反应中使用的溶剂可以是极性较低的溶剂，其中常用的诸如苯、硝基苯、二硫化碳、四氯化碳、二氯甲烷、二氯乙烷、石油醚等。根据反应物不同选择最佳溶剂作为反应溶剂。本发明中最佳溶剂为硝基苯或苯。所述反应溶剂用量为4100ml/克儿茶素原料，最佳用量为820ml/克儿茶素原料。所述反应起始温度为0'C25'C,其中最佳起始温度为3'C8'C。所述反应温度为25'C100'C，本发明中最佳反应温度为35'C45'C,最佳温度点为38X:40'C。所述反应时间为3小时24小时，最佳反应时间为7小时10小时。所述反应中反应物比例为儿茶素催化剂酰化剂=1:15:15，其中最佳比例为1:23.5:23.5。3.本发明产品与其它几种脂溶性抗氧化剂产品的性能比较1.脂溶性试验将样品置于氯仿中，室温超声振荡10分钟，制备浓度为lmg/ml的样品溶液，在800mn测定样品溶液的透光度。结果表明(见表1),茶多酚脂溶性较低，TBHQ脂溶性最强，碳酰化脂溶性茶多酚的脂溶性能明显优于氧酰化脂溶性茶多酚和迷迭香提取物表h脂溶性性能比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.碳酰化脂溶性茶多酚和氧酰化脂溶性茶多酚的紫外光谱比较统计观察数据表明，在黄酮类化合物中，增加酚羟塞数目会使吸收峰红移参见文献4:CATHERINEA.RICE-EVANS;NICHOLASJ.MILLER,andGEORGEPAGANGA.STRUCTURE—ANTIOXIDANTACTIVITYRELATIONSHIPSOFFLAVONOIDSANDPHENOLICACIDS.FreeRadicalBiology&Medicine,Vol.20，No.7，pp.933-956，1996。由附图4可知，碳酰化脂溶性茶多酚和氧酰化脂溶性茶多酚分别有两个吸收峰，两峰值的所对应的波长分别为，碳酰化279.00nm和229.50nm,氧酰化275.50nm和220.00nm,可见，碳酰化分别比氧酰化红移了3.5nm和9.5nm。3薄层层析分析结果薄层层析条件薄层板高效硅胶板展开剂氯仿、甲醇、水，去上层脂相显色剂1%香草醛盐酸溶液如附图5所示，它是碳酰化LTP、氧酰化LTP以及TP的薄层层析对比图，其中斑点标示1——碳酰化LTP;2——氧酰化LTP;3——TP薄层图中样品3的三个斑点为未酰化的茶多酚的三个主要成分。样品1(碳酰化LTP样品)与样品2(氧酰化LTP样品)中与样品3斑点Rf相等的斑点为未被氧酰化的茶多酚斑点，斑点4(4')、5(5')、6(6')、7(7')是已酰化斑点，且由下至上依次为茶多酚单酰化到多酰化成分。从已酰化和未酰化成分看，碳酰化和氧酰化样品比较，其中氧酰化有较多未被氧酰化成分。4.总多酚含量的比较总多酚含量测定原理邻酚羟基在三乙醇胺水溶液中与亚铁离子生成紫蓝色络合物。该紫蓝色络合物在540nm处有最大吸收峰，其颜色的深浅与茶多酚的含量成正比，UV测定吸收值，并与标准没食子酸乙酯比较，得到茶多酚含量。该测量方法见下述文献叶鹿鸣，脂溶性茶多酚含量测定方法探讨，中国公共卫生2001年第17巻第9期386。表2结果表明，碳酰化脂溶性茶多酚(LTP)总多酚含量明显大于氧酰化脂溶性茶多酚(LTP)，这主要是因为茶多酚的氧酰化过程使部分酚羟基被酯化，因此其总多酚含量显著低于碳酰化脂溶性茶多酚。表2.总多酚含量测定结果(注"去TP"是指除去脂溶性茶多酚中未参与脂化反应的茶多酚成分)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.二苯代苦味肼自由基(DPPH，含量》97X)抑制率的比较自由基是指具有未配对价电子的原子、原子团或分子。因DPPH，是一种具有稳定的未配对电子的化合物，在517mn处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。参见下述两篇文献(l)陈季武，胡斌,赵实等，发光学报，第26巻第5期，2005年10月664—668;(2)李红，张元湖，应用DPPH法测定苹果提取物的抗氧化能力，山东农业大学学报(自然科学版)，第36巻第1期3538。测定条件为DPPH浓度300"mol/L;样品浓度50ppm;测定波长517nm;从附图6可以看出，碳酰化和氧酰化的LTP与TBHQ抑制率相近。氧酰化LTP除去TP后其对DPPH自由基的抑制率显著下降，而碳酰化LTP除去TP后其对DPPH自由基的抑制率无显著下降。且去TP的碳酰化LTP抑制率高于去TP的氧酰化LTP。可能是因为其酯化在苯环的碳上，没有酚羟基损失，因此其抑制能力没有显著降低。6.抗脂质过氧化性能比较参照08/75009.37—1996，测定抗脂质过氧化性能。待测样品有碳酰化LTP、氧酰化LTP、迷迭香提取物(鼠尾草酸含量》60%)、TBHQ和Vc棕榈酸酯。将待测样品溶于无抗氧剂的大豆油中(样品浓度均为lOOppm),在98'C下保存不同时间(小时):1、17.5、24.5、38、59.5、73,5、100,测定每个时间段的POV值。'从附图7可以看出，待测样品在98'C不同时间内的抗氧化性能无明显差异。几种测定的脂溶性抗氧化剂都有较强的抗氧化性能。实施例一称棕榈酸104克(0.4mol)，置250ml三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝管)，再加入36ml(0.49mol)氯化亚砜。在20'C5(TC之间反复升降温度，同时搅拌反应至无气泡产生，约58次左右反复升降温度。反应时间约7小时左右，冷却后加入1.2mlDMFC0.0156mo1)，再逐渐升温至50'C,反应至无HCL气泡(约2小时左右)，冷却后反应液呈透明溶液，且无固体，经UV扫描(400nm200nm),在280nm左右无氯化亚砜吸收峰。取160ml硝基苯置500m'三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝干燥管)边搅拌边依次加入三氯化铝8.05克C0.061mo1)和上述反应制得棕榈酰氯18.88ml(0.061mol)至完全溶解，再在冰浴条件下，逐渐加入儿茶素粉体原料10克(原料加入过快会使反应激烈而溢出)，加完后，反应由5'C开始，逐渐升温至45'C反应温度，升温速率视反应激烈程度而定，持续反应10小时，反应结束后(反应体系成产生大量固体)，加入与反应液等量的带冰去离子水160ml，静置，使分层，分离弃去反应溶剂，过滤水和固体混悬体系，再用适量去离子水洗涤，在滤饼中加入乙酸乙酯500ml、去离子水200ml和盐酸20ml，静置，使分层，弃去水层，乙酸乙酯层再用水洗一次，浓縮乙酸乙酯层至干，回收溶剂，干燥，即得产品。其他装置和注意事项按碳酰化合成反应进行。实施例二称棕榈酸104克(0.4mol)，置250ml三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝管)，再加入38.2mlC0.52mo1)氯化亚砜。在20'C50'C之间反复升降温度，同时搅拌反应至无气泡产生，约58次左右反复升降温度。反应时间约5小时左右，冷却后加入1.6mlDMFC0.021mo1)，再逐渐升温至5(TC,反应至无气泡(约2小时左右)，冷却后反应液呈透明溶液，且无固体，经UV扫描(400nm200nm)在280nm左右无氯化亚砜吸收峰。取180ml硝基苯置500ml三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝干燥管)边搅拌边依次加入三氯化铝9.71克(0.074mol)和上述反应制得棕榈酰氯22.89ml(0.074mol)至完全溶解，再在冰浴条件下，逐渐加入儿茶素粉体原料10克(原料加入过快会使反应激烈而溢出)，加完后，反应由5'C开始，逐渐升温至4ox:反应温度，升温速率视反应激烈程度而定，持续反应10小时，反应结束后(反应体系成产生大量固体)，加入与反应液等量的带冰去离子水，静置，使分层，分离弃去反应溶剂，过滤水和固体混悬体系，再用适量去离子水洗涤，在滤饼中加入乙酸乙酯500ml、去离子水200ml和盐酸20ml，静置，使分层，弃去水层，乙酸乙酯层再用水洗一次，浓缩乙酸乙酯层至干，回收溶剂，干燥，即得产品。实施例三称棕榈酸104克(0.4mol)，置250ml三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝管)，再加入32.3加1(0.44mol)氯化亚砜。在20'C50'C之间反复升降温度，同时搅拌反应至无气泡产生，约S8次左右反复升降温度。反应时间约10小时左右，冷却后加入2.6mlDMFC0.035mo1)，再逐渐升温至50'C，反应至无HCL气泡(约3小时左右)，冷却后反应液呈透明溶液，且无固体，经UV扫描(400nm200nm)在280nm左右无氯化亚砜吸收峰。取200ml硝基苯置500ml三颈瓶中(带搅拌、加料口、冷凝干燥管)边搅拌边依次加入三氯化铝12.9克(0.098mol)和上述反应制得得棕榈酰氯30.3ml(0.098mol)至完全溶解，再在冰浴条件下，逐渐加入儿茶素粉体原料10克(原料加入过快会使反应激烈而溢出)，加完后，反应由5'C开始，逐渐升温至35'C反应温度，升温速率视反应激烈程度而定，持续反应15小时，反应结束后(反应体系成产生大量固体)，加入与反应液等量的带冰去离子水，静置，使分层，分离弃去反应溶剂，过滤水和固体混悬体系，再用适量去离子水洗涤，在滤饼中加入乙酸乙酯500ml、去离子水200ml和盐酸20ml，静置，使分层，弃去水层，乙酸乙酯层再用水洗一次，浓縮乙酸乙酯层至干，回收溶剂，干燥，即得产品。权利要求1、一种脂溶性茶多酚的制备方法，其特征在于，包含如下步骤a、在起始温度下将lewis酸或质子酸催化剂与脂肪酰化剂溶于反应溶剂，形成络合物；b、向步骤a得到的产物中逐渐加入茶多酚，使所述脂肪酰化剂的脂肪酰基直接与所述茶多酚中儿茶素的芳香环进行亲核加成反应，生成芳酮。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述lewis酸选自三溴化铝、三氯化铝、三氯化铁、四氯化锑、五氯化钽、三氟化硼、四氯化钒、四氯化锡、二氯化锌、三氯化锑等和各种质子酸诸如氟化氢、硫酸、五氧化磷或磷酸。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自苯、硝基苯、二硫化碳、四氯化碳、二氯甲烷、二氯乙垸或石油醚。4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂的用量为4~100ml/克儿茶素原料。5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂的用量为820ml/克儿茶素原料。6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亲核加成反应的起始温度为025'C,反应温度为251(MTC，反应时间为324小时。7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述起始温度为38'C，所述反应温度为3545°C,所述反应时间为710小时。8、根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述亲核加成反应的反应物摩尔比为儿茶素催化剂酰化剂=1:15:15。9、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述反应物摩尔比为儿茶素催化剂酰化剂=1:23.5:23.5。10、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪酰化剂为12碳以上脂肪酸与羧酸、醋酐或酰氯反应得到的产物。全文摘要本发明涉及一种脂溶性茶多酚的制备方法，其发明目的在于以水溶性茶多酚为原料制备脂溶性茶多酚，以扩展茶多酚用途，本发明是以碳酰化方法制备脂溶性茶多酚。更准确地说，本发明制备的产品——脂溶性茶多酚，不损失原料茶多酚的酚羟基，从而使产品在增加脂溶性能的基础上，保持原有的抗氧化性能，本发明产品能溶于油脂及有机溶剂，而不溶于水；其抗氧自由基及抗脂质过氧化性能与茶多酚相近。本发明涉及以碳酰化合成工艺对儿茶素类结构进行酯化的制备方法和条件，本发明产品在各种性能方面，明显优于现有技术同类产品。文档编号C09K15/00GK101270108SQ20081003243公开日2008年9月24日申请日期2008年1月9日优先权日2008年1月9日发明者卢聪聪,蔚张,杭晓敏,胡天喜,邵卫樑申请人:上海交大昂立股份有限公司;上海诺德生物实业有限公司