专利名称：含卤素不对称菁类化合物、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及精细化工领域中一类新的化合物，特别是涉及一类含卤素 的不对称菁类化合物、其制备方法以及作为荧光染料的应用。
背景技术：
荧米染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用， 尤其作为分子探针在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面 的研究在全世界备受瞩目。'最早应用于生物分析的荧光染料有新亚甲
兰(NMB)、吖啶橙(AO)、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)、碱性黄7(CPO)
等。但这些染料都各自存在着应用的局限性，主要表现在染料自身的 荧光会造成高的荧光背景，干扰检测；溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有 很大的毒性和致癌性。为满足日新月异的生物分析应用的需求，研究 开发出具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料仍然是荧光分析技术发 展的关键和核心。目前，使用比较多的有罗丹明、荧光素类、BODIPY 类和菁类荧光染料。其中菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系 数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光检测探针、CD和 VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。 其中作为荧光探针在超敏核酸定量检测、基因组学技术、蛋白分析中 应用尤为关注的焦点。
菁类荧光染料从由Williams发现至今已有150年的历史，结构特点 为甲川链两端连接着含N芳香母核。该芳香母核的种类包括噻唑、噻吩、 2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等，按其相同与否可分为对称和不对称两 类。其中，不对称菁染料主要应用于物理结合荧光标示，与核酸的结 合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式取决 于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁染料中最典型的一 类为TOTO及其类似物和衍生物类。TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶 唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的
4多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链两端的染料分子 可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中无荧光，
降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。Jascm等 用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO和YOYO与DNA的双 嵌入作用[J.A. Bordelon， K丄Feierabend， S,A. Siddiqui, L丄.Wright. J. Phys. Chem. B， 2002， 106, 4838-3843]。 Fiirstenberg等利用超快速荧光 转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动力学机理。 [A. Fiirstenberg, M.D. Julliard, T.G. Deligeorgiec, N.I. Gadjev. J. AM. CHEM. SOC., 2006， 128， 7661-7669]此类染料中的有些品种己经商品 化了，如SYTOX Blue, TOTO誦l， POPO誦l， BOBO-l， YO-PRO-1 等。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见光区(4卯 530 nm)、而生物样品在这个区域有很强的吸收和一定强度的荧光发射，造 成强的荧光背景，从而使荧光检测效率大大降低。尽管通过增加共轭 链数可以使染料的吸收和发射波长产生红移达到近红外区(650 1000nm)，如TOTAB、 TOTIN、 TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等 [K.M. Sovenyhazy, J. A. Bordelon， J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003， 31， 2561]，但这类染料一般分子较大，细胞通透性差，合成复杂，步骤多。 或者，即使现有的一些染料其吸收和发射波长处于近红外区，但其与 核酸的结合能力不足，检测灵敏性不够理想。
目前，对结构简单，性能优良的荧光染料需求量仍然很大，因此 研究和开发出低检测线，高灵敏度，长波长，光稳定性好的化合物用
作荧光染料对生物荧光标示技术的发展至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一类结构简单、具备高 灵敏性、长波长、光稳定性好的新的化合物。
本发明的另一目的在于提供一种上述化合物的制备方法。 本发明的再一 目的在于提供上述化合物作为荧光染料的应用。 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案
本发明公开了一种含卤素不对称菁类化合物，其具有如下结构通式I(I )
其中，
m为1 18的整数； n为1或2;
X为C(CH3)2、 O、 S或Se;
R,、 R2为相同或不同的H、 Cw8垸基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5或卤素； Rs为卤素；
R4为Cw8烷基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5、取代或 未取代的苄基；
Rs为H或Cu8垸基; Y'为卤素离子、CKV、 PF6或OTs隱。
当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、 Cw8烷基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5、 COOR5、 N02、 CN或卣素。
本发明还公开了上述化合物的制备方法，所述方法包括 分别制备第一中间体及第二中间体，所述第一中间体为4-甲基喹
啉的季铵盐中间体，第二中间体为2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、 2-甲基苯并硒唑或2， 3, 3-三甲基-3H-吲哚啉的芳香杂环季铵盐中间 体；
将第一或第二中间体中的一个与縮合剂反应，之后再与另一中间 体在三乙胺或吡啶的作用下反应得到所述化合物。
所述縮合剂优选为N，N-二苯甲脒或者丙二醛縮苯胺盐酸盐。
本发明的上述新化合物可以用作荧光染料。
由于采用了以上技术方案，使本发明中的新化合物用作荧光染料时具 备的有益效果在于(1) 本发明的新染料化合物分子通过引入卤素基团，使染料与核酸 的结合能力增强，提高了检测灵敏度。
(2) 本发明的新染料化合物分子中引入的C1、 Br和I反应活性基 团，可进一步与其它功能性小分子结合，从而可预计实现染料对生物 分子的选择性识别。
(3) 本发明的新染料化合物一端引入喹啉杂环，与甲川链相同的 对称苯并噻唑和B引哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加约80nm， 发射波长范围宽，可达650nm 900nm的近红外区，可避免生物自身 的荧光背景干扰。染料摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可 应用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
(4) 本发明的新染料化合物可应用廉价、体积小、性能稳定的红 色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。
(5) 本发明的新染料产品毒副性小，原料易得，结构简单， 一般 通过4到5步反应即可合成目标分子，易产业化。
图1是化合物A、 B和C在乙醇中的光稳定性比照图。横坐标为 光照时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W 碘钨灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。
图2是化合物A在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为 波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫 外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光光度计，型号PTI-700。
图3是化合物B在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为 波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫 外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光光度计，型号PTI-700。
图4是化合物C在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为 波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫 外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光光度计，型号PTI-700。
图5是化合物B在含不同浓度pBR322质粒DNA的PH 7.82,浓 度20mM的Tris-HCl缓冲液中荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合物B的浓度为2pM。箭头表示DNA的浓度 Otg/mL)变化从小到大依次为0， 0.33， 0.67, 1， 1.33， 1.67, 2.33， 3, 3.67， 4.33。所用仪器为荧光分光光度计，型号PTI-700。
图6是化合物M在含不同浓度pBR322质粒DNA的PH 7.82,浓 度20mM的Tris-HCl缓冲液中荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵 坐标为荧光强度。化合物B的浓度为2pM。箭头表示DNA的浓度 (Hg/mL)变化从小到大依次为0， 0.33， 0.67， 1， 1.33, 1.67， 2.33， 3， 3.67， 4.33。所用仪器为荧光分光光度计，型号PTI-700。
图7是相同浓度的化合物B和M在PH 7.82，浓度20mM的 Tris-HCl缓冲液中与等量的pBR322质粒DNA结合后荧光增强的对 比图。化合物B和M的浓度均为2pM。
具体实施例方式
本发明结合现有的各类菁染料的优点，且在其基础上改进，设计 的一类含卤素不对称菁类化合物，其具有下列结构通式(I)，并可用作
荧光染料
<formula>formula see original document page 8</formula>
通式I中，
m为1 18的整数； n为1或2;
X为C(CH3)2、 O、 S或Se;
R2为相同或不同的H、 Cw8烷基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5或卣素； R3为卤素；
R4为Cws烷基、0R5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5、取代或未取代的苄基；
Rs为H或Cw8垸基; Y一为卤素离子、CKV、 PF6-或OTs'。
当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、 Cw8垸基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5、 COOR5、 N02、 CN或卤素。
该含卤素不对称菁类化合物的合成，首先是制备中间体，即取代 或未取代的4-甲基喹啉芳香杂环与卤代化合物反应。所述卤代化合物 为垸基卤代物，其中的垸基可以是直链的或者具有支链的。4-甲基喹啉芳 香杂环与卤代化合物两者的摩尔比为1:1 2,在甲苯中回流12-36小
时，可'制得季铵盐中间体(n):
其次，将制得的4-甲基喹啉的季铵盐中间体与縮合剂縮合可得到 具有通式的化合物(in)。其中縮合剂优选用N,N-二苯甲脒或者丙二醛 縮苯胺盐酸盐。
最后将(ni)与制备(n)同样方法得到的取代或未取代的2-甲基苯
并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2， 3, 3-三甲基-3H』引哚 啉等芳香杂环季铵盐中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应即可得到 这类含卤素不对称菁类化合物。
或者，本发明的含卤素的不对称菁类化合物，也可以采用先合成取代 或未取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、2-甲基苯并硒唑或2，3，
93-三甲基-3H』引哚啉等芳香杂环季铵盐中间体，然后将该中间体与縮 合剂反应，之后再与4-甲基喹啉的季铵盐中间体在三乙胺或吡啶的作 用下反应得到。
本发明含卤素不对称菁类化合物至少具备如下特点
(1) 新化合物分子中引入卤素基团，用作荧光染料时，其与核酸的 结合能力增强，提高了检测灵敏度。
(2) 新化合物分子中引入的C1、 Br和I反应活性基团，用作荧光染 料时，可进一步与其它功能性小分子结合，从而可预计实现染料对生 物分子的选择性说别。
(3) 新化合物一端引入喹啉杂环，与甲川链相同的对称苯并噻唑 和吲哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加约80nm，发射波长范 围宽，可达650nm 卯0nm的近红外区，用作荧光染料时，可避免生 物自身的荧光背景干扰，且摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好， 可应用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
(4) 新化合物用作荧光染料时可应用廉价、体积小、性能稳定的 红色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。
'(5)新化合物用作荧光染料，其毒副性小，原料易得，结构简单， 一般通过4到5步反应即可合成目标分子，易产业化。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。 实施例l
新化合物中间体l-乙基-4-甲基喹啉季铵盐的合成 将20mmo1 4-甲基喹啉和40mmo1碘乙烷加入到100ml含20ml甲 苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应24h后停止，加 热以反应体系开始回流为标准，温度约为110度q混合物冷却后过滤沉 淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到淡黄色的固体粉末，粗收率85%。 实施例2
化合物A的制备将10mmo1 l-乙基-4-甲基喹啉季铵盐与30mmolN, N，-二苯基甲脒 在50ml醋酐中，于100。C油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的黄褐 色油状物倒入乙醚中析出黄色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通 过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷:甲醇=100:3，收集黄色组分，收率 41。/。。向其中加入l-氟乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐4mmol及三乙胺lml， 在25ml乙二醇单甲醚中回流搅拌1.5小时。其中，l-氟乙基-2-甲基苯并' 噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到。再向反 应液中加入4mmo1 NaC104溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热搅拌 10分钟，将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染 料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷:乙醇=200:15，收集蓝色组分， 收率60%。 iH-NMR 5 (400 MHz， CD3C1， TMS) S = 1.23 (t， 3H)， 3.68 (t, 2H)， 4.27 (t, 2H)， 4.66 (tetra, 2H)， 6.61 (d， 1H)， 7.07 (d, 1H), 7,21-7.77 (m， 8H)， 7.92 (t， 1H)， 8.38 (d, 1H)， 8.87 (d， 1H)。 MS (EI) C23H22C1FN204S m/z:377.15 [M-C104] +。
实施例3
化合物B的制备
将10mmo1 l-乙基-4-甲基喹啉季铵盐与30mmolN, N，-二苯基甲脒 在50ml醋酐中，于100。C油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的黄褐 色油状物倒入乙醚中析出黄色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲垸:甲醇-100:3,收集黄色组分，收率 41。/。。向其中加入l-氯乙基-2-甲基苯并噻唑季铵盐4mmol及三乙胺lml， 在25ml乙二醇单甲醚中常温搅拌12小时。其中，l-氯乙基-2-甲基苯并 噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到。将反应 液倒入乙醚中，析出蓝绿色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分 离，用洗脱液二氯甲垸:甲醇=100:5，收集蓝色组分，收率62%。 ifl-NMR S (400 MHz, CD3C1， TMS) S = 1.23 (t， 3H)， 3.62 (t， 2H), 4.27 (t， 2H), 4.66 (tetra, 2H), 6.61 (d， 1H), 7.07 (d, 1H)， 7.21-7.77 (m， 8H)， 7.92 (t， 1H), 8.38 (d, 1H), 8.87 (d, 1H)。 MS (EI) C23H22C1IN2S m/z:393.12 [M-I] +。 实施例4
化合物C的制备
将10mmo1 l-溴丁基-2-甲基苯并噻唑季铵盐(该l-溴丁基-2-甲基苯 并噻唑季铵盐可通过类似实施例1的季铵盐通用合成方法制备得到)与15 mmolN,N，-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90。C油浴上加热搅拌2小时。 将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入 一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶 柱分离，用洗脱液二氯甲烷:甲醇=100:3.5，收集黄色组分，收率37%。 向其中加入l-乙基-4-甲基喹啉季铵盐3mmol及三乙胺lml，在25ml乙二 醇单甲醚中常温搅拌12小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗 粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷乙醇= 100:20，收集蓝色组分，收率74%。 ^-NMR S (400 MHz, CD3OD， TMS) S = 1.23 (t， 3H), 2.05 (m, 2H), 2,18 (m， 2H)， 3.56 (t, 2H)， 4.27 (t， 2H)， 4.67 (tetra， 2H)， 6.60 (d， 1H)， 7.07 (d， 1H)， 7.21-7.77 (m， 8H)， 7.92 (t， 1H), 8.38 (d, 1H), 8,87 (d， 1H)。 MS (EI) C25H26BrIN2S m/z:465.1[M-I] +。
实施例5化合物D的制备:
<formula>formula see original document page 13</formula>(D)
将10mmo1 l-溴丁基-2-甲基-4-氯苯并恶唑季铵盐(该1-溴丁基-2-甲基-4-氯苯并恶唑季铵盐可通过类似实施例l的季铵盐通用合成方法制 备得到)与15mmolN，N，-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90。C油浴上加 热搅拌2小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去 醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此 粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲垸:甲醇=100:6，收集黄色组 分，收率33%。向其中加入1-羟基异丙基-4,7 -二甲基喹啉季铵盐(该 1-轻基异丙基-4，7 -二甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例l的季铵盐通 用合成方法制备得到)3mmol及卩比啶lml，在20ml乙二醇单甲醚中常温 搅拌12小时。再向反应液中加入4mmo1 NaC104溶于2mlDMF中得到的 溶液，继续加热到10(TC搅拌10分钟，将反应液倒入乙醚中，析出蓝绿 色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲垸:甲 醇=100:10，收集蓝色组分，收率75%。 ^-NMR S (400 MHz， CD3OD， TMS) S = 1.22 (d， 3H)， 2.05 (m， 2H), 2.18 (m, 2H), 2.35 (s, 3H), 3.56 (t, 2H), 3.80 (m, 1H), 4.27 (t， 2H)， 4.63 (m, 2H), 6.57 (d, 1H), 6.98 (d, 1H), 7.19-7.80 ( m， 6H ), 7.97 (t, 1H), 8.48 (d, 1H)， 8.87 (d, 1H)。 MS (EI) C27H29BrCl2N206 m/z:527.11 [M-C104] +。
实施例6
化合物E的制备
<formula>formula see original document page 13</formula>将8mmo1 1-氯乙基-2-甲基-4-甲氧基苯并-1, 3-硒唑季铵盐(该l-氯 乙基-2-甲基-4-甲氧基苯并-1, 3-硒唑季铵盐可通过类似实施例l的季铵 盐通用合成方法制备得到)与12mmolN,N'-二苯基甲脒在30ml醋酸中， 于90。C油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用正己烷悬 浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过 滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷甲醇= 100:4，收集黄色组分，收率38%。向其中加入l-(4-硝基)-苄基-4-甲基 喹啉季铵盐(该l-(4-硝基)-苄基-4-甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例l 的季铵盐通用合成方法制备得到)3mmol及吡啶l ml， 20ml乙醇中常温 搅拌18小时。再向反应液中加入4mmo1 NaBr溶于2mlDMF中得到的溶 液，继续加热到100。C搅拌10分钟。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色 小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲垸:甲醇 =100:12，收集蓝色组分，收率47%。 ^-NMR 3 (400 MHz, CD3OD, TMS) S = 3.57 (t， 2H), 3.73 (s, 3H)， 4.27 (t， 2H), 5.72(s, 2H)， 6.48(d， 1H), 7.02 (d， 1H), 7.22画7.85(m, IIH)， 8.29 (t， 1H), 8.38 (d， 1H)， 8.85 (d， 1H)。 MS (EI) C29H25BrClN303Se: m/z:578.07 [M-Br]+。
实施例7
化合物F的制备
将10mmo1 1-氟甲基-2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐(该l-氟甲基 -2， 3, 3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐可通过类似实施例l的季铵盐通用合成 方法制备得到)与丙二醛縮苯胺盐酸盐在20ml溶剂(醋酸:醋酸酐4:l) 中加热到120。C，反应1小时后，冷却，加入乙酸乙酯析出固体。过滤， 乙酸乙酯洗涤3次，除去未反应的过量的縮合剂。干燥，得棕黄色粉末， 粗收率76%。向其中加入l-甲氧基乙基-4-甲基喹啉季铵盐(该l-甲氧基 乙基-4-甲基喹啉季铵盐可通过类似实施例l的季铵盐通用合成方法制备得到)4mmol及醋酐8ml， 90。C油浴上加热搅拌2小时。再向反应液中加 入4mmo1 Nal溶于2mlDMF中得到的溶液，继续加热到10(TC搅拌10分 钟将反应液倒入乙醚中，析出蓝绿色小颗粒，过滤，干燥。染料通过 硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲垸:甲醇=100:22，收集蓝色组分，收率 66%。 'H-画R 3(400 MHz, CD3OD, TMS) 3 = 1.73 (s， 6H), 3.24 (s， 3H), 3.82 (t， 2H)， 4.64 (t， 2H)， 4.78 (s, 2H)， 6.24 (d， 1H), 6,37 (d， 1H)， 6.48 (t, 2H)， 7.22画7.85(m, 8H), 8.29 (t, 1H) 8.38(d, 1H)， 8.45 (d, 1H)。 MS (EI) C28H30FIN2O m/z:429.23 [M-I] +。 实施例8
化合物A、 B、 C和M在乙醇中的光稳定性测定 化合物M为已知化合物。M结构如下
将化合物A、 B、 C和M分别配成1X10-SM的乙醇溶液装入可以 密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸 中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶 液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸 光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光 照，计时。每隔1小时后，测量样品光照后的吸光度值。如图1所示， 经过7小时光照后，化合物M和A、 B、 C在乙醇中分别褪色35。/。、 30°/。、 25%、 23%。结果显示，化合物A、 B、 C相比较化合物M，具 有较强的光稳定性。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。
实施例9
化合物A、 B和C在乙醇中的荧光量子产率的测定 配置一定浓度的化合物A、 B和C的乙醇溶液，满足经紫外可见 分光光度计测定最大吸收值<0.1。分别选定激发波长测定荧光强度。平行测定三次，算出荧光量子产率，取平均值。以罗丹明B作为标准 物(O)f-0.97，乙醇,15。C)计算，在乙醇溶液中化合物A的荧光量子产 率0^ = 0.10; B的荧光量子产率①f = 0.12; C的荧光量子产率of-0.097。如图2、 3和4分别为化合物A、 B和C在乙醇中的吸收和发 射光谱。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光 光度计，型号PTI-700。 实施例10
化合物A、 B和C在乙醇中的摩尔消光系数的测定-配置浓度为1X1(T5M的化合物A、 B和C的乙醇溶液，分别取 50pL加乙醇稀释至3mL置于厚度为lcm的比色皿中，测定其吸光度 值。每个样品平行测定三次，根据Lambert-Beer定律，算出摩尔消光 系数，取平均值。在5。C下，乙醇溶液中，sA= 1.23X 105, sB= 1.07 X 105， sc= 0.63 X 105。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。
实施例11
化合物B在含不同浓度DNA的缓冲液中荧光强度的测定 配置浓度为1 X 10'3M的化合物B的DMSO溶液，取6pL加PH 7.82，浓度20mM的Tris-HCl缓冲液稀释至3mL置于比色皿中，测 定其荧光强度。然后，取浓度为0.5吗 L的pBR322质粒DNA2pL 滴加到上述比色皿中，稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA 并待稳定后测定荧光强度值，结果见图5，随着DNA浓度的增大， 荧光逐渐增强；当2nM的化合物B与4.33吗/VL的pBR322质粒DNA 结合后，荧光增强7.4倍。与M相比可以发现，化合物B与DNA结 合后荧光强度有较大幅度的增加。同时，染料B发射光谱与加入DNA 之前相比出现4-5nm左右的红移。本测试温度为10°C;所用仪器为荧 光分光光度计，型号PTI-700。 比较例
化合物M在含不同浓度DNA的缓冲液中荧光强度的测定 配置浓度为1 X 1(T3M的化合物M的DMSO溶液，取6pL加PH7.82,浓度20mM的Tris-HCl缓冲液稀释至3mL置于比色皿中，测定 其荧光强度。然后，取浓度为0.5pg/|iL的pBR322质粒DNA 2 滴加到上述比色皿中，稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA 并待稳定后测定荧光强度值，结果见图6，随着DNA浓度的增大， 荧光逐渐增强；当2(iM的化合物M与4.33吗/nL的pBR322质粒DNA 结合后，荧光增强4.9倍。同时，M发射光谱与加入DNA之前相比 出现4-5nm左右的红移。本测试温度为IO'C;所用仪器为荧光分光光 度计，型号PTI-700。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说 明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是 本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料， 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作 荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发 明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
1权利要求
1.一类含卤素不对称菁类化合物，其特征在于所述化合物具有如下结构通式I其中，m为1～18的整数；n为1或2；X为C(CH3)2、O、S或Se；R1、R2为相同或不同的H、C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5或卤素；R3为卤素；R4为C1-18烷基、OR5、CH2CH2OR5、CH(CH3)CH2OR5、取代或未取代的苄基；R5为H或C1-18烷基；Y-为卤素离子、ClO4-、PF6-或OTs-。
2、 根据权利要求1所述的一类含卤素不对称菁类化合物，其特征在于 当R4为取代的苄基时，苄基的取代基团为H、 Cw8烷基、OR5、 CH2CH2OR5、 CH(CH3)CH2OR5、 COOR5、 N02、 CN或囟素。
3、 权利要求1或2所述的含卤素不对称菁类化合物的制备方法，所述方法包括分别制备第一中间体及第二中间体，所述第一中间体为4-甲基喹 啉的季铵盐中间体，第二中间体为2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并恶唑、 2-甲基苯并硒唑或2， 3， 3-三甲基-3H』引哚啉的芳香杂环季铵盐中间体；将第一或第二中间体中的一个与縮合剂反应，之后再与另一中间体在三乙胺或吡啶的作用下反应得到所述化合物。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述縮合剂为N,N-二苯甲脒或者丙二醛縮苯胺盐酸盐。
5、 权利要求1或2所述的含卤素不对称菁类化合物作为荧光染料的 应用。
全文摘要
本发明提供了一类含卤素不对称菁类化合物及其制备方法。该化合物发射波长长，摩尔消光系数大，灵敏度高，光稳定性好，可以用作荧光染料，尤其适于小型廉价的红色半导体激光器作为光源，可用于核酸分子识别、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
文档编号C09K11/06GK101555246SQ20081006648
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者彤 吴, 孙世国, 彭孝军, 兵 徐, 樊江莉, 邵建辉 申请人:大连理工大学;深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司