一类共轭链上β-位氮取代五甲川菁类荧光染料的制作方法

专利名称：：一类共轭链上β-位氮取代五甲川菁类荧光染料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类共轭链上e-位氮取代五甲川菁类荧光染料，属于生物荧光分析
技术领域：
所用的荧光染料。
背景技术：
：荧光染料作为功能性染料逐渐在各个领域中得到了广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、荧光免疫分析检测等方面的研究则更是备受关注。在细胞生物学上，荧光光谱被用于跟踪细胞内成分的位置和移动情况，另外，细胞的辨别和分类也是依靠以荧光技术为核心的流式细胞计。因此，具有优异光物理性能的荧光染料的开发是发展荧光分析技术的最具决定性的因素。相比其他荧光染料，菁类荧光染料作为荧光染料中的一员在离子探针、生物标记(DNA和蛋白质的标记)、活细胞以及活体组织成像应用方面有其突出的优点，如摩尔消光系数大、最大吸收发射波长可以随着共轭链的增长而增加，如五、七甲川菁染料的最大吸收发射波长达到600nm以上，尤其是七甲川菁染料的吸收发射波长达到750nm以上接近近红外区，能有效降低生物组织的自发背景荧光。—般来说，菁染料的斯托克斯位移只有20nm左右，这不利于染料在生物的应用，因为小的斯托克斯位移会造成以下问题(1)染料的吸收光谱和发射光谱重叠严重，会造成染料的自吸收，染料发射出来的光被自身吸收会降低染料的荧光量子产率(一般在0.2左右)，造成自淬灭。(2)由于染料的斯托克斯位移小，所以染料的最大吸收波长和最大发射波长靠近，这样激发光的散射光会对检测造成干扰。(3)为了避开散射光的干扰，就不能采用最大吸收波长作为激发波长或是不能将检测波长固定在最大发射波长处，这会降低检测的灵敏度。以下两篇文献中报道了染料斯托克斯位移小会对检测造成影响(l)Tolosa，L;Nowaczyk，K.;Lakowicz，J.AnIntroductiontoLaserSpectroscopy,2nded.;Kluwer:NewYork,2002.(2)ZhangZ.，AchilefuS.SynthesisandEvaluationofPolyhydroxylatedNear-InfraredCarbocyanineMolecularProbes.Org.Lett.2004，6(12):2067-2070.为了解决以上问题，开发处具有优良光物理性能的荧光染料是非常有意义的。文献报道在七甲川菁染料的中位连接上氨基后，染料的斯托克斯位移从原来的20nm左右增加到140nm以上，染料的荧光量子产率也提高了。但是，菁染料的共轭链越长其光稳定性就越差，这就使得七甲川菁染料的应用受到限制。相比之下，五甲川菁染料的光稳定性要优于七甲川菁染料，但是作生物应用在存在一些问题，如(1)染料具有小的斯托克斯位移也会造成上述影响。(2)目前的多甲川菁染料一般都是对称结构，缺少单一的荧光标记反应的活性位点。在荧光标记时，荧光菁染料最好在分子中含有一个单一的可活化基团(如羧基等)，用3于特定地衍生反应得到理想的荧光探针分子。而为得到这样含单一羧基的多甲川菁染料，一般方法是合成出不对称菁染料，在分子的一端引入一个羧基。但这个方法使得染料的合成和分离提纯变得复杂和困难。五甲川菁染料是波长最短的近红外菁染料，其光稳定性相比七甲川菁染料要好很多，因此本发明专利主要先合成了一系列具有代表性e-氮取代的五甲川菁染料(IIa-g)，然后测试了他们的光物理性能(光谱和光稳定性)以及该类染料左右与蛋白质通过非共价作用标识剂的应用研究。
发明内容本发明目的是针对当前五甲川菁类荧光染料的斯托克斯位移过小，染料的吸收光谱和自身的发射光谱重叠太多，容易引起染料的自吸收和自淬灭，最终导致这类染料在生物应用时由于激发光散射等问题使得灵敏度降低的问题，设计一类在染料的P-位连接上不同氨基的新结构五甲川菁类荧光染料，期望增大染料的斯托克斯位移，解决染料的自吸收和自淬灭问题，提高染料生物应用的效果。IIIR7通式I中X=II;R2=(CH2)nR8、(CH2)m0R9、(CHR10CH20)PR9或CH2C6H4R8;R3、R4、R8=H、S03Ru或C02R12;R5=(CH2)nR8、(CH2)m0R9或(CHR10CH20)pR9;R6=(CH2)nR8、(CH2)m0R9、(Cffi^C^O)pR9、间位或对位的C6H4R17;R9=H或C卜18烷基；R10=H或CH3;Ru=N(R13R14R15R16);R12=C卜18烷基；R13、R14、R15、R16=H、18烷基；(CH2)m0R9或(CHR10CH20)pR9;R17=H、NH2、NHC0R9或(CH2)nR8;n、m、p=0_18。第一、本发明主要在前人工作的基础上设计出了一条新的合成五甲川菁类染料的方法，该方法未见文献报道，具体过程是利用半反应合成路线和witting反应合成了共同的中间体，然后以此中间体为基础合成出了一系列在共轭链偏位氨基取代的五甲川菁染料。第二、本发明针对现有的染料，合成了一些偏位取代的五甲川菁染料，这些染料能选择性的与DNA、蛋白质生物基质等作用后荧光有较大幅度增强，具有较好的细胞通透性，在活细胞内能选择性成像。本发明的有益效果是设计合成了一类在染料的e-位连接上各种不同氨基取代基后，染料的吸收发射波长均发生不同程度的蓝移，斯托克斯位移从原来的20nm左右增加到70nm以上，解决了五甲川菁类荧光染料的自吸收和自淬灭问题。本发明所合成的染料与传统五甲川菁类荧光染料的生物应用相比，本发明所报道染料与生物基质作用后，荧光强度很明显增加，该类染料与生物基质(蛋白质，脂质体，DNA)作用，表现出很好的选择性，染料具有活细胞膜通透性，在活细胞染色中表现出很好的选择性，染料主要染的是活细胞细胞核周围的脂质体。图l、染料IIc与传统Cy5的吸收发射光谱对比(溶剂乙醇，浓度1.0X10—5mol/L).图2、13-位(偏位)羟乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸缓冲液(pH=7.4)与牛血清蛋白(BSA)的紫外吸收光谱变化滴定，激发波长520nm。图3、13-位(偏位)羟乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸缓冲液(pH=7.4)与牛血清蛋白(BSA)的荧光发射光谱，激发波长520nm。图4、13-位(偏位)羟乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸缓冲液(pH=7.4)与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的紫外吸收光谱变化滴定，激发波长520nm。图5、13-位(偏位)羟乙基氨基取代Cy5(lib:1.OX10—6M)的磷酸缓冲液(pH=7.4)与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的荧光发射光谱变化滴定，激发波长520nm。具体实施例方式实施例l中间体的具体合成路线如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)吲哚的合成方法是按照fisher吲哚合成方法称量苯肼54g(0.5mol)加入到250mL两口瓶中，搅拌下缓慢滴加3_甲基_2_丁酮43g(0.5mol)加热到70-80°C，反应4小时，分去水层，水层用乙醚萃取，与醚层合并后用无水硫酸镁干燥过滤，减压蒸出溶剂，即得到粗制的腙70g，收率80X。将上步粗制的腙70g(0.4mol)与150mL冰醋酸混合，在9(TC油浴中反映3小时，冷却至室温，用饱和碳酸钠水溶液中和水层至中性，分离水相和有机相，水相用乙醚萃取，萃取液与有机相合并，无水硫酸钠干燥过滤后蒸出乙醚，再减压蒸馏，收集130-14(TC(0.08-0.09Mp)沸程的馏分。产品为单换色油状液体52g(收率82%)。[O(HO](2)季铵盐(1)的合成将3.2g(20mmo1)的2，3，3-三甲基-3H-卩引哚啉和4.7g碘乙烷混合于100mL圆底烧瓶中，加入约30mL甲苯，于氮气保护下加热回流7小时，停止加热冷却至室温，过滤生成的固体，用乙醚洗涤得到粉红色固体季铵盐5.4g(收率86%)。(3)中间体2的合成将碘化l-乙基-2，3，3-三甲基-3H喷哚啉季铵盐(12.6g，40mmo1)溶于100mL20X的NaOH溶液中，室温搅拌lh后，反应混合物用无水乙醚萃取(3X50mL)，无水Na2S04干燥，减压除去乙醚得到浅黄色油状液体7g，产率94X。由于该油状物在空气中久置变红，故直接做下一步反应。(4)中间体3的合成冰浴下，将三氯氧磷(4.7g，30mmo1)逐滴滴入20mL新蒸馏的DMF中，30min滴完后，继续搅拌30min，将1(4.5g，25mmo1)溶于15mLDMF中，逐滴加入上述混合物后，9(TC下加热2h后冷却，将反应液倒入200mL冰水混合物中，Na2C03中和，二氯甲烷萃取(3X50mL)，无水化2504干燥，旋转蒸出溶剂，硅胶柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷l/l(v/v))得到黄色固体4g，产率74%。'H-NMR(400MHz，CDCl3)1.27(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.66(s，6H，CH3)，3.748(q，2H，CH2，J=6.8Hz)，5.42(d，1H，CH，J=9.2Hz)，6.85(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.06(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.27(t.1H，ArH，J=7.6Hz)，7.28(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，10.02(d，1H，CHO，J=9.2Hz);13C-NMR(100MHz，CDC13):11.21,29.69,37.71,47.66,98.64，108.10，122.03，122.55，128.19，139.74，142.66，172.72，186.75;HRMS:m/zcalcdM+forC14H17NO215.1310;found，215.1314.(5)中间体4的合成此合成步骤在文献报道基础上将剧毒的溶剂苯换成二氯甲烷。具体操作过程如下将1(7g，37.4mmo1)和三乙胺(4.9g，48.6mmo1)混合于100mL无水二氯甲烷中，在冰浴条件下，将氯乙酰氯(5.03g，44.9mmo1)溶于约20mL二氯甲烷中逐滴滴入上述混合液中，0.5h滴完，然后移去冰浴，反应在室温下继续反应2h后，水洗，二氯甲烷萃取(3X50mL)，无水Na2S04干燥，减压除掉溶剂，硅胶柱层析分离(洗脱剂石油醚/二氯甲烷2/l(v/v))得到浅黄色油状液，逐渐变成固体6.8g，产率70%。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.28(t，3H，CH3，J=7.2Hz);1.72(s，6H，CH3);3.80(q，2H，CH2);4.09(s，2H，CH2)，5.57(s，1H，CH)，6.81(1H，ArH，J=7.6Hz)，7.03(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.20(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.22(d，1H，ArH，J=7.6Hz);13C-NMR(100MHz，CDC13):11.07,22.66,22.81,37.68,48.71,48.59,88.43，108.07，121.96，122.78，127.60，140.23，142.32，172.40，186.33;匪S:m/zcalcdM+forC15H18N0Cl，263.1077;found，271.1085.(6)中间体5的合成2(6.8g，26.2,1)和三苯基膦(10g，40mmo1)溶于100甲苯中，氮气保护下加热回流10h，冷却至室温，过滤固体产物，无水乙醚洗涤，得到乳白色固体季膦盐10.5g，产率76.5%。季膦盐与湿易坏，未经进一步处理直接作下一步反应。[OO53](7)中间体5的合成将3(10.5g，20翻l)和4(4.3g，20翻l)加入50mL无水甲醇和25mL无水四氢呋喃的混合溶剂中，在冰浴条件下，NaH(lg)分批加入上述混合物中，lh加完后继续反应2h，移去冰浴，在室温下搅拌24h，减压除去溶剂，残余物用水洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na2S04干燥后，旋转蒸去溶剂，硅胶柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷2/1(v/v))，得到浅黄色油状物，在空去中逐渐变成黄色固体4.0g，产率约47%。实施例2目标染料的合成(8)染料IIa的合成5(0.425g，lmmo1)溶于10mL无水四氢呋喃中，向其中加入三氯氧磷(0.616g，4mmo1)，氮气保护下加热回流lh，溶液由原来的黄色变成蓝色，冷却至室温，得到中间体6的四氢呋喃溶液，由于6很活泼故不需分离出来直接进行下一步的处理。减压将溶液蒸干后，再加入10mL四氢呋喃，向其中加入浓氨水的四氢呋喃溶液，边加变搅拌，直到溶液有蓝色变成橙红色为止，减压除去溶剂，水洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na2S04干燥，减压除掉溶剂，硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇50/1(v/v))得到红色固体0.08g，产率约17%。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.19(t，3H，CH3，J=7Hz);1.30(t，3H，CH3，J=7Hz);1.51(s，6H，CH3)，1.54(s，6H，CH3);2.24(2H，NH2);3.80(q，2H，CH2，J=6.8Hz);3.92(q，2H，CH2，J=6.4Hz);5.34(s，lH，CH);5.75(d，lH，CH，J=12.8Hz);6.51(d，lH，CH，J=14Hz);6.84(t，2H，ArH，J=6.4Hz);7.01(t，1H，ArH，J=7.2Hz);7.05(d，1H，ArH，J=7.8Hz);7.16(d，1H，ArH，J=7.2Hz);7.23—7.28(4H，ArH);8.00(t，1H，CH，J=12.8Hz)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.56，11.64,28.50,28.65,37.73,47.50,48.18,53.45，96.58，108.05，109.18，114.24，121.92，122.20，122.44，122.53，128.08，128.13，138.75，140.03，142.61，146.76，167.22，168.90HRMS:m/zcalcdM+forC29H36N3+，426.2909;found，426.2901实施例3(9)染料IIb的合成75(0.425g，lmmo1)溶于10mL无水四氢呋喃中，向其中加入三氯氧磷(0.616g，4mmo1)，氮气保护下加热回流lh，溶液由原来的黄色变成蓝色，冷却至室温，得到中间体6的四氢呋喃溶液，减压将溶液蒸干后，再加入10mL四氢呋喃，向其中加入乙醇胺(0.92g，15mmol)的四氢呋喃溶液，边加变搅拌，直到溶液有蓝色变成橙红色为止，减压除去溶剂，水洗涤，二氯甲烷萃取，无水Na2S04干燥，减压除掉溶剂，硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇50/l(v/v))得到红色固体O.15g，产率约36X。'H-NMR(400MHz，CDC13):1.07(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.30(s，6H，CH3)，1.34(3H，CH3，J=6.8Hz)，1.52(s，6H，CH3)，3.47(t，2H，CH2)，3.72(q，2H，CH2，J=6.8Hz)3.80(q，2H，CH2，J=6.8Hz)，4.01(t，2H，CH2，J=6.8Hz)，4.87(s，1H，CH)，5.79(d，1H，CH，J=13.2Hz)，6.77(t，lH，ArH，J=8Hz)，6.74(d，1H，CH，J=13.2Hz)，6.83(d，lH，ArH，J=8Hz)，6.70(t，1H，ArH，J=8Hz)，7.04(t，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.10(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.23(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.25(t，1H，ArH，J=8Hz)，7.27(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.78(t，1H，CH，J=13.2Hz)，11.09(s，1H，NH)13C-画R(lOOMHz，CDC13):11.55，11.79，29.47，29.64，29.80，30.68，37.92，39.98，47.32，47.94，50.32，59.20，81.22，96.81，108.29，108.92，114.58，121.87，122.14，122.41，122.51，128.33，128.95，137.79，139.78，142.73，144.51，148.02，167.17，167.82，171.31;HRMS:m/zcalcdM+forC31H4(lN30+470.3166;found，470.3162.实施例4(10)染料IIc的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>合成方法类似于lib的合成Yield:35%.'H-NMRanc^H」HNMR(400MHz，Acetone-d6):1.09(t，3H，CH3，J=6.4Hz)，1.29(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.29(s，6H，CH3);1.60(s，6H，CH3);3.84-3.96(m，8H，CH2，);4.05(t，4H，CH2，J=6.4Hz)，5.58(s，1H，CH)，5.95(d，1HCH，J=11.2Hz)，6.56(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.88(d，1H，ArH，J=8Hz)，6.97(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.03(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.13(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.18(t，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.27(d，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.30(t，1H，ArH，J=7.8Hz)，7.37(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.91(t，1H，CH，J=11.2Hz).13C-NMR(100MHz，Acetone-d6):12.24，12.43，14.35,23.33,28.76,32.63,38.73，40.59,48.37,54.76,54.99,57.43,59.57,59.97,85.17,99.68，109.32，109.96，113.19，122.13，122.80，123.07，123.77，128.82，129.12，138.7，141.14，143.39，145.94，152.96，165.51，169.77，171.61.HRMS:m/zcalcdM"forC33H44N302+514.3434;found，514.3449实施例5(ll)染料IId的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>合成方法类似于lib的合成Yield:31%.'H-NMR(400MHz，CDC13):0.86(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.05(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.26(s，6H，CH3);1.37(s，6H，CH3);1.47(t，3H，CH3);1.54(t，3H，CH3);3.71(4H，CH2);3.85(2H，CH2);4.04(q，2H，CH2);4.80(s，lH，CH);6.41(d，1H，CH，J=13.2Hz);6.67(d，1H，CH，J=12.4Hz);6.72(d，1H，ArH，J=7.6Hz);6.95(d，1H，ArH，J=8Hz);7.00(t，1H，ArH，J=7.6Hz)，7.05(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.11(d，1H，ArH，J=6.8Hz);7.19(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.25(d，1H，ArH，J=7.6Hz);7.29(t，1H，ArH，J=7.6Hz);7.85(t，1H，CH，J=12.4Hz)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.85，12.18，12.87，13.45，14.55，22.89，28.76，31.63，38.03，39.99，49.27，55.16，55.99，59.91，85.07，98.99，109.10，109.97，112.59，122.25，122.65，123.47，123.77，128.93，129.65，138.67，141.84，143.99，145.71，152.69，165.53，169.72，171.66.HRMS:m/zcalcdM+forC33H44N3+482.3530;found，482.0822实施例6(12)染料IIe的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成方法类似于lib的合成Yield:29%.'H-画R(400MHz,CDC13):0.90(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.28(t，3H，CH3，J=6.4Hz);1.29(s，6H，CH3);1.44(s，6H，CH3);3.65(q，2H，CH2，J=6.4Hz);3.79(q，2H，CH2，J=6.4Hz);4.71(s，2H，CH2);4.72(s，1H，CH);5.81(d，1H，CH，J=13.2Hz);6.70(d，lH，CH，J=7.6Hz);6.83(d，lH，ArH，J=8Hz);6.96—7.07(4H，ArH);7.18-7.25(4H，ArH);7.32(t，2H，ArH，J=7.6Hz);7.47(d，2H，ArH，J=7.2Hz);7.76(t，1H，CH，J=12.8Hz);12.2(s，1H，NH)13C-NMR(100MHz，CDC13):11.81，12.31，28.23，29.76，39.53，40.12，54.51，82.97，100.35，108.92，109.52，110.85，122.06，122.55，124.46，126.57，127.15，128.59，128.71，129.63，134.69，137.40，140.52，141.96，168.39，172.09;HRMS:m/zcalcdM+forC36H42N3+，516.3373;found，516.3381实施例7(13)染料IIf的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>合成方法类似于lib的合成Yield:29%;力-NMR(400MHz，CDC13):1.09(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.26(s，6H，CH3)，1.37(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.47(s，CH3，6H)，4.06(q，4H，CH2，J=6.8Hz)，4.92(s，4H，CH2)，5.12(s，1H，CH)，6.33(d，1H，CH，J=12.8Hz)，6.65(d，1H，CH，J=12.8Hz)，6.76(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.01(t，2H，ArHJ=7.2Hz)，7.10(q，2H，ArH，J=8Hz)，7.21(q，4H，ArH，J=7.6Hz)，7.31(m，4H，ArH)，7.38(t，2H，ArH，J=7.2Hz)，7.44(t，2H，ArH，J=7.2Hz)，7.89(t，1H，CH，J=12.8Hz).13C-NMR(100MHz，CDC13):11.84，12.41，28.48，29.58，39.23，39.73，54.60，83.07，100.28，108.83，109.32，110.18，121.99，122.45，124.43，126.75，127.35，128.56，128.77，129.62，134.63，137.42，140.55，141.95，168.48，171.81;HRMS:m/zcalcdM+forC43H48N3+606.3843;found，606.3832实施例8(14)染料IIg的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>合成方法类似于lib的合成Yield:32%;力-NMR(400MHz，CDC13):1.20(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.26(s，6H，CH3)，1.32(t，3H，CH3，J=6.8Hz)，1.47(s，6H，CH3)，3.87(q，4H，CH2，J=6.8Hz)，4.79(s，1H，CH)，5.08(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.04(d，1H，CH，J=12.4Hz)，6.77(d，1H，ArH，J=7.6Hz)，6.87(d，1H，ArH，J=8Hz)，7.03(q，2H，ArH，J=6.4Hz)，7.10(d，1H，ArH，J=7.2Hz)，7.16(d，lH，ArH，J=7.2Hz)，7.20(t，lH，ArH，J=8Hz)，7.25(d，2H，ArH，J=8Hz)，7.32(t，2H，ArH，J=7.6Hz)，7.62(d，2H，ArH，J=8.0Hz)，7.85(t，1H，CH，J=12.4Hz).13C-NMR(100MHz，CDC13):11.89，11.99，28.66，29.12，29.69，38.14，40.31，47.61，48.19，85.54，98.32，108.67，108.87，121.85，122.22，122.32，122.98，123.57，126.41，128.17，128.32，128.98，138.68，140.07，142.37，144.31，148.85，165.48，168.27HRMS:m/zcalcd,forC35H4。N3+502.3217;found，502.3241实施例9配置浓度为IX10—^化合物I1a-c溶液(溶剂用10mM的PBS缓冲液(pH=7.4))，取染料溶液3mL置于比色皿中，配置一定浓度的牛血清蛋白(BSA)的水溶液，浓度是50ug/uL(750uM)，取BSA溶液滴加到染料溶液中，每加一次等待5分钟待荧光稳定后测定其荧光强度，所用仪器为紫外可见分光光度计，型号；Hp8453;荧光分光光度计，型号FP_6500。实施例10配置浓度为IX10—6M化合物I1a-c溶液(溶剂用10mM的PBS缓冲液(pH=7.4))，取染料溶液3mL置于比色皿中。配置一定浓度的小牛胸腺DNA的水溶液，通过紫外吸收分光光度计测定其260nm处的吸光度值，标定其浓度为1.5X103mM。然后取标定好的小牛胸腺DNA的溶液滴定上述染料溶液，每滴加一次，等待5分钟后测其荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光光度计，型号FP-6500。实施例11激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物A对活细胞MCF-7的染色N,N-二甲基甲酰胺三氯氧磷[OWO]加配有化合物lie和传统Cy5浓度为5uM的PBS缓冲液12pL于培养好MCF-7细胞的六孔板中，在37°C，5%C02的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5minX3，再加入细胞培养基，激光共聚焦扫描显微镜(TCS-SP2，Germany)观察细胞形态。选取代表性区域，分别选用Cy5(633nm)通道激发传统Cy5和绿光543画激发染料IIc，用油镜(1000X)观察，重复三次。表l.染料IIa-g在不同溶剂中的光谱性能<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3摩尔消光系数单位为cm—^b荧光量子产率的测量染料在不同溶剂中的吸收发射光谱，参比染料为罗丹明B的乙醇溶液(Of=0.97);所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Hp8453;荧光分光光度计，型号FP-6500。1、染料的合成将起始原料对位取代苯肼与3-甲基-2-丁酮在冰醋酸中回流，吲哚化反应生成非水溶性的吲哚中间体，再与烷基化试剂于氮气保护下发生季铵化反应生成烷基取代的中间体吲哚季铵盐。以生成的季铵盐为原料分出两条路线进行后续合成，首先季铵盐在碱溶液中常温搅拌生成费希尔碱，在N，N-二甲基甲酰胺与三氯氧磷条件下生成带醛基的中间体；另外，费希尔碱与氯乙酰氯在三乙胺作为敷酸剂条件在生成的中间体再与三苯基膦回流反应生成witting试剂后，上述两个中间体再在无水甲醇与无水四氢呋喃的条件下常温搅拌生成偏位羰基的中间体，此中间体与三氯氧磷反应生成偏位带氯中间体染料，然后与不同胺常温反应生成相应偏位氨基取代的五甲川菁类荧光染料。2、染料的光谱特征本发明专利以II为例分别合成了化合物IIa-g，并对这些化合物的光谱性能进行了测试。通过测试如下实施例中所合成染料的光谱性能可知，该类13位(偏位)氮取代的五甲川菁染料光谱(见图l)和具体数据(表l)。与传统五甲川菁染料相比，这类新染料的吸收波长和发射波长均出现蓝移，吸收蓝移较大，而且吸收光谱与荧光光谱不成镜像对称有两个吸收峰和一个发射峰，具有较大的斯托克斯位移，最小分别可达60nm和150nm，最大可达90nm和230nm，。染料的摩尔消光系数减小，荧光量子产率相对传统五甲川菁染料也降低了。3、染料与生物基质的非共价作用这类新菁染料具有较低的荧光量子产率在水中染料IIa，IIb，IIc的荧光量子产率分别只有0.002，0.002，0.001，具有很低的背景荧光，这有利于染料进行生物应用。本发明专利以染料IIa，IIb，IIc为例，分别测试了与生物基质DNA和蛋白质的作用，染料与蛋白质作用荧光强度有较大提高，而与ct-DNA作用荧光基本没有增加。3.1染料IIa-c分别与具有生物活性的牛血清蛋白(BSA)作用通过牛血清蛋白对染料的滴定结果表明，luM的染料溶液的荧光强度随着牛血清蛋白浓度的增加，染料的紫外吸收逐渐降低，说明染料与BSA分子发生作用并且吸附到BSA分子上所致，荧光强度也得到大幅度提高，其中染料IIb，IIc荧光强度随BSA浓度的增加而线性增加，荧光强度增加达到30倍以上，测试结果见附图2，3是染料lib与BSA的作用图，IIa，lie与BSA作用的结果与lib相同。3.2染料IIa-c分别后染变性的牛血清蛋白和胰凝乳蛋白酶原A将牛血清蛋白和胰凝乳蛋白酶原A先在加有十二烷基硫酸钠和巯基乙醇的沸水中煮十分钟变性，然后将蛋白通过SDS-PAGE电泳后，将凝胶在1.OX10-4M的染料水溶液中浸泡2小时后，再用去离子水清洗2小时候成像。染料的在凝胶上可以后染蛋白的检测限分别是20ngBSA，50ng胰凝乳蛋白酶原A。(YoshioSuzukiandKenjiYokoyama，J.AMCHEM.SOC.2005，127，17799-17802.)3.3染料IIa-c分别与小牛胸腺DNA的作用从三种染料与小牛胸腺DNA的作用结果可知，染料与该DNA作用后荧光基本没有增强，结果见附图4，5是染料IIb与小牛胸腺DNA作用的滴定图，其紫外吸收降低也说明染料与DNA发生作用，不同于BSA的作用的是其荧光强度并没有提高，IIa，lie与DNA作用的结果与IIb相同。说明染料可以将DNA和蛋白质区分开来3.4染料IIc以及传统Cy5在MCF_7活细胞中荧光成像染料可以跨过细胞膜进入到活细胞内，说明染料可以在活细胞呈祥方面具有潜在的应用，染料进入活细胞后与蛋白和DNA作用荧光增加程度不同，表现出对DNA和蛋白质的不同选择性，这对研究活细胞内不同组成成分等生物应用具有非常重要的意义。1权利要求一类用于生物荧光分析细胞成像用的大斯托克斯位移β-位(偏位)取代五甲川菁染料，其特征在于该染料具有下列结构通式2(β-)-X基-3-(1”-N-R1甲基-3”，3”-二甲基-6”-R3-2”-3H吲哚铵)-3’-(1’”-N-R2甲基-3’”，3’”-二甲基-6’”-R4-2’”-3H吲哚基)-1，2，3’-戊三烯氯化盐(I)通式中X为结构通式(R5，R6)氨基(II)；R1、R2为(CH2)nR8、(CH2)mOR9、(CHR10CH2O)pR9或CH2C6H4R8；R3、R4、R8为H、SO3R11或CO2R12；R5为(CH2)nR8、(CH2)mOR9或(CHR10CH2O)pR9；R6为(CH2)nR8、(CH2)mOR9、(CHR10CH2O)pR9、间位或对位的C6H4R17；R9为H或C1-18烷基；R10为H或CH3；R11为H或M；M＝Na、K、N(R13R14R15R16)；R12为H、M、R7或C1-18烷基；R13、R14、R15、R16为H、C1-18烷基；(CH2)mOR9或(CHR10CH2O)pR9；R17为H、NH2、NHCOR9或(CH2)nR8；n、m、p为0-18。F2010100101343C00011.tif全文摘要一类共轭链上β-位氮取代五甲川菁类荧光染料，属于生物荧光分析
技术领域：
。在染料的β-位连接上各种不同氨基取代基后，染料的吸收发射波长均发生不同程度的蓝移，斯托克斯位移从原来的20nm左右增加到70nm以上，解决了五甲川菁类荧光染料的自吸收和自淬灭问题。该染料与生物基质作用后，荧光强度明显增加，该类染料与生物基质(蛋白质，脂质体，DNA)作用，表现出很好的选择性，染料具有活细胞膜通透性，在活细胞染色中表现出很好的选择性，染料主要染的是活细胞核周围的脂质体。此外这类五甲川菁染料光稳定性好，背景荧光低，可满足与其他波长吻合荧光染料并用于单通道激发，多通道检测应用。可应用于蛋白标记与检测，荧光免疫分析以及活细胞选择性成像等领域。文档编号C09B23/16GK101787218SQ20101001013公开日2010年7月28日申请日期2010年1月15日优先权日2010年1月15日发明者和艳霞,孙世国,宋锋玲,彭孝军,杨志刚,樊江莉申请人:大连理工大学