专利名称：汞离子检测用氟硼染料荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其属于精细化工领域中适用于 自然水样及生物细胞内汞离子检测用荧光分子探针。
背景技术：
当体温计、电池成为每个家庭必备的生活用品时，汞产品已经深入人们生活的各 个角落，由于人们的不正确使用汞产品，或者因汞泄露处理不当而引起汞污染的事件层出 不穷。其他造成汞污染的途径还有很多，例如火山爆发、矿物燃料的消耗，尤其是汞矿的开 采，造成了严重的汞污染，危害生态环境以及人类健康的问题已经日益严重！近年来，拥有高灵敏度、高选择性、简洁快速的荧光分子探针检测技术快速发 展，在元素分析中的应用越来越广泛。目前能够检测汞离子的荧光分子探针有很多，例 如罗丹明类荧光分子探针(Chen X Q, Nam S ff, Jou M J, et al.，Org. Lett.，2008，10， 5235-5238.)，荧光素为荧光母体、冠醚为识别基团的探针(Yoon S，Albers A E，Wong A P， et al.，J. Am. Chem. Soc.，2005，127，16030-16031.)，基于荧光共振能量转移机理(FRET) 设计的比率型荧光分子探针(zhang X L, Xiao Y, Qian X H, Angew. Chem.，Int. Ed.，2008， 47,8025-8029.)以及离子催化水解型荧光探针(Santra M，Ryu D, Chatter jee A, et al.， Chem. Commun.，2009，2115-2117)。由于汞离子的嗜硫性，这些探针的识别基团大部分都含 有硫元素。这样虽然提高了配体与汞离子的络合能力，但是同时也降低了配体的选择性，因 为含硫基团也常与铅、银等元素络合。其次，这些探针大部分测试都是在实验室条件下进 行的，而实际应用在自然环境条件下的案例却很少，因为自然环境条件复杂，对探针的水溶 性、选择性、灵敏度都是极大的挑战。另外，生物体内的一些分子含有巯基，他们能与汞离子 形成稳定的配合物，但是很少有文献去探讨这些生物分子对探针识别汞离子时的影响。因 此，开发一种新型的结构简单易于制备的、高选择性与灵敏度的、并且能够应用在实际的自 然环境条件下及生物细胞内的荧光分子探针仍然是个挑战。
发明内容
本发明改进现有的基于络合型汞离子荧光探针结构和性能上的不足，设计并合成 出适用于自然水样中低浓度汞离子检测以及活细胞内检测用、结构简单性能优良的基于氟 硼荧光染料的探针分子为目的。本发明采用的技术解决方案是.一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针分子具有 如下结构通式BHg 所述探针分子采用乙醇-HEPES缓冲溶液配制成用于汞离子检测用的组合物。所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针分子的合成方法包括下列步骤1)使2，4-二甲基吡咯与3-羟基-4硝基-苯甲醛反应将2，4-二甲基吡咯和 3-羟基-4硝基-苯甲醛溶解在二氯甲烷中，滴一滴三氟乙酸，然后室温下搅拌5小时；减 压蒸除溶剂，加入二氯二氰苯醌，搅拌15分钟后再加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，继续 搅拌45分钟，用水洗涤反应溶液，并用二氯甲烷萃取；减压蒸除二氯甲烷，用柱层析分离提 纯目标产物，得到中间体I 2)将中间体I还原，得到化合物BHg 将中间体I溶解在乙醇中，加入水合胼和钯 碳催化剂，回流反应2个小时；冷却后，将溶液过滤，滤液减压蒸除乙醇，然后用二氯甲烷重 新溶解。用去离子水分两次洗涤有机层；有机层溶液用无水硫酸钠干燥，减压蒸除二氯甲 烷，用柱层析分离提纯目标产物，得到红色固体 上述的技术方案所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到
需要的纯度。使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现 有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。本发明不仅提供了包含上述化 合物BHg的组合物，所述组合物用于汞离子的检测。组合物可作为乙醇-HEPES缓冲溶液形 式存在，或者可作为临用前用乙醇-HEPES缓冲溶液配制为溶液的其它合适形式存在；而且 还提供了使用上述化合物BHg或包含BHg的组合物以检测汞离子的方法，该方法包括使上 述化合物BHg或包含BHg的组合物检测样品中的汞离子。本发明的有益效果是上述的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是探针分 子检测灵敏度高，对PH变化不敏感，对各种金属离子以及阴离子具有很好的抗干扰能力， 不但可以应用在富硫环境中检测汞离子，并且还可以应用在实际的自然水样中检测汞离子 以及实现在活细胞内检测汞离子的存在，使得这类探针作为测定汞离子浓度变化的试剂是 极其有用的。由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可了解B0DIPY类染料分子荧光 探针的各种优点，包括但不限于以下(1)荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，荧光量子产率高，对溶剂极性不敏 感，并且化学/光稳定性好。(2)荧光探针分子的设计基于邻氨基酚与汞离子络合的机理，探针分子络合汞离 子前后荧光发射约有20倍的增长。荧光探针分子对汞离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、 铜等金属离子对检测没有干扰。另外荧光探针分子对PH变化不敏感，在pH 5-12的范围内， PH变化对荧光发射基本无影响。(3)荧光探针分子可以检测到ppb级汞离子浓度，并且有很好的线形关系。(4)荧光探针分子可以在富硫环境中检测汞离子而不受干扰。(5)荧光探针分子可以应用在实际的自然水样中检测汞离子。(6)荧光探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，可以实现活细胞内汞离 子的检测。
图1是在乙醇-HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N_2_乙磺酸)缓冲溶液(20mMHEPES， 100mM NaN03,1 l,v/v,pH 7.2)中进行的荧光分子探针BHg的荧光强度随汞离子浓度的 变化关系图。荧光探针分子BHg的浓度是lOyM，汞离子的浓度变化从小到大依次是0，1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，20 iiM。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为 荧光分光光度计，型号LS 55。图2是荧光分子探针BHg对汞离子的选择性荧光发射图。荧光探针分子BHg的浓 度是10WM，各种金属离子的浓度是其5倍当量时的荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵 坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。图 3 是乙醇-HEPES 缓冲溶液(20mM HEPES, lOOmM NaN03,1:1，v/v, pH 7. 2)中 荧光探针分子BHg的荧光强度随pH变化的荧光发射图。横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。 荧光探针分子BHg的浓度为10WM。用NaOH(lM)和HC1 (1M)调节pH。所用仪器为荧光分光 光度计，型号:LS 55。图 4 是在乙醇-HEPES 缓冲溶液(20mM HEPES, lOOmM NaN03,1 l，v/v，pH 7.2)中 各种金属离子对于荧光探针分子BHg-汞离子络合物的干扰实验，先加入除汞离子外其他金属离子以及探针后再加入汞离子。荧光探针分子BHg的浓度为10WM。横坐标各种离子浓度为探针分子浓度的5倍，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。图 5 是在乙醇-HEPES 缓冲溶液(20mM HEPES, 100mM NaN03,1 1，v/v, pH 7.2) 中各种阴离子对于荧光探针分子Mlg-汞离子络合物的干扰实验，先加入各种阴离子以及 探针后再加入汞离子。荧光探针分子BHg的浓度为10WM。横坐标各种离子浓度为探针分子 浓度的5倍，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。图6是用荧光探针分子BHg研究ppb级浓度汞离子与荧光强度线形关系图。荧光 探针分子BHg的浓度为5wM。横坐标为汞离子浓度，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分 光光度计，型号:LS 55。图7为BHg的荧光增强倍数随不同浓度汞离子的变化关系图。荧光探针分子BHg 的浓度为10WM。横坐标为汞离子浓度，纵坐标为荧光增强倍数。所用仪器为荧光分光光度 计，型号:LS 55。图8为三个水样中分别加入50ppb汞离子后BHg的荧光变化情况。横坐标为不同 水源，纵坐标为荧光增强倍数。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。图9是BHg在富硫环境中识别汞离子的研究。荧光探针分子BHg的浓度为10wM。 横坐标为不同体系，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。图10用荧光探针分子BHg在Osteoblasts细胞中对汞离子的识别成像图。图(a) 为BHg加入培养好的Osteoblasts细胞中在37°C下培养基中培养30分钟后白的亮场成像 图；图(b)为BHg加入培养好的Osteoblasts细胞中在37°C下培养基中培养30分钟后的图 像；图(c)向上述含探针的细胞培养液中加入汞离子后在37°C的条件下孵化30分钟后的 图像。荧光探针分子BHg的浓度为10WM，汞离子浓度为10WM。仪器为Olympus 1X70-131。
具体实施例方式
实施例1探针BHg的合成
(1)中间体I的合成将2，4-二甲基吡咯(190mg，2mmol)和3_羟基_4硝基-苯甲醛(167mg，lmmol)溶 解在150ml 二氯甲烷中，滴一滴三氟乙酸，然后室温下搅拌5小时。减压蒸除溶剂至30ml， 加入二氯二氰苯醌(DDQ，442mg，2mmol)，搅拌15分钟后再加入2ml三乙胺和4ml三氟化硼 乙醚溶液，继续搅拌45分钟，用50ml水洗涤反应溶液，并用二氯甲烷萃取(3X20mL)。减压 蒸除二氯甲烷，用柱层析分离提纯目标产物(展开剂石油醚/乙酸乙酯=5 1)，得到红色固体88mg，收率23%。NMR(400MHz，CDC13)，8 10. 67 (s, 1H), 8. 26 (d, 1H, J = 8. 0Hz), 7. 18 (s, 1H), 6. 98 (d, 1H, J = 8. 0Hz) ,6. 02(s，2H)，2. 56(s，6H)，1. 50(s，6H) ；13C NMR(100MHz, CDC13)， 8 ;156. 75，155. 42，144. 88，142. 48，137. 64，133. 65，130. 21，126. 07，121. 82，120. 37， 29. 70，14. 67 ；TOF MS(ES) :m/z Calcd for 384. 1331 (M-H+)，Found384. 1349.(2)BHg 的合成将化合物2(100mg，0. 26mmol)溶解在20ml乙醇中，加入0. 5ml水合胼和10mg钯 碳催化剂(Pd/Ac，10%)，回流反应2个小时。冷却后，将溶液过滤，滤液减压蒸除乙醇， 然后用10ml 二氯甲烷重新溶解。用50ml去离子水分两次洗涤有机层。有机层溶液用无 水硫酸钠干燥，减压蒸除二氯甲烷，用柱层析分离提纯目标产物(展开剂石油醚/乙酸 乙酯=4 1)，得到红色固体 77mg，收率 83%。NMR(400MHz, CDC13), 6 :6.91(d，lH， J = 8. 0Hz)，6. 62 (s, 1H)，6. 56 (d, 1H, J = 8. 0Hz)，6. 04 (s, 2H)，2. 48 (s,6H)，1. 58 (s,6H)； 13C NMR(100MHz，CDC13)，8 :154. 99,144. 36,143. 33,142. 09,135. 43,131. 86,125. 15, 120. 94，116. 84，114. 57，29. 7，14. 57 ;T0F MS(ES) :m/z Calcd for354. 1589 (M-H+)，Found 354. 1592.实施例2探针BHg的荧光强度随汞离子浓度的变化关系将BHg加入乙醇-HEPES (N_2_羟乙基哌嗪-N_2_乙磺酸)缓冲溶液(20mMHEPES， 100mM NaN03,1 l，v/v，pH 7.2)中，配成10wM浓度的溶液。没加入汞离子时，BHg荧光很 弱，然后依次逐渐增加汞离子的浓度0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，20 iiM，BHg荧光也 逐渐增强，滴定到饱和荧光大约增强了 20倍(图1)。所用仪器为荧光分光光度计，型号 LS 55。实施例3探针BHg对汞离子选择性和抗干扰能力将10WM的化合物BHg加到5倍过量的各种金属离子的乙醇-HEPES(N_2-羟乙基 哌嗪-N-2-乙磺酸)缓冲溶液(20mM HEPES, 100mM NaN03,1:1，v/v，pH7. 2)，探针激发波 长为490nm，探针发射波长513nm，测试结果显示于图2中。从图中可以看到，探针BHg对 汞离子具有很高的选择性，只有汞离子的加入才能产生明显的荧光的增强。另外从图4、图 5中可以看出钠、钾、钙、镁、铜等金属离子以及氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子等阴离子对 整个识别过程几乎没有没有干扰。所用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。实施例4探针BHg对pH的不敏感性于化合物BHgdOw)的乙醇-HEPES 缓冲溶液(20mM HEPES，100mMNaN03，l l,v/ v,pH 7. 2)中滴加NaOH溶液(1M)或HC1溶液(1M)来调节溶液的pH并测定荧光强度，记录 相应的荧光强度变化，测试结果显示于图3中。从图中可以看出探针BHg在pH 5-12的范 围内，PH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针可用于此pH范围内汞离子的检测。所 用仪器为荧光分光光度计，型号LS 55。实施例5探针BHg对汞离子检测的灵敏度于化合物BHgdOw)乙醇-HEPES 缓冲溶液(20mM HEPES，100mMNaN03，l l,v/v, pH 7. 2)中加入2-12ppb浓度的汞离子，记录相应的荧光强度变化，测试及过显示于图6中。 从图中可以看出探针BHg，在2-12ppb的范围内荧光强度有明显增强且荧光强度随汞离子 浓度变化呈现很好的线形关系。因此探针可用于低浓度汞离子的检测。所用仪器为荧光分光光度计，型号:LS 55。实施例6探针BHg在自然水样中对汞离子的检测我们选取了三处不同的水源黄海海水(大连)、池水及自来水。在三个样品中分 别加入BHg配成10WM浓度的溶液，依次增加汞离子的加入量。从图7中可以看出，随着汞离 子浓度的增加，三个水样的荧光强度均显著增加并有很好的线性关系，尤其加入50ppb汞 离子后三个水样的荧光强度分别增加了 3. 9倍、4. 5倍、2. 9倍(图8)，效果明显，说明BHg 可以应用在实际的自然水样中进行汞离子的检测。实施例7探针BHg在富硫环境中对汞离子的检测在乙醇-HEPES缓冲溶液(20mM HEPES, 100mM NaN03,1 l，v/v，pH 7.2)中，依次 加入探针BHgdOm)、半胱氨酸(50WM)、汞离子(50WM)，记录荧光强度变化，并与直接加入汞 离子(50WM)BHg的荧光强度变化做比较，根据图9所示，半胱氨酸并没有影响探针识别汞离 子的过程，说明探针BHg可以应用在富硫环境中检测汞离子。实施例8探针BHg系列在活细胞内对汞离子的检测将BHg加入培养好的Osteoblasts细胞中在37°C下在培养基中培养30分钟，此时 的BHg在活的Osteoblasts细胞中的荧光很弱(图10(b))。向上述含探针的细胞培养液中 加入汞离子后在37°C的条件下孵化30分钟，此时在活的Osteoblasts细胞中的荧光变得很 强(图10 (c))。亮场成像证明含有BHg以及汞离子的Osteoblasts细胞在整个过程中均可 以观测到(图10(a))。所用仪器是Olympus，1X70—131。
权利要求
一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其特征在于所述探针分子具有如下结构通式BHgFSA00000093308300011.tif
2.据权利要求1所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其特征在于所述探针分子 采用乙醇-HEPES缓冲溶液配制成用于汞离子检测用的组合物。
3.据权利要求1所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针的合成方法，其特征在于所 述探针分子的合成方法包括下列步骤1)使2，4-二甲基吡咯与3-羟基-4硝基-苯甲醛反应将2，4- 二甲基吡咯和3-羟 基-4硝基-苯甲醛溶解在二氯甲烷中，滴一滴三氟乙酸，然后室温下搅拌5小时；减压蒸除 溶剂，加入二氯二氰苯醌，搅拌15分钟后再加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，继续搅拌45 分钟，用水洗涤反应溶液，并用二氯甲烷萃取；减压蒸除二氯甲烷，用柱层析分离提纯目标 产物，得到中间体I 2)将中间体I还原，得到化合物BHg将中间体I溶解在乙醇中，加入水合胼和钯碳催 化剂，回流反应2个小时；冷却后，将溶液过滤，滤液减压蒸除乙醇，然后用二氯甲烷重新溶 解。用去离子水分两次洗涤有机层；有机层溶液用无水硫酸钠干燥，减压蒸除二氯甲烷，用 柱层析分离提纯目标产物，得到红色固体
全文摘要
一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其属于精细化工领域中适用于自然水样及生物细胞内汞离子检测用荧光分子探针。该荧光探针及其组合物结构简单，易于制备，激发和发射波长均在可见光区。在pH5～12的实用检测范围内，探针对汞离子有很好的选择性，而钠、钾、钙、镁、铜等金属离子以及氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子等阴离子对检测没有干扰；探针具有很好的灵敏度，乙醇-HEPES缓冲溶液中2-12ppb汞离子浓度范围内，离子浓度和荧光强度成良好的线性关系；该探针可以应用在实际的自然水样中检测汞离子，10-100ppb汞离子浓度范围内，离子浓度和荧光强度成良好的线性关系；此外，探针可以在富硫环境中检测汞离子而不受干扰，并且可以实现在活细胞内检测汞离子。
文档编号C09B57/00GK101851500SQ20101016630
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者宋克东, 彭孝军, 李宏林, 樊江莉, 王嵩, 胡明明 申请人:大连理工大学