专利名称：一种高纯度d-荧光素的制备和纯化方法
技术领域：
本发明属于化学合成领域，具体涉及ー种高纯度D-荧光素的制备和纯化方法。
背景技术：
D-荧光素是ー种依赖腺苷三磷酸(ATP)生物发光反应的底物，生物发光的原理是荧光素在ATP和氧存在条件下被荧光素酶氧化，其化学反应式如下ATP+D-LUCiferin+02ヰ 0巧111(^作1^11+ム1^+ 1+02+1^8社。荧光素/荧光素酶的生物发光反应常用于ム1 、能转化为 ATP的代谢物(如AMP、ADP、cAMP)和能产生ATP的酶(如肌酸激酶等)的检测，因此生物发光反应可应用于广泛范围内生物材料的检测。近几十年来，ATP生物发光技术得到了很大的发展，已经在細胞増殖、細胞毒性和生物量计数等方面广泛应用。在食品卫生领域由于 ATP生物发光技术无需培养过程，操作简便、灵敏度高，数分钟内可得到結果，具有其它微生物检测方法无法比拟的优势，是目前检测微生物最快的方法。除此之外，荧光素酶基因可作为报告基因，在分子生物学上有广泛的应用。因此荧光素/荧光素酶生物发光反应具有很大的市场，D-荧光素作为生物发光反应的底物，随着ATP生物发光反应试剂需求的増加，其需求量越来越大。而D-荧光素目前国内主要依靠进ロ，其价格高，货期长，另外已有的国产产品含量低，发光活力不高，因此研制高纯度的D-荧光素有很好的市场前景和科学意义。发明专利ZL200410051705. 2，发明名称为D-荧光素化学合成方法及装置相同，介绍了ー种新的D-荧光素化学合成方法与装置。通过将高纯度的2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，采用合适的方法提取脱甲基产物2-氰基-6羟基苯并噻唑后经柱层析纯化，最后将纯化的脱甲基产物与D-半胱氨酸进行缩合反应后可获得 D-荧光素产品。后续研究发现，随着反应规模的扩大，脱甲基产物2-氰基-6羟基苯并噻唑的纯度有时难以保证，进一步缩合后的荧光素产品纯度和发光活力相对有所降低，纯度不高的荧光素产品因含抑制物发光活力而达不到要求的水平。由于D-荧光素是ー种立体异构体，在一些溶剂中容易氧化解旋并见光分解，一般的纯化方法如柱层析纯化效果不好。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备纯度高的D-荧光素产品、且制备的产品D-荧光素的发光比活力高，得率也高的高纯度D-荧光素的制备方法。本发明的高纯度D-荧光素的制备方法，它是由2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，然后提取脱甲基反应产物，经柱层析纯化，最后将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得 D-荧光素产品，其特征在干，所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品是在充氮气的条件下，2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸在碱性条件下进行缩合反应，反应完毕后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品，其优选步骤为纯化后的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑(M176彡85% )与D-半胱氨酸盐酸水合物按质量比1 1 1. 6在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合，用饱和氮气的0. 1 2mol/L的碳酸钾溶液在充氮气的条件下，调节其pH至8 9，反应5 60min，反应完毕在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取，水相用0. 2 lmol/L的盐酸调节pH至1 3，分离沉淀物，再用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，10000 15000r/min离心，去上清，沉淀物经真空干燥，即可获得高纯度D-荧光素产品。利用本优选方法制备的D-荧光素产品，其纯度大于90% (HPLC，％ Wt)，并且可以高得率获得发光比活力达到甚至高于 Singma L9504D-荧光素的D-荧光素产品。所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂优选为醇类、酯类和烃类及其混合物，进一步优选为酯类和烃类，其中所述的在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合中的有一定极性的非水溶性有机溶剂优选为ニ氯甲烷，所述的用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取中的有一定极性的非水溶性有机溶剤，优选为乙酸乙酯或ニ氯甲烷或体积比为1 1 的乙酸乙酯和水混合液或体积比1 5 1的ニ氯甲烷和水的混合液，萃取优选为2 3 次。所述的用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，洗涤次数优选为2次。本发明的第二个目的是提供一种高纯度D-荧光素产品的纯化方法，其特征在干， 将低纯度的D-荧光素产品在充氮气条件下，用碱性溶液溶解，然后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产
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ΡΠ O所述的高纯度D-荧光素产品的纯化方法，优选具体步骤为将低纯度的D-荧光素产品用饱和氮气的0. 1 2mol/L的碳酸钾溶液在充氮气的条件下溶解，在充氮气的条件下再用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取，萃取后的水相用0. 2 lmol/L的盐酸调节pH 至1 3，分离沉淀物，再用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，10000 15000r/min离心，去上清，沉淀物真空干燥，即可获得高纯度D-荧光素产品。利用该纯化方法可以提高D-荧光素产品中D-荧光素的纯度，并且还可以提高低纯度的D-荧光素的发光比活力，纯化的得率也很高。所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂优选为醇类、酯类和烃类及其混合物，进一步优选为酯类和烃类及其混合物，如乙酸乙酯或ニ氯甲烷，萃取优选为2 3次。所述的用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，洗涤次数优选为2次。1、脱甲基产物的組成成分与含量分析通过GC-MS进行分析。2、合成的D-荧光素的組成与含量分析用高效液相色谱(HPLC)在有标准样品対照的情况下进行合成D-荧光素的組成成分与含量分析。3、合成的D-荧光素发光活力分析用70mmol/L Tris-Maleate (pH 7.75)缓冲液配 D-荧光素为 lmg/ml 的液体， 抽真空通氮气，可用于测量或_30°C冻存起来，用无菌纯水配1 X 10_7mol/LATP标准溶液， 25mmol/L GB(pH 7.2)为酶测试缓冲液，0. 5ml 检测体系，S卩0. Iml ATP+Xml Ln+ (0. 3-X) mlGB+0. ImlFL (不含荧光素的冻干酶粉1瓶配2ml酶液)，X为测试中荧光素液体的量(ml)， 以Sigma L9504荧光素作为比对分析样，在GLOMAX 20/20发光检测仪上进行发光分析，测试结果以样品荧光素的发光活力CP3S与标准荧光素的CP3S的比值表示，本专利实验中X 选 25 μ L0利用本发明的高纯度D-荧光素的制备方法，可以获得高纯度的D-荧光素产品，并且其D-荧光素的发光比活力较高，得率也高，如果用原料脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑的纯度(Μ176彡85%)时，其制备的高纯度的D-荧光素产品的纯度可达90% (HPLC，% Wt)以上，发光比活力达到甚至高于Sigma L9504D-荧光素。D-荧光素的发光比活力与合成原料2-氰基-6-羟基苯并噻唑的纯度有关，纯度越高原料得到的产品发光比活力越高。利用本发明的高纯度D-荧光素产品的纯化方法纯化低纯度的D-荧光素产品，不但能够有效的提高D-荧光素的纯度，还能提高D-荧光素的发光比活力，且其得率也比较尚ο
图1是一次性合成提取和纯化D-荧光素2011111702HPLC图谱。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、D-荧光素粗品的合成，其合成与专利号为ZL200410051705. 2，发明名称为 D-荧光素化学合成方法及装置相同，具体的方法为1、脱甲基反应D-荧光素的反应原材料为2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(99%，NEW JERSEY, USA1-800-ACR0S-01)和盐酸吡啶(98%，ACR0S 0RGANICS)，反应比例为2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑盐酸吡啶=1 1 3，反应温度为180 250°C，环境为抽真空通氮气，反应时间为0. 5 3h。2、脱甲基目标产物的提取脱甲基反应后的产物用1 1 3的乙酸乙酯和冰水洗涤反应后的混合物三次， 每次的用量约为反应原材料的50 100倍。通过萃取有机层后用旋转真空蒸发仪进行浓缩干燥。3、脱甲基产物的纯化脱甲基后的目标产物纯化是用80 400目的粗孔硅胶进行柱层析，层析柱最好用带三通的可加压式层析纯化柱。用体积比5 1 3氯仿/乙酸乙酯做洗脱溶剂，对直径为25mm，高为250mm的层析柱，洗脱流速为1 lOml/min，通过HTLC (高效薄层层析)检测， 收集目标产物浓度的较高部分，合并之后进行旋转真空蒸发浓缩干燥。
4、纯化后的脱甲基产物与D-半胱氨酸的缩合反应纯化后的脱甲基产物与D-半胱氨酸水合物在碱性混合溶剂中于室温下避光反应 10 30min，用盐酸调pH值至1 6，通过1000 15000r/min室温条件下离心10 20min， 收集沉淀，并将此沉淀在真空条件下干燥，即可得D-荧光素粗品。按上述方法得到2011052501号D-荧光素样品、2011052502号D-荧光素样品、 2011052503号D-荧光素样品和Itlll.5.8号D-荧光素样品，供下述实验用。对比例1 反相色谱柱层析纯化1、合成荧光素的柱层析纯化过程1. 1、2011052502 号 D-荧光素样品 ^9mg，经 C18 反相柱层析(1.6cmX38cm，V = 76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸铵；B液90%甲醇+10%乙酸铵；约2. Oml/min。A液平衡120ml，上样，A液洗50管(约IOml/管)，B液洗IOml/管约收20管。点HTLC板，收集板上目标物较多的管，合并，旋转真空干燥，用1 1甲醇水洗下转入12ml离心管中， IOOOOg (10500r/min), 5. Omin，17°C离心，去上清，抽真空，通氮气干燥器中吸干水份，用分析天平称重为M2. lmg，得到纯化后的D-荧光素样品，命名为2011090801号D-荧光素样品，得率为80. 97%。1.2、2011052502 号0-荧光素样品 207.%^，经(18反相柱层析(1. 6cmX38cm, V =76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸铵；B液90%甲醇+10%乙酸铵；约2. Oml/min。A液平衡120ml，上样，A液洗50管(约IOml/管)，B液洗IOml/管约收20管。点HTLC板， 收集板上目标物较多的管，合并，旋转真空干燥，用1 1甲醇水洗下转入12ml离心管中，10000g(10500r/min)，5. Omin, 17°C离心，去上清，抽真空，通氮气干燥器中吸干水份， 得到纯化后的D-荧光素样品，命名为2011090901号D-荧光素样品，用分析天平称重为 169. lmg，得率为81. 5%01.3、2011052503 号0-荧光素样品 27511^，经(18反相柱层析(1.6cmX8cm，V = 76ml)，A液30%甲醇+70%乙酸铵；B液90%甲醇+10%乙酸铵；约2. Oml/min。A液平衡120ml，上样，A液洗50管(约IOml/管)，B液洗IOml/管约收20管。点HTLC板， 收集板上目标物较多的管，合并，旋转真空干燥，用1 1甲醇水洗下转入12ml离心管中，10000g(10500rpm)，5. Omin，17°C离心，去上清，抽真空，通氮气于干燥器中吸干水份， 得到纯化后的D-荧光素样品，命名为2011091601号D-荧光素样品，用分析天平称重为 228. Omg，得率为82. 91%。2、纯化后的D-荧光素样品的发光比活力测试通过HPLC检测经柱层析纯化前后的荧光素样品中目标物质D-Luciferin的含量， 通过不含荧光素的纯化萤火虫荧光素酶检测其发光活力，以Sigma L9504荧光素为检测标准，其目标物质的纯化得率和样品发光活力结果见表1。表1 经C18反相柱层析纯化的D-荧光素样品其D-Luciferin的含量及样品发光比活力
权利要求
1.一种高纯度D-荧光素的制备方法，它是由2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，然后提取脱甲基反应产物，经柱层析纯化，最后将纯化的脱甲基产物 2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品，其特征在干，所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行縮合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品是在充氮气的条件下，2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸在碱性条件下进行缩合反应，反应完毕后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。
2.根据权利要求1所述的高纯度D-荧光素的制备方法，其特征在干，所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品，其具体步骤为纯化后的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑 (M176彡85% )与D-半胱氨酸盐酸水合物按质量比1 1 1. 6在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合，用饱和氮气的0. 1 2mol/L的碳酸钾溶液在充氮气的条件下，调节其PH至8 9，反应5 60min，反应完毕在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取，水相用0. 2 lmol/L的盐酸调节pH至1 3，分离沉淀物，再用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，10000 15000r/min离心，去上清，沉淀物经真空干燥，即可获得高纯度D-荧光素产品。
3.根据权利要求2所述的高纯度D-荧光素的制备方法，其特征在干，所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂为醇类、酯类或烃类或其混合物。
4.根据权利要求2所述的高纯度D-荧光素的制备方法，其特征在干，所述的在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合中的有一定极性的非水溶性有机溶剂为ニ氯甲烷，所述的用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取中的有一定极性的非水溶性有机溶剂为乙酸乙酯或ニ氯甲烷或体积比为1 1的乙酸乙酯和水混合液或体积比1 5 1的ニ氯甲烷和水的混合液。
5.根据权利要求2所述的高纯度D-荧光素的制备方法，其特征在干，所述的萃取次数为2 3次，所述的用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，洗涤次数为2次。
6.一种高纯度D-荧光素产品的纯化方法，其特征在干，将低纯度的D-荧光素产品在充氮气条件下，用碱性溶液溶解，然后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。
7.根据权利要求6所述的高纯度D-荧光素产品的纯化方法，其特征在干，其具体步骤为将低纯度的D-荧光素产品用饱和氮气的0. 1 2mol/L的碳酸钾溶液在充氮气的条件下溶解，在充氮气的条件下再用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取，萃取后的水相用 0. 2 lmol/L的盐酸调节pH至1 3，分离沉淀物，再用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，10000 15000r/min离心，去上清，沉淀物真空干燥，即可获得高纯度 D-荧光素产品。
8.根据权利要求7所述的高纯度D-荧光素产品的纯化方法，其特征在干，所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂为醇类、酯类或烃类或其混合物。
9.根据权利要求8所述的高纯度D-荧光素产品的纯化方法，其特征在干，所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂为乙酸乙酯或ニ氯甲烷。
10.根据权利要求7所述的高纯度D-荧光素的制备方法，其特征在干，所述的萃取次数为2 3次，所述的用体积比为1 5 1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，洗涤次数为2次。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度D-荧光素的制备和纯化方法。本发明的制备方法是在充氮气的条件下，2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸在碱性条件下进行缩合反应，反应完毕后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。利用本发明的高纯度D-荧光素的制备方法，可以获得高纯度的D-荧光素产品，并且其D-荧光素的发光比活力较高，得率也高，如果用原料脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑的纯度(M176≥85％)时，其制备的高纯度的D-荧光素产品的纯度可达90％(HPLC，％Wt)以上，发光比活力达到甚至高于Sigma L9504D-荧光素。
文档编号C09K11/06GK102532053SQ20111045984
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者吴慧清, 吴清平, 张菊梅, 李程思 申请人:广东环凯微生物科技有限公司, 广东省微生物研究所