一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 硝基还原酶家族属黄素酶，通常含有黄素单核苷酸单元或黄素腺嘌呤二核苷酸单 元，可以在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代谢芳香族硝基化合物或者硝基取代的 杂环化合物，根据对氧气是否敏感以及电子转移方式不同硝基还原酶可分为两类：一类是 氧气不敏感型，这类硝基还原酶通过双电子转移方式在氧气存在或缺氧条件下通过NADPH 的作用均可将硝基化合物还原为亚硝基和羟胺中间体以及最终的氨基化合物；另一类是氧 气敏感型，这一类硝基还原酶只有在厌氧条件下才能还原硝基化合物，这是因为在氧气存 在下通过单电子还原硝基化合物得到的硝基阴离子自由基会直接与氧气发生反应生成超 氧自由基，重新生成最开始的硝基化合物。
[0003] 硝基还原酶通常存在于细菌如大肠杆菌中。研宄表明缺氧组织或细胞以及肿瘤中 硝基还原酶的含量相对正常状态呈现升高趋势。在缺氧条件下以还原型烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸NADH作为电子供体细胞内的硝基还原酶可催化多种外源硝基芳香族化合物发生单电 子转移，生成硝基阴离子自由基，随后进一步被还原成羟胺或氨基。因此，硝基还原酶可以 作为衡量细胞或生物体缺氧状态的重要指标。另一方面，硝基还原酶在药物的激活和硝基 芳香族化合物的生物降解中也起着重要作用，并在生物技术肿瘤治疗抑制剂领域拥有良好 的应用前景。因此，测定生物体系中的硝基还原酶对进一步了解其生物功能非常重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用，该底物原型 和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体 系中硝基还原酶的分布和功能进行定量评价。
[0005] 本发明提供了一种硝基还原酶的特异性荧光探针，该底物的硝基可以被硝基还原 酶代谢为相应的氨基化合物，产物显示与底物不同的发射波谱；该底物是以苊醌为原料，通 过硝化反应得到的，其结构通式如（1)所示。
[0006]
【主权项】
1. 一种硝基还原酶的特异性巧光探针，其特征在于：该探针底物中的硝基基团可被硝 基还原酶特异性代谢为氨基，其结构式如式（1)所示，该底物为5-硝基起酿。
2. -种权利要求1所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：采用上述 式（1)化合物作为硝基还原酶的特异性底物，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其 产物的生成率来定量测定不同生物体系中硝基还原酶的活性。
3. 根据权利要求2所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：所述体外 解育反应条件为；底物浓度介于1/10?lOKm之间；解育体系抑介于5. 5?10. 5之间；反 应温度介于20?60°C之间。
4. 根据权利要求2所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：所述底物 消除率或产物的生成率低于20%。
5. 根据权利要求2所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：该探针底 物不具有巧光，产物具备巧光，可采用巧光检测器实现底物巧光变化的快速、灵敏检测。
6. 根据权利要求2所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：该探针底 物还可用于硝基还原酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
7. 根据权利要求2所述硝基还原酶的特异性巧光探针的应用，其特征在于：所述巧光 探针代谢产物可W通过双光子激光器激发，该波长作为激发光源，生物样品背景巧光微弱， 适合对细胞中苯硫酪含量进行检测。
【专利摘要】一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物为5-硝基苊醌，其可用于测定生物体系中硝基还原酶的酶活性。硝基还原酶酶活性测定的流程如下：选择硝基还原反应为探针反应，通过定量检测单位时间内还原产物的生成量来测定各生物样品、细胞、载体及整体器官中硝基还原酶的活性。借助该探针反应还可用于体外快速筛选硝基还原酶的抑制剂并评估其抑制能力。本发明提供了一种5-硝基苊醌作为硝基还原酶荧光探针及其应用，其经硝基还原酶代谢后可生成具有双光子荧光属性的代谢产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制活性评价快速高效等特点。
【IPC分类】C09K11-06, C07C205-46, C12Q1-26
【公开号】CN104592984
【申请号】CN201410836056
【发明人】崔京南, 冯磊
【申请人】大连理工常熟研究院有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月29日