专利名称：筛选组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选组合物的方法，所说的组合物可干扰任何转录反式激活特异的病理学过程;特别是涉及依靠其干扰病毒反式激活元件的能力来鉴定抗病毒剂的方法。
现已认识到，在某些病毒感染期间，感染的特定阶段具有不同类病毒基因协同诱导的特征。这种发展的规律可在转录开始水平由特殊的病毒蛋白通过一种所谓反式激活的过程来介导(如参见Wagner，E.，Adv.Viral Oncol.3239-270(1983);Weinheimer，S.P.and S.l.Mcknight，J.Mol.Biol.195∶819-833(1987))，反式激活通过病毒蛋白质、宿主细胞蛋白质和DNA的联合相互作用来完成。
为了更充分地了解反式激活的复杂性并更充分地了解本发明，需要简要地评述真核生物转录过程。总地说来，有关真核转录领域最近已由Ptashne，M.Nature 335∶683-689(1988)，Lewin，B.Cell 61∶1161-64(1990)作了评述，它的整个内容仅作为背景技术列入本文作为参考。简而言之，真核基因含有比在最终信使RNA(mRNA)转录中显示有更多的信息。该信息存在于转录单位的外面(如，肿瘤相关移植抗原盒(TATA bOX))，或转录单位的里面(如，作为内含子，聚腺苷酸化位点等)。最终mRNA种是广泛的转录后修饰活动的结果(如剪接，5′帽顺序的加入、Poly A尾的截短和加入)。为本发明的目的，影响转录开始的转录单位外成分对下文概述的原因更为重要。
在真核生物和动物病毒中，转录开始的机理是很复杂的。在起始位点的上游，经常是一个在RNA聚合酶识别中很重要的TATA盒。在酵母中，TATA盒典型地为60-100碱基对(bp)的上游区，而在较高等真核生物中如果蝇或人体中，TATA序列通常为30bp的上游区。上游区激活序列(UAS，也称作增强子，上游因子，远端启动子或顺式作用因子)通常位于100到400bp的上游，然而，一些UAS可占有可变定位的上游，下游和他们调节之基因的内含子中。这些序列结合在特异的真核反式激活因子蛋白上。对于接近于转录起始位点的UAS序列的定位是关键，而对于那些远离起始位点的UAS来说，序列可以任一方向出现(见，
图1)。
已经基于他们转录的RNA类型并根据他们对蘑菇毒素、α-蝇蕈素(α-amanitin)的敏感性限定了三种真核RNA聚合酶。RNA聚合酶Ⅰ制造大的核蛋白体RNA并对α-蝇蕈素敏感。RNA聚合酶Ⅱ制造信使RNA(mRNA)并对α-蝇蕈素敏感。RNA聚合酶Ⅲ制造各种很小的稳定的RNA包括5S核蛋白体RNA和转移RNA并且部分地对α-蝇蕈素敏感。然而，大部分形成核内小核糖核蛋白(snRNP)的小RNA是由RNA聚合酶Ⅱ制造的。这些聚合酶由8-12个多肽链组成，包含两个类似于大肠杆菌RNA聚合酶β和β′亚单位的大的亚单位。在以下的讨论中，重点将是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)(参见图2)。
真核转录反应可分为两个部分，基本复合体的形成和被结合在UAS上的反式激活因子激活。基本转录复合体的组装决定那个基因将被转录，而反式激活因子复合体的组装则决定转录的速度和时机。
据目前了解，在转录的第一步和在结合RNA polⅡ之前，有许多转录因子集合在TATA盒上。其中第一个是TFⅡD(转录因子ⅡD)。据认为，TFⅡD与TATA盒结合在转录开始中是决定速度的步骤。TFⅡD可通过阻断核小体在TATA盒上的形成起作用并因此促进聚合酶的结合。然后转录因子ⅡA(TFⅡA)和转录因子ⅡB(TFⅡB)结合到TFⅡD上得到DAB复合体。已克隆了许多这样的通用转录因子的基因，并已确定了它们的序列。
一但形成DAB复合体，RNA pol Ⅱ就能被结合。然而在结合前，TFⅡF(由两个亚单位 RAP30和RAP74组成)必须首先与聚合酶结合。该复合体(称为RNA pol ⅡA)与DAB复合体结合后，大RNA pol Ⅱ亚单位(RBP1)的C末端区域被一种推荐的C末端区域激酶多聚磷酸化。要求进行修饰来增加聚合酶(现称为RNA pol ⅡO)对DNA的亲和力约为50倍并因此而使聚合酶参予特定基因的转录。磷酸化后，因子TFⅡE、G和H结合而产生基本复合体。在这种情况下，使RNA pol ⅡO即作好开始转录的准备。当该聚合酶开始转录并移下DNA分子时，即认为TFⅡD被留下来以帮助另一轮转录开始。从基本复合体转录的速度通常是低的。需要复合体与上游反式激活因子的相互作用来促进高水平转录。
转运激活因子的结构现已在某些细节上进行了检测(参见图3)并已出现了许多一般性文章。最引人注目的是有这样一个模式结构的转运激活因子，即每个因子均有一个特异性DNA识别区域和一个独特的激活区域。该DNA识别区域引导因子到达特定的UAS处，然后激活区域可在此处与基本转录部件特异地相互作用。
迄今已将DNA识别区域根据特征分为四大类或家族(图3)。这些是(ⅰ)同源异型区域或螺旋反拆螺旋家族(helix-turn-helix family)，分别由Oct-1 Oct-2，Pit-1和unc-86来表示，现表示为POU蛋白(Herr et al.，1988);(ⅱ)锌指蛋白家族(Zinc finger family)，用TFⅡA和甾类激素受体来表示(Kaptein，R.，Curr.Opin.in Struct.Biol.1∶63-70，(1991));(ⅲ)二聚体的、亮氨酸拉链家族(dimeric，leucine zipper family)，用jun和fos表示(Kerpolla，T.K.and T.Currom，Curr.Opin.in Struct.Biol.1∶71-79，(1991));(ⅳ)以及二聚的、螺旋环螺旋家族(dimeric，helix-loop-helix family)，用E12和E47表示(Murre et al.，Cell 56∶777-83(1989))。另外，还有许多未分入这些组并可含有其他DNA识别特征的转运激活因子。
因此迄今也将特征性的激活区域分为四个家族。有不定结构的，酸性区域的激活因子用HSV VP16来表示(Dalrymple，M.A.et al.，Nucl.Acid Res.13∶7865-79(1985));Cress，A.and S.J.Triezenberg，Science251∶87-90(1991));有富含丝氨酸/苏氨酸之激活区域的激活因子用Oct-1和Oct-2来表示(Clerc，R.G.et al.，Genes Dev.2∶1570-81(1988))Sturm.R.A.et al.，Genes Dev.2∶1582-99(1988));有富含脯氨酸之区域的激活因子用CTF来表示(Santoro，C.et al.，Nature 304∶218-224(1988));以及有高含谷氨酸胺之区域的激活因子用Oct-1，Oct-2和Sp1来表示(Courtney，A.J.and R.Tjian，Cell 55∶887-98(1988))。这些激活区域经常是小的并通常由30至100个氨基酸组成。DNA结合和激活区域的独立性质是由激活区域能通过重组方法被连接到异种DNA结合区上，并保持足以激活连接于对新的结合区域特异的UASs上的报道基因转录之感受态这一事实来证明的。Sp1的缺失分析已经显示，它的激活区域有多达四个单独的区域(Courtney，and Tjian，Supra，1988)。此反式激活因子有两个富含谷氨酰胺的区域，第三个带正电荷区域和第四个羧基末端30氨基酸区域。后两个区域显示彼此之间无明显相似处而且与富谷氨酰胺激活区域也不相似。
有关基本转录因子的结构和功能了解得很少。基于六个不同种TFⅡD的结构，可知该分子有两个不同的区域一个可变的N末端区域和一个相对保守的C末端区域。C末端区域(或保守核心)大致为180个氨基酸长。在这六个种中，该区域有80至90%的同源性。此核心的任一末端都含有两个直接重复区并在他们之间有一个保守的基本重复。另外，在参予启动子识别中的myc和真细菌蛋白，δ70间具有同源性。
N-末端更为可变并且对其功能在目前还有争论。已经提示此区域可以种特异的方式与激活因子相互作用。已经显示具有截短之N-末端区域的果蝇TFⅡD和缺乏N末端区域的酵母TFⅡD，当在基本转录试验中与内源性的或已克隆的TFⅡD比较时，均有同样的功能。然而，截短的果蝇或酵母TFⅡD将不允许Sp1启动的反式激活，甚至在果蝇粗核提取物存在下也是如此。这些数据与C末端区域同基本因子间相互作用可能是重要的，而且N末端区域可对调节作用即与上游区域激活因子或与连接子的种特异性相互作用有用这一看法相符。
关于连接子分子知道得更少。这些分子的存在是根据几个小组的研究结果提出的(Berger，S.L.et al.，Cell 61∶1199-1208(1990)，Kelleher Ⅲ，R.S.et al.，Cell 61∶1209-15(1990));Pugh，B.F.and R.Tjian，Cell 61∶1187-97(1990))。Berger等人.，(文献同上，(1990)使用GAl4-VP16嵌合反式激活因子，已间接证明必定有一组桥接式激活因子和基本复合体的分子。Pugh和Tjian(1990)(文献同上)已经显示克隆的果蝇属TFⅡD不能单独取代TFⅡD耗尽提取物，暗示必须有TFⅡD与因子(1-6)的联合。TAF现已被纯化，但还没有被克隆。这些数据提示，在一定情况下，连接子分子可在基本转录复合体中的蛋白质和与上游端激活序列相联的蛋白质之间形成桥并因此而调整他们的活性。应当注意到，目前很少有涉及这些分子的有关资料，并且这些观察结果普遍都未被证实。
已知反式激活因子结合到特异的上游激活序列上。UAS通常发现于含许多不同反式激活因子之结合位点的群中。所以，提出由反式激活因子激活的基本转录是一个组合过程，即细胞发育周期、或者已知基因的内分泌调节表达是由于结合到其特异反应元件上之不同反式激活因子的独特组合的结果。Berger等人(文献同上(1990))的实验阐明了由单一反式激活因子产生的基本转录作用的放大。他们检测了在不同条件下酿酒酵母核提取物中的反式激活因子(GAL4)依赖性转录。使用一种没有UAS，或有GAL4 UAS但没有反式激活因子的DNA模板，他们仅观察到低水平的活性。在含有遗传融合到UP16酸性激活区域上之GAL4-DNA结合区的反式激活因子存在下，使用相同的GAL4 UAS模板，转录增强了100倍。因此，反式激活因子与其上游区域激活序列的结合显著地提高了转录作用。
本发明的一个目的是提供各种可调节的病理学特异性反式激活元件，用这些元件转化宿主细胞以及该转化细胞在筛选干扰反式激活的鉴定化合物中的应用并因此而再提出潜在的抗病原性制剂。可在肿瘤和细菌、病毒及真菌感染中发现病理特异性成分。
图1为原核生物和真核生物基因的结构图。
图2显示基本真核生物转录起始复合体的形成。
图3为图解说明反式激活因子、连接子和基本转录因子功能。
图4说明病毒反式激活的两种优选的靶。
本发明涉及鉴定抗病毒化合物的方法，该方法包括a.在允许细胞生长但基本上不表达所说成分的第一组培养条件下，培养含有编码生长抑制性病毒反式激活元件的有区别地表达之基因的重组细胞，以提供可筛选之细胞的群体;
b.将该细胞转移到使所说的元件是以表达的第二组培养条件下以导致细胞生长抑制;
c.使被抑制的细胞与包含可疑为抗病毒化合物的组合物相接触;和d.鉴定那些减轻生长抑制的化合物。
本发明涉及一种鉴定抗病毒化合物的方法，方法包括a.在含有葡萄糖作为碳源的营养培养基中，培养包含编码与酵母CYC1启动子可操作连接之嵌合基因GAL4-Vp16的质粒的重组酵母细胞;
b.将葡萄糖中生长的酵母细胞铺敷在含有乳酸盐作为碳源的固体营养培养基上，以诱导该嵌合基因的表达导致酵母细胞生长的抑制;
c.将该被抑制的酵母细胞与含有潜在的病毒抑制剂的组合物接触，并d.根据其促进细胞生长的能力来鉴定所说的抑制剂。
为了便于描述，本发明将参照一个公知的反式激活体系来描述，即单纯疱疹病毒(HSV)的VP16蛋白质。然而，本发明可广泛地适用于任何病毒反式激活体系，其中反式激活元件能被有区别地表达，并且当他们被表达时，在表达细胞中产生一种可鉴定的表型。因此，除疱疹病毒外，本发明还期望利用得自乳头状瘤病毒(E2)，HIV1(TAT)中的反式激活元件。
在进一步描述本发明时，将使用下列其他术语，并打算按以下的简要说明来定义之。
“融合蛋白”是一种由表达至少两个可操作地连接的异种编码序列而产生的蛋白质。本发明的含有VP16和GAL4肽序列的蛋白质即是融合蛋白的一个例子。
当RNA聚合酶将两编码序列转录成单一mRNA时，一个编码序列“可操作地连结到”另一编码序列上，其可在单一阅读码中翻译成具有由两个编码序列衍生之氨基酸的单一多肽。只要被表达的序列最终被加工而产生所需的蛋白质，该编码序列不一定是与另一编码序列邻接的。当由所说启动子来调节编码序列的转录时，编码序列“可操作地连接”到启动子上。
“重组”多肽是指以重组DNA技术产生的多肽;即由转化细胞通过编码所需多肽的外源DNA构建体产生的。“合成”多肽是由化学合成制备的多肽。
“复制子”是在体内作为DNA自动复制之功能单位即能在其自己控制下复制的任何遗传元件(如质粒，染色体，病毒)。
“载体”为一种复制子，如质粒，噬菌体，或装配型质粒，它可与另一个DNA片段相接以便使相接片段复制。
“双股DNA分子”是指呈双螺旋，包括松驰和超螺旋化双螺旋的确聚合形式的脱氧核糖核苷酸(碱基腺嘌呤，乌嘌呤，胸腺嘧啶，或胞嘧啶)。该术语仅指分子的一级和二级结构，且不限定它到任何特定的三级形式。因此该术语还包括见于在线性DNA分子中的双股DNA(如限制性片段、病毒、质粒以及染色体)。在讨论特定双股DNA分子结构时，本文中仅按常规沿非翻录的DNA链(即具有同源于mRNA之序列的链)以5′到3′方向给出的序列来描述序列。
DNA“编码序列”或“编码的特定蛋白质的核苷酸序列”是当置于适当调节序列控制之下时在体内转录和翻译为多肽的DNA序列。
“启动子序列”是能在细胞中与RNA聚合酶结合并开始下游(3′方向)编译序列转录的DNA调节区。为了本发明定义的目的，该启动子序列通过编码序列的翻译起始密码子(ATG)被连接到3′末端，并将上游区(5′方向)延伸到包括在本底以上可检测水平上启动转录必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列范围内，将发现一转录起始位点(通过基因定位核苷酸酶S1常规限定的)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合区域(相符序列)。真核生物启动子将经常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核生物启动子除含有-10和-35相符序列外，还含有Shine-Dalgarno序列。
DNA“控制序列”集中起来是指启动序列，核糖体结合位点，聚腺苷化信号、转录终止序列、上游调节区域、增强子等，它们集中地为在宿主细胞中表达(即转录和翻译)编码序列作准备。
当RNA聚合酶将与启动子序列结合时，控制序列在细胞中“指导”编码序列的“表达”，将编码序列转录成mRNA，然后将mRNA转译成由编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是已被或能被外源性DNA序列转化的细胞。
当已将外源性DNA引入细胞膜以内时，细胞即已被外源性DNA转化。外源性DNA可以被或不被整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物和酵母中，例如，外源性DNA可被保持在游离基本元件如质粒上。就真核生细胞来说，稳定地转化细胞是其中外源性DNA已逐渐被整合到染色体中并从而通过染色体复制被子细胞继承的细胞。这种稳定性是通过真核生物细胞建立包含有外源性DNA之子细胞群体的细胞系或克隆的能力证明的。
“克隆”是通过有丝分裂由单一细胞或共同祖细胞衍生的细胞群体。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原始细胞的克隆。
当至少约80%(较好是至少约90%，且最好是至少约95%)的核苷酸或氨基酸与一个确定长度的分子匹配时，则两个DNA或多肽序列是“基本上同源的”。本文中使用的术语“基本上同源的”也指显示与指定的DNA或多肽序列完全相同的序列。基本上同源的DNA序列能在例如按特定体系所限定的亚昆条件下的Southern杂交实验中可能是完全相同的。确定的合适杂交条件是本领域技术人员已知的，如参见“Current Protocols in Mol.Biol”Vol.Ⅰ＆Ⅱ，Wiley Interscience，Ausbel et al(ed.)(1992)。
DNA构建体的“异种”与其它分子相关联的另一DNA分子相连的可鉴别的DNA片段。因此，当异种区编码一酵母基因时，通常该基因两侧接有并不侧接来源酵母的基因组中酵母基因的DNA。另一异种编码序列的例子是其中的编码序列本身在天然中未被发现的构建体(如，具有不同于天然基因之密码子的合成序列)。本文所使用的等位变异或天然出现的突变过程并不产生DNA的异种区。
按以上所提及的，本发明将借助单纯疱疹病毒反式激活体系来举例说明，但本发明不局限于该体系。最近已对HSV反式激活的总体情况进行了评述(O′Hare，P.et al.，Antiviral Chem.and Chemo-therapy，2(ⅰ)∶1-7(1991);Roizman，B and A.E.Sears，Virology(2nd Ed.)，Fields，B.N.and D.M.Knipe(Eds)，pp1785-1841(1990))，其整个内容本文仅列为背景技术供参考。
HSV基因组为线状DNA分子，大小约为150kb。它由两个成分组成，即由一反向重复序列分离并连接的长单一区(L)和短单一区(S)。在复制和包装期间，这些区域能彼此相对颠倒。作为一种结果，从病毒粒子或感染细胞中提取的病毒基因组由四个等克分子的只在L和S成分来源上不同的异构体组成，两个在S成分中(oniS)，一个在L成分的中部(oviL)。感染后，病毒DNA不要求从头进行蛋白合成而立即环化，并且尽管尚未最后证明，但认为复制是通过滚动成环机制进行的。
为了发起感染，疱疹病毒与各种细胞表面分子相连。已经显示硫酸乙酰肝素蛋白多糖在病毒结合中起作用。已有证据提出有一种HSV糖蛋白D受体存在，但其精确的分子尚未被鉴定。已表明病毒蛋白gB和gC在HSV结合过程中是必不可少的。结合后可激活一个由引起被膜和浆膜融合的病毒蛋白gB和gD介导的过程。然后脱去被膜的衣壳被转运到核孔处，在这里释放DNA进入核内。
HSV基因组至少编码72个开放读码。大约67个基因产物已被鉴定(Roizman，B.and A.E.Sears，Ann.Rev.Microbiol.41∶543-571(1987))。遗传学和生物化学的研究已了解到许多这类蛋白质卷入病毒DNA代谢和转录中。由病毒基因产物发挥的许多功能也可通过宿主细胞来提供。
尽管HSV基因并不按照暂时的表达顺序集中成簇，但各组基因都是以有序方式表达的。被表达的第一组基因(直接早期(IE)或α基因)是由反式激活蛋白质(VP16)诱导的，该蛋白在病毒嵴部被带入细胞中并需要该蛋白来引发他们。一些α-基因的上游激活因子序列(VAS)含有VP16介导的诱导作用所需顺式作用元件。直接早期基因编码六个蛋白，即ICP0，ICP4，ICP6，ICP22，ICP27，和ICP47。ICP6基因编码病毒核糖核苷酸还原酶的大亚单位。尽管ICP22在某些细胞类型之晚期基因表达的调节中可能起一定作用，但有关ICP22和ICP47的功能尚不明了。ICP0，4，和27具有作为α、β和γ基因转录起始的特异性反式激活因子的作用。其中，ICP4在调节HSV基因的所有三个动力学类别的表达中起着重要作用。延迟早期(delayedearly(DE))或β-基因在感染后5到7小时之间以峰值水平得以表达并且主要编码参予核苷酸代谢和复制中的酶。这些酶包括DNA聚合酶，大DNA结合蛋白质，三聚的解螺旋酶/引物酶，核糖核苷酸还原酶等。蛋白质合成的终结阶段包括γ或晚期基因的表达。迄今鉴定的γ蛋白质都是病毒粒子的结构成分。γ基因的表达就时间选择和对DNA复制的依赖性来说是不均一的。γ2基因(如，gC和gE)的表达严格地需要DNA合成，而V1基因(如，gB，gD，Vp16，和大衣壳蛋白，Vp5)的表达则只因病毒DNA复制的抑制而稍微降低。
这些和几项其他研究提示，病毒基因转录和DNA合成是紧密偶联的，或者间接地通过必要酶的调节或者直接随γ2基因进行;因此，干扰病毒转录应当是一种切断病毒DNA复制的有效方法。VP16，ICP4，ICP0，和ICP27是HSV中的主要转录调节因子。VP16作为最早作用的调节蛋白是重要的并促使ICP0，4，和27的表达。ICP4是最具特点的α-蛋白的转录调节因子，它参予α、β和γ基因的向上调节表达。感染的后期，它下调其自身的表达。ICP27是后期基因表达所需要的，而关于ICPO则了解很少。显示出ICP0和ICP27与ICP4共同调节β和γ基因的表达。
如以上所讨论的，单纯疱疹病毒在溶菌感染期间涉及病毒蛋白合成的三个阶段，α，β和γ。不同类病毒基因的协调诱导是通过特异性病毒蛋白在转录起始水平上调节的，即通过反式激活的过程。这些过程通过病毒蛋白、宿主蛋白和DNA的组合的相互作用来完成的。包含在此系列过程中的蛋白质可分为三类反式激活因子，它与结构基因的DNA上游区结合;基本起始因子，它与RNA聚合酶联合;和连接子，它可起桥接反式激活因子和基本因子的作用。对于任何给定的基因，这些蛋白质的组合导致组装的形成，其组装体可随细胞周期、发育阶段或在对激素或其他信号的反应中发生变化。在HSV中，病毒编码的反式激活因子产生单一的含有特异性病毒蛋白质的独特的集合体。在没有病毒蛋白质时，至少在生物学相关条件下这些集合体将不会形成并因此而产生病毒信息的转录。
在图4中，显示VP16与普遍存在的真核转录激活因子，Oct-1(一种称为宿主细胞因子(HCF)但其特征尚明确的因子)，和两种基本转录起始复合体的蛋白，TFⅡD和TFⅡB存在特异地联系。对VP16和Oct-1之突变的结构/功能的研究是广泛的，使此反式激活组装体成为在文献中描述得最详尽的一个。
因为VP16是一种HSV的但不是人的重要反式激活蛋白质，所以干扰VP16功能的药物对于抗病毒治疗是强有力的候选者。本发明提供了鉴定这些侯选药物的有用的高允许量筛选方法。本发明是基于Cell 61∶1199-1208(1990)中所述的及Gill和Ptashne(Nature334∶721-724(1988))的观察结果，即GAL4-VP16融合产物可能被用作转录抑制剂。然而，将这些观察合并在功能的筛选中，需要发展各种试剂。
本发明提供一种对检测测一类抗病毒剂有用的可筛选的细胞群体;因此该抗病毒剂的作用机理还包括干扰病毒的反式激活。在其最广泛的实施方案中，本发明提供一种能够有区别地表达病理诱导特异性反式激活元件的重组细胞。本文中所使用的病毒反式激活这一术语是指具有在转录反式激活中发挥功能的最小的两个区域的蛋白质，其中至少一个为病毒来源的。第一区域(如上文描述的)是所谓的激活区，第二区域(也如上文描述的)是所谓的DNA识别区。
两个区域均可在一种单一的病毒蛋白质如疱疹病毒的ICP4或乳头状瘤病毒的E2上发现。另外，反式激活区和DNA识别区可在两个区域来源的肽上发现。例如HSV VP16代表了不能结合DNA的反式激活区。在自然感染期间，上面描述的VP16与宿主DNA识别区Oct-1联合。本发明期望使用两种类型的反式激活元件。再者，本发明提供了一种嵌合反式激活元件，其中编码一种来源之激活区的遗传信息与编码异种来源之DNA结合区的遗传信息相融合。GAL4.-VP16构建体即是此嵌合元件的一个例子。
不管取用什么形式的反式激活元件，对于有效地筛选来说，重要的是该元件可在重组细胞内有区别地表达，这就是说该元件应该是可调节的，即在限定的条件下能被打开或关闭。换句话说，对于文中公开的筛选系统，元件的构成表达是不适宜的。
可被用来控制反式激活元件表达的各种可调节的启动子是已知的。根据启动子与各种相关调节成分间相互作用的性质，可将启动子分为两大类，即可诱导的或可去阻遏的。可使用任一类启动子或混合类的启动子。有用的启动子包括酵母特别是酿酒酵母的GUP1，GAL1-10，CYC1，或果蝇属特别是52的金属硫因(mefallothionen)。
当然，选择的启动子必须在用于筛选的宿主细胞中发挥功能。有用的宿主细胞包括低级真核藻类、真菌等，以及高级真核生物果蝇和培养的哺乳动物细胞。当然，专业技术人员应选择适当的宿主/启动子组合。
果蝇和酵母是特别优选的。
不管选择什么宿主细胞，重要的是细胞显示出与反式激活元件的表达相对应的可识别的表型，一种常见的表型是细胞生长抑制。尽管不希望被任何特定的理论或对抑制机理的解释所约束，但据信当在重组细胞中表达时，反式激活元件与外源性反式激活因子竞争以得到基本转录组件，从而降低宿主细胞转录和宿主细胞生长的效率。如此的竞争即所谓“转录压制”。
文中所采用的，细胞是在许可的条件下培养的，即在病毒反式激活元件不被表达的条件下培养以提供可筛选的细胞群体。然后改变培养条件而引起反式作用元件的表达。在这些条件下，细胞生长受到抑制。在后一种条件下，使细胞与可能具有能够干扰病毒反式激活元件功能之分子的组合物接触。如果被试验的化合物展示这样一种特性，那么反式激活元件将不能进入具有宿主基本转录组件的非生产性组装集合体(assemblage)，从而解除了生长的抑制作用。尽管在改变为非许可的生长条件后便于使细胞与被试验的组合物相接触，但在实验程序的细胞早期生长阶段有该组合物存在是可能的。
可被筛选的组合物包括各种有机分子，分离的或组合的，或有机分子的复合混合物如来源于天然产物提取物、土壤提取物，以及发酵液者。一旦在一级筛选中鉴定为产生阳性的生长促进反应，然后即可在二级筛选中试验潜在的抗病毒剂而直接确定其对病毒感染之细胞的作用效率。当然，假如试验复合混合物(如天然产物提取物)，可望采用本领域中公知的各种化学和/或物理分离技术处理该混合物，以便已从混合物中分离出活性化合物。在任何纯化过程中，也可采用本文中记载的生物学测定法来监测有用分子的存在。
除本文中公开并要求专利保护的筛选方案外，本发明还包括可调节的病毒反式激活元件和由其转化的重组细胞。本发明范围之内也包括使用已公开的筛选方法鉴定的抗病毒剂。
一种特别有用的筛选体系是利用在酵母CYC1启动子之可调节控制下的GAL4-VP16嵌合反式激活元件。
在CYC1启动子，UAS2UP1控制下的表达GAL4-VP16之酵母菌株的构建GAL4-VP16是一种融合蛋白质(Sadowski，I.et al.，Nature 335∶563-64(1988))，其中单纯疱疹病毒Ⅰ蛋白质，VP16(Triezenberg，S.J.et al.，Genes ＆ Devel.2∶730-742(1988);Greaves and O′Hare，J.Virol.63∶1641-50(1989))的酸性激活区与GAL4(Johnson and Dover，Proc.Nat′L.Acad.Sci.USA 84∶2401-２405(1987))的DNA结合区融合。在这种情况下，将GAL4-VP16从质粒(pJR3)中BamHI片段上切掉并插入pLG265UP1-ATG中(用Xho和Sacl(除去CYC-1 ATG)切割pLG 265UP1(Guarente，L.et al.，Cell 36∶503-511(1984)并插入得自pLGSD5-ATG的Xho-Sac-1片段而制得)。最终构建体含有由在带有URA3标记之2微米质粒上的UAS2UP1的CYC-1驱动表达的GAL4-VP16基因。
然后可按下列的方案用载体转化的酵母细胞筛选感兴趣的抗病毒化合物。最好是使用对由质粒携带的可选择的标志物(如，ura3)呈营养缺陷的，而且是有制霉菌素抗性的酵母菌株，以有助于提高组合物的通透性。
压制分析方案使也是制霉素菌抗性的，携带CYC1驱动之GAL4-VP16的生长在含有2%葡萄糖的合成尿嘧啶液体培养基(Syntheticura-Liqued medium)中。该细胞作为原种贮存在4℃温度下备用。涂布前，将该细胞转移到含有2%棉子糖作为碳源的培养基中并至少培养一个细胞分裂周期。在每次分析中，将8ml上述细胞的悬浮液(A600＝0.1)加于一种装有包含2%乳酸盐(代替2%葡萄糖或棉子糖)之合成尿嘧啶固体培养基的20×20cm2的平板上。制备孔并加入100μl溶于50%DMSO/50%MeOH中的试验样品。在30℃下保温5天后，除那些在含有GAL4-VP16生产抑制剂周围的孔外，大多数细胞停止了生长。可用含有0.5%葡萄糖的孔作为阳性对照。分析的阳性结果应该是在含有活性化合物孔的周围有一酵母菌落环，据此鉴定可作为潜在抗病毒剂的化合物。
合成尿嘧啶培养基的配方0.67%无氨基酸酵母氮基(Difco)2%葡萄糖2%Bacto琼脂(用于固体培养基)20μg/ml菌株需要的适当氨基酸(Leu;His;Trp)
权利要求
1.一种鉴定抗病毒化合物的方法，该方法包括a.在允许细胞生长的第一组培养条件下，培养含有编码生长抑制性病毒反应激活元件的有区别地表达之基因的重组细胞，以提供可筛选之细胞的群体；b.将该细胞转移到使所说元件得以表达的第二组培养条件下以导致生长的抑制；c.使被抑制的细胞与包含可疑为抗病毒化合物的组合物接触；和d.鉴定那些减轻生长抑制的化合物。
2.如权利要求1的方法，其中步骤c的组合物是在步骤a和/或b期间存在的。
3.如权利要求1的方法，其中所说的基因被可操纵地连接在可诱导性启动子上。
4.如权利要求1的方法，其中所说的基因被操纵地连接到去阻遏性启动子上。
5.如权利要求3的方法，其中所说的可诱导性启动子选自CUP1，GAL1，GAL10，和CYC1。
6.如权利要求5的方法，其中所说的可诱导性启动子是CYC-1。
7.如权利要求4的方法，其中所说的去阻遏启动子选自CYC1，GAL1，和GAL10。
8.如权利要求1的方法，其中所说的编码元件的基因包含一个编码激活区的片段和一个编码外源性DNA识别区的片段。
9.如权利要求1的方法，其中所说的编码元件的基因是一种嵌合基因，该基因包含编码病毒激活区的第一片段和融合在编码异种来源之DNA结合区同一读码中的第二片段。
10.如权利要求9的方法，其中所说嵌合基因是GAL4-VP16。
11.一种鉴定抗病毒化合物的方法，该方法包括a.在含有棉子糖作为碳源的营养培养基中，培养包含与酵母CYC1启动子可操纵地连接之嵌合基因GAL4-VP16的质粒的重组酵母细胞;b.将棉子糖中生长的酵母细胞铺敷在含有乳酸盐作为碳源的固体营养培养基上，并保温该细胞以诱导嵌合基因的表达而致酵母细胞生长的抑制;c.将被抑制的酵母细胞与含有潜在病毒抑制剂的组合物接触，并d.根据其促进细胞生长的能力来鉴定所说的抑制剂。
12.如权利要求11的方法，其中所说的保温是在30℃下保温长达约5天。
13.一种按权利要求1的方法鉴定的抗病毒剂。
14.一种按权利要求11的方法鉴定的抗病毒剂。
15.一种分离的DNA分子，其含有一种编码与可调节性启动子可操纵地连接的病毒反式激活元件的基因序列。
16.如权利要求15的DNA分子，其中启动子为诱导性的。
17.如权利要求15的DNA分子，其中所说的元件的基因序列是一种嵌合序列。
18.如权利要求15的DNA分子，其中所说的元件的编码序列是GAL4-VP16且启动子是CYCl。
19.一种含有权利要求15之DNA的质粒。
20.一种用权利要求19的质粒转化的宿主细胞，它能够有区别地表达反向激活元件。
全文摘要
本发明涉及一种新的鉴定潜在抗病毒药物的方法。在筛选中，使用可调节的病毒反式激活元件转化的重组细胞来检测能缓解由被表达之元件引起的抑制作用的分子。本方法可鉴定抑制病毒转录起始的新的化学实体。
文档编号B63C9/26GK1085255SQ9311685
公开日1994年4月13日 申请日期1993年7月23日 优先权日1992年7月14日
发明者S·L·堡格, L·P·加伦蒂, 小·C·P·亨斯利, G·P·穆尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 麻省理工学院