专利名称：一种低温硝化菌剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体地说，它涉及一种耐低温硝化菌剂，该低温硝化菌剂涉及汉堡硝化杆菌Nitrobacter hamburgensis AS1.2729，维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi AS 1.2730，Nitrobactervulgaris AS 1.2775，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS 1.230，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS 1.518，和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeAS 2.412共六种菌株，这些菌株经培养后，按照其培养物同等体积比例配比组成为耐低温硝化菌剂，在较低温度下具有去除超低浓度氨氮的作用，同时还具有一定的去除COD和BOD的作用。与相应的生物反应器适配，适用于一般海水养殖和工厂化循环海水高密度养殖的氨氮去除和COD的去除处理。
背景技术：
海产品的人工养殖在我国的近10年得到了迅猛的发展，养殖品种不断增加，养殖规模不断扩大，极大地丰富了市场和满足了人们对海产品的需求。但在很多方面也造成了一些负面影响。如近岸海域的污染、养殖动物的病害的爆发和流行等。在海水养殖方面，目前国内很多的养殖场和育苗场一般采用换水(流水)的方法，即抽取新鲜海水经过简单的过滤和消毒(冬天还要经过提温)，作为养殖水体，经养殖一定时间(一天或更短)就直接排放，有些地方甚至是上一个养殖场的排水口就是下一个养殖场的抽水口。开放式养殖不仅造成海水资源、和能源的巨大浪费(如冬天的海水提温)，而且污染近岸海域，威胁海洋生态环境和养殖海水资源的匮乏，甚至造成养殖动物的大规模的病害的发生和流行。大规模海水养殖，增加了溶解态和悬浮态物质的输出，在一定程度上可以引起近岸海水的污染，同时被污染的海水也制约了海水养殖的进一步发展，因此开发并采用工厂化循环海水高密度养殖技术正受到广泛重视和应用，对于解决局部海水污染问题和过冬养殖以及节约能源具有重要意义。而要实现循环海水高密度养殖的关键就在于循环海水的保养和处理，这中间的关键又是对养殖循环水中的氨氮的去除处理。一般来说，海水养殖对氨氮浓度都要求严格的限制，养鱼通常要求氨氮浓度低于0.5mg/L(非离子氨浓度低于0.02mg/L)，育苗期间对氨氮的要求更加苛刻，如扇贝育苗要求氨氮浓度低于0.1mg/L。要解决养殖海水的含氨氮问题，目前只有两种办法1)换水；2)氨氮的去除处理。采用换水的方法其弊端和危害如如前所述，在此不作重复，因此它不是解决海水养殖问题的出路，也不符合可持续发展的战略需求，因此必须淘汰这种粗泛式的养殖技术。氨氮的去除处理可以为养殖海水的循环使用提供技术保障，对于减少养殖污染物的排放以及减少对近岸海域的污染、减少或避免养殖动物的病害的发生和流行、减少对养殖养殖水源和能源的浪费等都具有重要意义，同时更是符合可持续发展的战略目标。目前对于养殖海水的氨氮去除处理目前还没有其他方法，唯有生物方法，即生物反应器方法。生物反应器对于消除养殖水体的氮、磷和有机物的高效性已被许多研究成果所证明。Ackefors和Enell报道利用生物反应器和过滤器的组合可以有效去除养殖海水的悬浮物和氮、磷，其悬浮物减少了67～97％，COD减少了13～84％，TN和TP分别减少了4～89％和21～86％。很多因素可以影响生物反应器的效率，如运行条件、工艺及其他一些理化因素，但决定性的因素取决于存在于其中的微生物的数量及其效率的高低。在工厂化循环海水高密度养殖(30kg/m2)或育苗(20个贝苗/mL或以上)中，特别是为了维持冬季养殖和节约能耗，通常维持较低的养殖温度(一般18摄氏度左右)，要求养殖水体较高的循环次数，通常在4～6次/天，而用于去除氨氮处理的生物反应器的总体积为养殖水体总体积的1/10或更小的情况下，每次循环出水的氨氮应达到养殖或育苗的要求，也就是说在较低的温度和水利停留时间在20～30min的时间内要达到50％或更高的氨氮去除效率，因此在工厂化循环海水高密度养殖和育苗海水的氨氮去除处理中的核心技术就是与生物反应器适配的高效硝化菌剂的开发与应用。针对海水养殖中的氨氮处理问题和需求，目前国内外也开发了一些菌剂，如美国的硝化菌剂、丁永良等报道的水族馆净水微生物、吴伟等曾报道的固定化微生物对养殖水体中NH4+-N和NO2--N的转化作用等。这些菌剂虽然具有一定的去除氨氮和净化养殖海水的作用，但都存在着明显的缺点，如美国的硝化菌剂去除氨氮的效率并不能令人满意，此外它的成本太高，还要求经常性的投加，国内的关的海产品养殖业主难以承受，同时该菌剂在温度低于20摄氏度时其去除氨氮的能力和效率明显不能满足要求；水族馆净水微生物和固定化微生物都是实验室的研究结果，离实际应用还有相当的距离，同时他们在低于20摄氏度的条件下其去除氨氮的效率和能力也明显不足。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种与生物反应器适配的耐低温硝化菌剂，能够适应低温条件、水力停留时间短、成本较低的工厂化循环海水高密度养殖水体的超低浓度的氨氮处理。具体地讲，耐低温硝化菌剂是由Nitrobacter hamburgensis AS 1.2729，Nitrobacter winogradskyi AS1.2730，Nitrobacter vulgaris AS 1.2775，Bacillus cereus AS 1.230，Bacilluslicheniformis AS 1.518，和Saccharomyces cerevisiae AS 2.412六种菌株，经过分别培养后，按照其培养物同等体积比例配比组成的一种耐低温硝化菌剂，这六种菌株和其使用的培养基配方均来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。这些菌株单独使用时，虽然在较高氨氮浓度(80～400mg/L)的情况下，具有一定的去除氨氮的能力，但对于超低浓度的氨氮则没有去除效果，无法满足工厂化循环海水高密度养殖水体的超低浓度的氨氮处理。然而，本发明将这六种菌株分别培养后组合成菌剂，由于菌株之间具有协同作用，它们之间可以相互促进、提供和创造良好的生长和发挥作用的条件，可以有效硝化超低浓度的氨氮，清除了养殖水体超低浓度氨氮，产生了与其单独作用意想不到的效果，可以使超低浓度污染氨氮(＜0.5mg/L)的水体得到了净化处理。本发明低温硝化菌剂的制备，首先是按照CGMCC提供的培养基配方将六株菌分别接种于各自的培养基，本发明将培养温度调正为15℃左右进行培养，然后，将它们培养物按等体积混合，成为本发明所述的低温硝化菌剂。该低温硝化菌剂可以硝化的方式以及同化的方式去除水体中的氨氮，尤其适合于具有与本硝化菌剂适配的生物反应器的养殖水体超低浓度氨氮的去除处理，采用低温硝化菌剂直接挂膜或采用扩大培养物挂膜，在扩大培养的同时也可将部分填料放在培养池中挂膜。按5％的量将低温硝化菌剂或扩大培养物加到生物反应器中，如接触氧化反应器、或SBR反应器、或UASB反应器，反应器中装有浸没式填料，挂膜和生物反应器所用材料主要是亲水的低表面势能的高分子聚乙烯、聚乙烯衍生体材料制成的弹性填料、球形填料以及天然植物，如竹片等载体填料，并保证比表面积达到300m2/m3。本发明的低温硝化菌剂具有适应低温(水温15℃)发挥较高效率的去除氨氮的能力，解决较低温度条件下的养殖水体的氨氮处理，使出水达到海产品养殖和育苗的水质要求，实现越冬循环海水养殖和育苗以及常温下工厂化循环海水的高密度养殖和育苗，具有广阔的应用前景。
本发明涉及的技术内容还有菌种的培养上述六株菌种分别接种于由CGMCC提供的培养基，培养基配方培养基配方如下1、用于汉堡硝化杆菌Nitrobacter hamburgensis AS 1.2729，维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi AS 1.2730，Nitrobacter vulgaris AS 1.2775菌株的培养(g/L)硫酸铵2.0，亚硝酸钠1.0，磷酸二氢钠0.25，磷酸氢二钾0.75，硫酸锰0.01，硫酸镁0.03，碳酸钙5.0，蒸馏水或海水1升，pH8.0。
2、用于蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS 1.230，地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis AS 1.518的培养(g/L)蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl5.0，蒸馏水或海水1升，pH8.0。
3、用于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS 2.412的培养12Brix.麦芽汁1升，pH自然。
4、用于蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS 1.230，地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis AS 1.518和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS 2.412菌种的培养(g/L)
硫酸铵2.0，葡萄糖5.0，蛋白胨1.0，酵母粉0.5，蒸馏水或海水1升，pH8.0。
培养温度范围为15℃至20℃，进行摇床200rpm好气培养，对于汉堡硝化杆菌Nitrobacter hamburgensis AS 1.2729，维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi AS 1.2730，Nitrobacter vulgaris AS 1.2775菌种的培养周期为3～4周，对于蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS 1.230，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS 1.518和酿酒酵母Saccharomycescerevisiae AS 2.412菌种的培养周期为1周。
菌种的配伍及低温硝化菌剂的制备六株菌种经过分别培养后，将其各自的培养物按照等体积的比例混合，即制成低温硝化菌剂。由此制成的低温硝化菌剂也可直接用于养殖海水的氨氮去除处理之用。该低温硝化菌剂按5％的接种量接种于人工配制的含氨氮5mg/L的模拟养殖海水中，在25℃条件下摇床培养进行去除氨氮实验，结果，5mg/L的氨氮经50分钟的反应即可被完被全去除。
如图1所示。
扩大培养和挂膜扩大培养现场试验视情况而定是否需要进行扩大培养，若需要扩大培养则使用如下培养基葡萄糖0.5％，碳酸钙0.3％，氯化铵0.5％，蛋白胨0.05％，磷酸盐0.03％，硫酸镁0.01％，海水配制。按10％的接种量接种，曝气培养，夏天室温、冬天控制扩大培养温度20℃，2周为一个培养周期。
挂膜采用低温硝化菌剂直接挂膜或采用扩大培养物挂膜(在扩大培养的同时也可将部分填料放在培养池中挂膜)。按5％的量将低温硝化菌剂或扩大培养物加到生物反应器中(接触氧化反应器、或SBR反应器、或UASB反应器)，反应器中装有浸没式填料(所用材料不限，主要是低表面势能的高分子材料制成的弹性填料、球形填料，天然植物载体填料等)并保证比表面积达到300m2/m3以上，闷曝挂膜2周，使硝化菌剂均匀、充分地附着在载体填料的表面。期间控制溶氧4mg/L左右。
生物处理系统的启动与预运行生物反应器填料挂膜完成后，先控制水力停留时间200min流量进水运行2天，然后逐步均匀加大流量，至预运行2周达到设计流量即控制水力停留时间40min并继续预运行1～2周，期间控制溶氧4mg/L左右并维持氨氮浓度2mg/L左右。
生物处理系统的运行和管理预运行完成后即可进行系统的运行，进行海水养殖或育苗循环水的氨氮去除处理。在海产品的养殖或育苗期间由于溶氧较高，生物处理系统可以不曝气。在运行期间应不定期地往生物反应器中投加适量的碳酸钙，同时最好能每月补充适量的硝化菌剂(生物反应器有效容积的3ppm)，如果处于养殖或育苗间断期，应按预运行方案维持运行。
图1硝化菌剂对模拟养殖海水的氨氮的去除实验结果图2青岛金瀛海洋科技发展有限公司的扇贝育苗场的循环海水生物处理系统的外貌，该生物处理系统的有效容积12m3，为育苗水体的1/10，水力停留时间为40分钟。注解1为初滤池，2为机械过滤装置，3为生物反应器。
具体实施方案为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。
实施例1 硝化菌剂对模拟海水的氨氮去除结果将配制好的低温硝化菌剂按5％的接种量接种于人工配制的含氨氮5mg/L的模拟海水中，在25℃条件下摇床培养进行去除氨氮实验，5mg/L的氨氮经50min的反应即可被完全去除。结果如图3所示。
实施例2 填料挂膜后的模拟小系统运行对氨氮的去除实验低温硝化菌剂按实施方案中的操作在载体填料上挂膜后，在模拟小系统中进行去除氨氮的试验。该模拟小系统的循环海水为3m3，其中的生物反应器有效容积为0.300m3，是循环海水的1/10，生物反应器中所装填料为天然植物载体填料，装填度达到比表面积为100m2/m3，于10月底11月初进行了不同氨氮浓度的去除实验，结果列于表1。
表1 模拟小系统中的氨氮去除实验
从表1可见，在水温较低的情况下，挂膜后的生物反应器在控制水力停留时间为35min对超低浓度的氨氮的去除效率基本稳定维持在55～60％之间，说明具有较高的氨氮去除效率，出水可以达到养殖的要求。实例3硝化菌剂在扇贝育苗循环海水的氨氮去除应用效果在青岛金瀛海洋科技发展有限公司的扇贝育苗场，生物处理系统见图2。进行了现场循环海水育苗试验，在整个育苗周期(约2～3周)都采用循环海水，期间约4天种苗倒池一次。期间检测了生物处理系统的进出水氨氮，结果表明在水温为17℃左右的条件下，进水的氨氮浓度在50～65μg/L，出水的氨氮浓度维持在30μg/L以下，达到了扇贝育苗的要求，保证了扇贝育苗的顺利进行。
权利要求
1.一种由多种菌株组成与挂膜或生物反应器适配的耐低温硝化菌剂，其特征在于耐低温硝化菌剂是由汉堡硝化杆菌Nitrobacterhamburgensis AS 1.2729，维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi AS1.2730，Nitrobacter vulgaris AS 1.2775，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS1.230，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS 1.518，和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS 2.412六种菌株，经过分别培养后，按照其培养物同等体积比例配比均匀混合或将其混合后挂膜或与生物反应器适配组成的一种耐低温硝化菌剂，
2.根据权利要求1所述的耐低温硝化菌剂，其中菌种的培养温度为15℃至20℃。
3.根据权利要求1所述的耐低温硝化菌剂，其中挂膜材料采用亲水低表面势能的高分子材料或天然植物材料。
4.根据权利要求3所述的挂膜材料，低表面势能的高分子材料有聚乙烯、聚乙烯衍生体材料，天然植物材料有竹片。
5.根据权利要求1所述的耐低温硝化菌剂，其中与其适配的生物反应器有接触氧化反应器、或SBR反应器、或UASB反应器。
6.根据权利要求1所述的耐低温硝化菌剂在高密度养殖水体的超低浓度的氨氮处理中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种耐低温硝化菌剂，该低温硝化菌剂涉及汉堡硝化杆菌Nitrobacter hamburgensis AS 1.2729，维氏硝化杆菌Nitrobacterwinogradskyi AS 1.2730，Nitrobactervulgaris AS 1.2775，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus AS 1.230，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS 1.518，和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS 2.412共六种菌株，这些菌株经培养后，按其培养物同等体积比例配比组成为耐低温硝化菌剂，在较低温度下具有去除超低浓度氨氮的作用，单独使用或与相应的生物反应器适配，可用于海水养殖和工厂化循环海水高密度养殖的氨氮去除和COD的去除处理。
文档编号C02F3/34GK1509991SQ0215697
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者刘志培, 贾省芬, 黄志勇, 刘双江 申请人:中国科学院微生物研究所