专利名称：一株硝基苯类污染物高效降解菌及其使用方法
技术领域：
本发明属于污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解硝基苯的细菌菌株(Pseudomonas sp.NJU001)，还涉及该菌株降解硝基苯类污染物的使用方法。
背景技术：
硝基苯是一种重要的化工原料，被广泛应用于制造苯胺、炸药、润滑剂、农药、及香料等的工业生产中。随着人类工业生产的迅猛发展，大量的硝基苯进入到自然环境中 。据估计，每年全世界大概有一万吨以上的硝基苯被排入环境。硝基苯是高毒性物质，被人类皮肤吸收或从呼吸道吸入其蒸汽后，会引起中毒甚至致死，所以它被列于世界《环境优先控制有毒有机污染物》的名单，世界各国对它在工业废水中的合理排放有极其严格的限制。在我国，《工业污水综合排放标准》规定硝基苯的一级排放标准为2ppm，但是在生产过程中经气提装置初步回收后的硝基苯废水的浓度仍然高达100ppm，因此，研究行之有效的硝基苯废水治理方法具有及其重要的现实意义。目前，在治理硝基苯废水的方法中，气提、萃取、吸附和氧化还原等方法均有处理效果差或效果虽好但成本太高的缺点。相比之下，生物降解是处理硝基苯废水的较为经济而有效的方法，但对于高浓度的硝基苯废水，则需要先进行稀释然后才能用生物法处理。如果能培育出耐受高浓度硝基苯的降解菌，直接将它加入到降解体系中，使整个微生物体系对硝基苯的耐受力增强，无疑将大大降低处理费用。从硝基苯的分子结构来看，苯环结构的对称性和稳定性使它不易发生反应，另外，硝基是强吸电子基团，它的存在使化合物的生物降解性更差。直到近20年来，国内外才逐渐有关于降解硝基苯的纯菌株的文献报道。这些菌株分别属于克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)1、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)1，2，3，4、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)1，3、微球菌属(Micrococcussp.)3、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)5、棒状菌属(Corynebacterium sp.)5、链球菌属(Streptococcus sp.)5、丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)6、短杆菌属(Brevibacterium sp.)7等(注1韦朝海等，硝基苯好氧降解的共基质及生物协同作用，中国环境科学，2000，20(3)，241-244页；2Nishino SF et al. Degradationof nitrobenzene by a Pseudomonas pseudoalcaligenes.Appl Environ Microbiol.1993，592520-2525；3马汐平等，硝基苯好氧降解菌的驯化和筛选，辽宁大学学报(自然科学版)，1998，25(4)384-388；4王竞等，假单胞菌JX165及其完整细胞对硝基苯的好氧降解，中国环境科学，2001，21(2)144-147；5刘红果等，硝基苯降解菌的分离、鉴定及其对硝基苯的降解，环境科学与技术，1991，116-17；6Nishino SF et al.Oxidative pathway for the biodegradation of nitrobenzene byComamonas sp.strain JS765.Appl Environ Microbiol.1995，612308-2313；7周大石等，细菌降解硝基苯的研究，卫生研究，1994，23(3)143-146)。在关于这些菌株的文献报道中，硝基苯的初始浓度一般只有100～300ppm，而且它被细菌完全降解所需的时间偏长。对硝基苯的耐受浓度最高的菌株是文献5中的三株菌，都能耐受1000ppm的硝基苯溶液，其中降解率最高的是葡萄球菌属，它能将1000ppm的硝基苯在72h内降解44％，但因为文献未报道具体的接菌浓度，所以不能认为这株菌对硝基苯的降解能力就一定是最强的。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解硝基苯能力强、降解效率高、速率快、易于培养繁殖的细菌及使用方法。
为了实现上述目的，本发明叙述如下本发明所提供的细菌是假单胞菌属的一株，命名为NJU001菌株。通过构建该菌株的基因序列的系统发育树，发现它与Pseudomonas marginalis聚成一群，相似性为73％。虽然菌株NJU001与Pseudomonas marginalis聚为一群，但他们的相似度只有73％，说明这株菌具有独特的遗传特性。
所述菌株取自化工厂下水道底泥和废水处理系统曝气池的活性污泥，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌种的形态特征为菌落形态表现为圆形、白色、隆起、表面湿润光滑、边缘整齐。菌苔浓稠。细菌呈细小的杆状，菌体大小为(1.4μm～4.1μm)×(0.6μm～1.1μm)。其生理生化特征为革兰氏染色阴性，不具运动性，葡萄糖氧化产酸，氧化酶阴性；接触酶阳性；肉汤生长菌膜混浊。它的适宜生长条件为PH＝6.0-7.5；温度为25-35℃；振荡速率大于120r/min。它能以硝基苯为唯一碳源、氮源生长，将其彻底矿化成氨，二氧化碳，水和简单的无机化合物。它能将400ppm的硝基苯在24h内完全降解，对于796.5ppm的硝基苯在100h内也能降解98％。该菌还能以2-氨基苯酚、邻苯二酚、N-苯基羟胺、苯、对硝基甲苯、间二硝基苯、苯胺和苯酚为唯一碳源生长。将该菌株降解硝基苯的培养液直接乙酰化处理，通过GC-MS分析，确定出降解的主要中间产物是2-氨基苯酚，这说明该菌株对硝基苯的降解采用了文献2中报导的还原途径。
使用方法将保存在营养琼脂斜面上的菌种移接到含0.5-2.5g/L蛋白胨的无机盐培养基中，无机盐培养基配方Na2HPO4·12H2O 3.5-4.0g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，NaCl 2.5-3.5g/L，MgSO40.1-0.4g/L；pH6.0-8.0；温度30℃；150r/min摇床培养1～2天，待观察到明显的混浊后，将此培养液按2％v/v转接至100ppm硝基苯无机盐培养基中，同法培养后，再次转接至更高浓度的硝基苯无机盐培养基中，重复这个活化菌种降解能力的过程至它能在24h内将400ppm硝基苯降解完全为止，即可离心收集生长至稳定期的菌体，用无菌无机盐洗两次，制成菌悬液备用。
四
图1为NJU001菌株对不同初始浓度的硝基苯的降解曲线图。
图1中各条曲线代表不同的硝基苯初始浓度-■-236.3mg/l；-●-334.1mg/l；-▲-433.1mg/l；--510.9mg/l；-◆-605.4mg/l； --682.5mg/l；--796.5mg/l。
图2为各降解参数在819.2ppm硝基苯的生物降解过程中的变化曲线图。
各条曲线代表的意义为-■-硝基苯；-□-氨氮；-○-2-氨基苯酚；-●-浊度图3为NJU001菌株对土壤中2-硝基联苯的共代谢降解曲线图。
图4为NJU001菌株对硝基苯和对硝基苯酚的混合体系共代谢降解曲线图。
图4中实线为硝基苯，虚线为对硝基苯酚。
五、具体实施例具体实施例1将OD580nm＝0.367的假单胞菌菌悬液按2％(v/v)接种至不同初始浓度的硝基苯无机盐溶液中，在150r/min，30℃摇床中振荡培养，不同时间取样，在高效液相色谱上测定培养液中硝基苯的残留浓度，计算残留百分率。实验数据见图1，它能将初始浓度为236.3，334.1，433.1，510.9，605.4，682.5ppm的硝基苯分别在12，16，24，28，42，55小时内完全降解，对于796.5ppm的硝基苯在100h内也能降解98％。说明该菌株能耐受高浓度的硝基苯，而且降解能力很强。
具体实施例2将OD580nm＝1.324的假单胞菌菌悬液按2％(v/v)接种至初始浓度为819.2ppm的硝基苯无机盐溶液中，在150r/min，30℃摇床中振荡培养。分别在0h、20h、45h、68h和91h取样，测定底物硝基苯及中间产物2-氨基苯酚的浓度(以高效液相色谱法测)，氨氮含量(以纳氏试剂光度法测)及OD580nm值。如图2所示，91h时819.2ppm的硝基苯能被完全降解，与实施例1相比，降解速率更快，这是因为本例中接菌浓度增大的缘故。随着硝基苯浓度的降低，细菌的浊度逐渐增长，说明硝基苯能给细菌的生长提供碳源，氮源和能源。降解中间产物2-氨基苯酚的浓度从起始的零逐渐增长至68h最高，之后又渐渐降低到不再被检测到，说明它能被NJU001菌继续生物转化为其它物质。91h时有69％的硝基苯被矿化为无机氨，另外31％的硝基苯被转化成2-氨基苯酚之后的带氨基的破环产物。
具体实施例3经人工污染的东北黑土(有机质含量3.35％)每克含2-硝基联苯0.934mg，将它加入到含100ppm的硝基苯无机盐溶液中(土水质量比＝1∶10)，按2％(v/v)接种OD580nm＝1.746的菌悬液，在150r/mmin，30℃摇床中振荡培养。不同时间取样，用甲醇提取水-土两相中的2-硝基联苯，通过高效液相色谱测定提取液中2-硝基联苯的浓度，计算其残留百分率。如图3所示，100ppm的硝基苯在2天内被降解掉98.8％，22天后，2-硝基联苯因为挥发等非生物因素损失了12.6％，接菌系列中它的浓度下降了43.4％，说明NJU001菌能在硝基苯存在下共代谢土壤中的2-硝基联苯。
具体实施例4硝基苯和对硝基苯酚的混合体系中含硝基苯400mg/L、对硝基苯酚25mg/L至100mg/L不等，加入无机盐溶液，按2％(v/v)接种OD580nm＝1.514的菌悬液，在150r/min，30℃摇床中振荡培养。不同时间取样，通过高效液相色谱测定提取液中硝基苯和对硝基苯酚的浓度，计算其残留百分率。如图4所示，含对硝基苯酚25mg/L的混合体系中硝基苯和对硝基苯酚在3天内完全降解，含对硝基苯酚50mg/L和100mg/L的混合体系中，硝基苯完全降解，对硝基苯酚降解率也分别达到41.2％和23.9％，说明NJU001菌能在硝基苯存在下共代谢混合体系中的对硝基苯酚。
权利要求
1.一种高效降解硝基苯的细菌菌株的应用方法，其特征在于将保存在营养琼脂斜面上的菌种移接到含0.5-2.5g/L蛋白胨的无机盐培养基中，无机盐培养基配方Na2HPO4·12H2O 3.5-4.0g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，NaCl 2.5-3.5g/L，MgSO40.1-0.4g/L；pH6.0-8.0；温度30℃；150r/min摇床培养1～2天，待观察到明显的混浊后，将此培养液按2％v/v转接至100ppm硝基苯无机盐培养基中，同法培养后，再次转接至更高浓度的硝基苯无机盐培养基中，重复这个活化菌种降解能力的过程至它能在24h内将400ppm硝基苯降解完全为止，即可离心收集生长至稳定期的菌体，用无菌无机盐洗两次，制成菌悬液备用。
2.一种高效降解硝基苯的细菌菌株的应用，其特征在于菌株的使用范围包括含硝基苯类化合物废水的处理和硝基苯类化合物污染土壤的处理；硝基苯类污染物是硝基苯、硝基联苯、硝基苯酚。
全文摘要
本发明属于污染物生物处理技术领域，具体涉及一种高效降解硝基苯类污染物的细菌及其使用方法。所用菌株为革兰氏阴性菌，经鉴定属于假单胞菌属。该菌株的主要形态特征为菌体呈细小的杆状，大小为(1.4μm～4.1μm)×(0.6μm～1.1μm)。它能以硝基苯为唯一碳源、氮源和能源，能将433.1ppm的硝基苯在24h内完全降解，对于796.5ppm的硝基苯在100h内也能降解98％。该菌株的使用范围包括含硝基苯类化合物废水的处理和硝基苯类化合物污染土壤的处理。
文档编号C02F3/32GK1570079SQ20031010641
公开日2005年1月26日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者高士祥, 邵云, 王灿, 蔡邦成 申请人:南京大学