用于从制革厂废水中除去总溶解固体(tds)的细菌菌株的制作方法

专利名称：用于从制革厂废水中除去总溶解固体(tds)的细菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及用于从未经处理的和经电浮法处理的(electrofloated)制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平、保藏号为MTCC 6091的细胞菌株，涉及用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的菌株接种物的制备方法和使用所述菌株从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的需氧方法。
背景技术：
和现有技术文献含有有害化合物的废水排放到自然环境中严重地造成了生物积累性和顽抗性污染物的积累是众所周知的事实。制革工业因其固体和液体废物造成的高污染被称为“红色工业”。尽管努力控制，但其产生通常在环境中积累的废物。因此我们的环境处在来自由皮革工业产生的固体和液体废物不断增加的压力之下。
皮革加工和生产涉及多种侵害性化学药品，同时也消耗大量的水，其中大约90％的水作为废水被排放掉。制革厂废水是皮革的生物来源物质和制革过程中加入的大量有机和无机化学药品的复杂混合物。化学药品例如硫化物、硫酸盐、酸、碱金属、废卤化和非卤化有机溶剂和铬被用于加工和生产皮革。所有这些化合物以一些形式或其它形式出现在排放物中，导致废水中总溶解固体(TDS)含量的总体增加，所述废水由有机和无机组分组成(M.Bosinic等人，2000)。制革厂废水中的污染物也包括对所述废水中TDS水平也有贡献的易腐烂的有机物质、硫化物、Ca、Na、K、Cr的盐和碱、各种酚、有机酸、醛、胺、防腐剂等(Kadam，1990；Ramanujam，R.A.，1995)。许多这类无机离子和有机化合物是生物可利用的。然而其中一些保持着惰性并且对总体毒性载量有贡献。
在未加工材料的保存过程中使用氯化钠是造成制革厂废水中高TDS水平的主要原因。绝大部分高质量的未加工皮革和皮毛是通过使用相当于未加工皮革/皮毛的重量30-50％的普通食盐进行盐渍处理保存的。这是最普便使用的保存方法因为-通过干燥保存限于气候温暖而盐和能量资源昂贵的国家。
-皮革和皮毛的鲜加工需要在未加工材料的质量和数量上有恒定的来源。
-通过冷藏皮革或皮毛的保存只在能源廉价并且屠宰设备已经配备了合适冷却设备的国家可行。
-其它防腐化学药品适合短期保存但不适合长期保存。
除了保存，一些氯化钠也是制革前的腌渍程序所必需的。制革厂的其它加工单元，即浸泡、浸灰-脱灰、软化和脱脂也对总TDS载量有贡献，因为各单元排放含有无机组分如硫酸盐、硫化物、碳酸盐、碳酸氢盐和钙的废水。一些有机组分如肽片断、鞣质和酚类也会被流放出来。
制革厂废水和被处理废水的有机载量的特征通常在于其化学需氧量(COD)和生物化学需氧量(BOD)。目前，仍然缺乏制革厂废水及其处理的有机载量更详细研究(Rudolf，1997)。不过重要参数如TDS通常是不容忽视的。这主要是由于缺乏用于减少该污染物组份的行之有效的技术。所述制革厂废水中的TDS浓度可高达7,000mgl-1，这是令人观关注的事情，因为高TDS载量可产生各种问题。
总溶解固体(TDS)告诉我们可能在许多情况下保持稳定并导致累积毒性效应的有机和无机溶解性化合物的量(Genschow等人，1996)。无机溶解性固体的主要成份包括钙、镁、钠、钾、碳酸氢盐、硫酸盐、氯化物等的离子。溶解的无机固体对某些水生生物体的体内平衡是很重要的。溶解固体量的改变可以是有害的，因为TDS的密度决定进出水生生物细胞的水流。
高浓度的TDS可降低水的清澈度导致光合作用的降低并且当加入有毒化合物和重金属时，导致温度的增加。这对许多水生生物形式经常可以是有害的。
TDS不仅改变水的质量还带来污染。2100mg/l的量是按EPA标准所允许的水中TDS的极限。然而，该极限似乎没有足够严格到考虑到超过1200mg/l的TDS可对水生系统和人产生毒害。对于饮用水EPA已设立了500mg/l的上限。因此，尽管在废水中可允许的TDS水平相当高，由于缺少行之有效的方法用于减少TDS，上面提到的在水中的水平是允许被排放的。废水处理消除了大部分悬浮的固体、大量的溶解性有机物和几乎对TDS无任何影响的氮。
常用的TDS减少技术包括物理化学处理方法。其中一些方法为反渗透(RO)法，电渗析反转(EDR)、冰冻和蒸馏以及离子交换。
A)反渗透(RO)方法RO方法是一种膜分离方法，其中在压力下加入水让其沿着膜表面流动。被纯化的水穿透所述膜并被收集，而含有不能流过所述膜的溶解和未溶解材料的浓缩水被排放到排水沟或倾倒在地表面，因而也污染了地下水。该技术涉及高成本的操作和维持并且目前只用于从饮用水中除去TDS。
B)电透析反转(EDR)该方法使用半透膜，其中作为直流电对离子吸引力的结果，离子通过所述膜从不甚浓缩的溶液迁移到更为浓缩的溶液中。除了要求高能输入外，该方法不适合于高水平的某些金属离子并且被限制应用在具有低于3000mg/l TDS的水中。所述积累的固体的处置问题也是其应用于工业废水的不利因素。
C)冰冻和蒸馏可用于较高浓度的TDS，如在海水或含盐的水(大于3000mg/l)中所见到的。
D)离子交换该技术是基于在不同离子交换基质之间的选择性离子交换。然而，其应用限于更低TDS浓度。
因此，生物学处理方法是极其重要的，因为其不会如物理化学处理方法(Bajpai等人，1994)在不利地影响环境的情况下起作用，所述物理化学方法在工业上使用也具有经济负担，因为其执行要求昂贵的基础设施和维持费用。此外，这类组分以一些其它形式在一些其它地点的积累问题是另一个可通过使用生物处理方法克服的至关重要的缺点。因此，通向解决上述问题的最好的可能途径是设计用于减少TDS水平的生物学方法。
由于制革工业使用了大量的水并且含有相当大量的总溶解固体，从而使得所述水耐受降解，此刻所需要的是选择并改造用于减少来自制革厂废水的TDS的微生物(Kapoor等人，1998，Kumar等人，1998)。因此，本发明者强调需要从自然环境中分离能降低废水中TDS水平的细菌。最初，对细菌聚生体(consortia)进行研究但后来观察到单一细菌同样也能与细菌聚生体具有一样的功能。
发明目的本发明的主要目的是分离用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的细菌菌株。
本发明另一个主要目的是分离用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的细菌。
而本发明的另一个目的是发展使用菌株B5(保藏号5097)降低制革厂废水中总溶解固体(TDS)的需氧方法。
还有另一个本发明目的是确定废水对生物量的比例以在减少TDS中获得最优的结果。
发明概述本发明涉及用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的保藏号为MTCC 5097的细菌菌株、制备通过用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的菌株接种物的方法和使用所述菌株减少来自制革厂废水的总溶解固体(TDS)的需氧方法。
发明详述本发明涉及用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的保藏号为MTCC 5097的细菌菌株、制备用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的所述菌株接种物的方法和使用所述菌株从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)的需氧方法。
在本发明的一个实施方案中，其中保藏号MTCC 5097的细菌菌株用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平。
而在本发明另一个实施方案中，其中制备用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的上述菌株的接种物的方法，所述方法包括步骤a)分离所述菌株，b)在包含土壤提取物和营养琼脂的营养琼脂培养基上培养所述菌株以获得纯培养物，c)将所述菌株接种到营养肉汤中以获得起始培养物，d)将所述起始培养物在大约37℃下，优选地在100rpm下温育大约16-18小时，e)用所述起始培养物接种营养肉汤直至达到1.0的光密度，f)从所述培养物中收获所述细胞以得到沉淀，g)通过将所述沉淀溶解在0.05M pH6.8的磷酸盐缓冲液中对其进行洗涤，h)离心所述经洗涤的沉淀，i)将所述洗涤过的沉淀溶解在最少量的废水中，并且j)使所述溶解的沉淀匀浆以获得准备用于从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的细胞浆液。
在本发明的另一个实施方案中，其中在大约37+/-2℃下于琼脂培养基中培养所述菌株大约16-24小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中营养肉肠包含大约5.0g动物组织的胃酶消化液、大约5.0g氯化钠、大约1.5g牛肉膏和大约0.2mlTween-80。
在本发明的另一个实施方案中，其中将所得的培养物于大约4℃下以大约6000rpm持续离心约20分钟。
在本发明的另一个实施方案中，其中通过将所得沉淀溶解在浓度0.05M和pH6.8的PO4-3缓冲液中进行洗涤。
在本发明的另一个实施方案中，其中使用权利要求1的保藏号5097的菌株来从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)的需氧方法，所述方法包括步骤a)用所述菌株接种所述废水以获得细胞浆液，b)于大约37℃下以大约100rpm温育所述细胞浆液，c)使用修改的APHA方法估测TDS水平，在本发明的另一个实施方案中，其中废水与生物量的比例在1∶3到3∶1之间的范围内变动(很好地确定)。
在本发明的另一个实施方案中，其中废水与生物量的比例是大约1∶1。
在本发明的另一个实施方案中，其中制革厂废水是未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述菌株在大约24小时的持续时间内在未经处理的制革厂废水中显示约8.5的TDS百分比减少。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述菌株在大约48小时的持续时间内在未经处理的制革厂废水中显示约8.3的TDS百分比减少。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述菌株在大约24小时的持续时间内在电浮法处理的制革厂废水中显示约11的TDS百分比减少。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述菌株在大约48小时的持续时间内在电浮法处理的制革厂废水中显示约10.7的TDS百分比减少。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述废水的pH为大约7.0。
本申请的菌株于2003年3月5日保存在微生物典型培养物中心(Microbial Type Culture Collection)(MTCC)，保藏号为MTCC5097。本申请的保藏单位位于印度的Chandigarh。近年来，其被授予布达佩斯条约的国际保藏单位的地位。
如临时专利中所描述的，在预备实验中细菌聚生体在15天时间内能够减少约16％的制革厂废水总溶解固体(TDS)。然而，后来进行研究以减少相同实验的持续天数。该研究通过单一细菌分离物在48小时的时间内导致电浮法处理的制革厂废水的TDS水平下降约11％，在所述未经处理废水中降低约8.0％的结果，所述结果无疑优于更早前公开的所述聚生体的15天持续时间。因此，在所述完整的专利说明书中，已展现了通过使用单一细菌分离物获得的结果；所述结果明显优于通过所述细菌聚生体获得的。
本发明提供了用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)的新的需氧生物学方法。同时也公开了从富含盐例如硫酸盐，碳酸盐，氯化物，硝酸盐等的特殊地点(土壤)中分离的菌株。所述公开的分离物显著地从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平。本发明也提供了修改的标准TDS分析方法。
本发明提供了用于减少制革厂废水中TDS水平的新的需氧方法和修改的用于TDS分析的方法。同时公开的还有能够显著减少电浮法处理的和未经处理制革厂废水中TDS载量的需氧细菌分离物。
本发明涉及通过使用细菌分离物从制革厂废水中减少TDS水平的新的需氧方法和修改的用于TDS分析的方法。
本发明中的细菌分离物被用于减少制革厂废水中TDS水平。
本发明中的细菌分离物已从获自制革厂废水处理厂的干燥倾倒废物的土壤中分离出来。
将来自上述地点的5g新鲜取样土壤接种到加富培养基上。通过加入200ml具有1.3gm营养肉汤和67μl的Candid B制备加富培养基，在15lbs下于121℃灭菌20分钟。
土壤提取物从采集自各场地的固体废物中制备。将1kg所述固体废物于50℃干燥48小时直至极少湿气保留，类似于园艺土壤。
将400gm来自各场地的干燥固体废物连同960ml单蒸水在15lbs下灭菌1小时。灭菌后，将所述样品在5℃下以5000rpm离心10分钟。收集上清液(提取物)并贮存在无菌容器中以制备用于分离的培养基。
将浓缩的土壤样品在Na2HPO4-NaH2PO4(pH6.8，0.05M)缓冲液中进行系列稀释。将100μl各个稀释物以双份涂布在具有各种不同浓度土壤提取物和营养琼脂的培养皿中。将由此获得的培养皿于37±2℃下倒置温育16-24小时。
将单个分离的菌落挑出并在含有相同培养基的新鲜平板上划线。重复上述步骤直至获得纯克隆。
用灭菌的镍铬耐热合金环将上述细菌分离物接种到15-20ml含有(每升)5.0g动物组织的胃酶消化液、5.0g氯化钠、1.5g牛肉膏、1.5g酵母提取物和0.2ml Tween-80的无菌营养肉汤(NB)中。将所述培养物于37℃下在震荡培养器中温育约16-18小时。为了温和地摇动，将所述震荡培养器保持合适的rpm，优选地100rpm。在获得充分生长后，将所述营养液贮存在4℃直至进一步使用。用250μl上面制备的起始培养物接种250ml无菌NB。将培养瓶保持在37℃/100rpm条件下温育16-18小时直至光密度(650nm)达到1.0。
通过以合适rpm，优选地6000rpm离心20分钟收获所述细胞。通过将所获得的沉淀溶解在最小量的0.05M pH6.8的磷酸盐缓冲液中并在相同rpm和时间条件下再离心的方式将其洗涤两次。在离心过程中，温度保持在4℃。将由此获得的沉淀用最小体积的各自废水洗涤并且重新离心以将缓冲液盐份进入所述样品的任何机会减少到最小，因而减少通过其造成的任何增加总溶解盐份的机会。接着将由此获得的沉淀悬浮于最小体积的各自废水中涡流振荡以形成均匀悬浮液并应用于减少来自所制革厂的TDS。
在本发明中对未经处理的和经电浮法处理的废水都进行减少TDS的处理。为建立TDS减少实验，将250ml样品装入螺丝拧紧封口的圆锥型振荡烧瓶中。在检查所述废水的pH达到优选的7.0左右后向废水样品中加入所述接种物。同时也保持不加入任何接种物的对照烧瓶以便比较。所述烧瓶于37℃/100rpm下温育24小时。
为估量TDS水平的减少，对标准APHA方法进行修改。取出约70ml并作处理以进行分析。将所述取出的样品以7000rpm在干燥和干净的离心管(用三蒸水漂洗的)中优选地在4℃下离心20分钟。立即将所述上清液收集在预先用三蒸水漂洗过的干净和干燥的容器中。然后将所述上清液通过0.45μ的薄膜滤器(Milipore)进行过滤。接着用干净和预先漂洗过的量筒测取25ml该滤液并转移至清洗过的、干燥过夜的、干燥和预先称重的烧杯中。再次用20ml三蒸水漂洗量筒并同样转移至含有所述样品的烧杯中。重复相同过程以处理所有样品。然后将所述烧杯在180±2℃的热空气烤箱中进行干燥。干燥后，将所述烧杯转移至真空干燥器中并冷却约45分钟到1小时以达到室温并称重。
使用下列公式计算TDS(mg/l)TDS(mg/l)＝(A-B)/样品体积其中，A＝具有干燥滤液的烧杯终重量B＝无样品烧杯的起始重量本发明进一步提供了用于制备所述细菌(MTCC 5097)分离物并用其从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TSD)的方法，所述方法包括a)从采集自制革厂废水处理厂的倾倒废物土壤中分离细菌分离物；b)在含有不同浓度来自所述采集土壤制备的土壤提取物的营养琼脂培养基中培养所述细菌分离物以获得纯的培养物；c)将所述细菌分离物接种在含有0.01％Tween 80的营养肉汤中以获得起始培养物。
d)通过用所述起始培养物接种合适的营养肉汤等份试样并于37℃/100rpm在上述培养基上温育16-18小时培养上述细菌分离物以获得所需的生物量；e)在达到1.0的光密度后将所得的培养物离心获得沉淀，通过将所述收集的沉淀溶解在0.05M pH6.8的PO4-3缓冲液中然后再离心沉淀对其进行洗涤；f)收集从步骤(e)获得的所述沉淀，通过将其溶解在10ml各废水中并重新离心以获得用于处理可行性研究的细胞沉淀g)将上面形成的沉淀溶解在最小体积的各废水中并通过涡流振荡均匀化以获得细胞浆液；h)用获自步骤(g)中的细胞浆液接种合适的制革厂废水等份试样以进行TDS减少研究，所述研究伴有不含任何添加接种物的废水样品的对照烧瓶。
i)在37℃/100rpm下将设置于步骤(h)的烧瓶温育24小时；j)从上述烧瓶中以70ml等份试样取出样品并对其进行处理以估量TDS水平；k)使用如(1)中所描述的改良的APHA方法分析上述样品中的TDS；l)将上述样品以8000rpm离心20分钟并将上清液通过0.45μ薄膜滤器(Millipore)进行过滤然后使用该滤液估量干重。
m)24小时后通过与对照样品中的TDS水平比较分析上面所述细菌分离物的TDS消除效率。
在本发明的实施方案中，所述细菌分离物是在确定的培养上从采集自制革厂废水处理厂的倾倒废物土壤中分离出来的。
在本发明的另一实施方案中，将上述细菌分离物接种到含有0.01％Tween 80的营养肉汤中以获得起始培养物。
在本发明的另一实施方案中，通过用起始培养物接种营养肉汤制备所述细菌分离物的培养物。
在本发明的另一实施方案中，通过以100rpm的温和搅动对所述菌株进行温育。
在本发明的另一实施方案中，将所述温育的菌株在37℃的温度下培养16-18小时。
在本发明的另一实施方案中，在达到约1.0的光密度后，将所述细菌分离物以合适的rpm优选地6000rpm于4℃下离心约20分钟。
在本发明的进一步实施方案中，将所得到的沉淀溶解在最少量的0.05M，pH 6.8的磷酸盐缓冲液中并用相同的rpm和时间条件离心以洗涤所述沉淀。在离心过程中，温度保持在4℃。
在本发明的进一步实施方案中，通过将所述由此获得的沉淀溶解在10ml废水中并在如前述的相同条件下离心的方式对所述沉淀进行洗涤。
在本发明的实施方案中，将所得到的沉淀重新悬浮于最小体积的废水中并进行涡流振动以形成均匀的悬浮液。
在本发明的实施方案中，将上面得到的细胞浆液用于接种所述废水样品以减少TDS。
本发明进一步提供用于减少来自未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水样品的TDS水平的方法。
在本发明的另一实施方案，将所述含有上述接种物的烧瓶于37℃以120rpm温育24小时。
在本发明的另一实施方案，用下面实施方案中所述的修改的APHA方法分析上述样品中的TDS；在本发明的进一步实施方案中，将上述样品以8000rpm离心20分钟。
在本发明的另一实施方案中，将所述上清液通过0.45μ薄膜滤器(Millipore)进行过滤然后用于估量干重。
在本发明的进一步实施方案中，经24小时观察总溶解固体水平的下降。
如临时专利中所描述的，在预备实验中所述细菌聚生体在15天内可减少约16％的制革厂废水总溶解固体(TDS)水平。另外，后来进行研究以减少相同实验的持续天数。该研究通过单一细菌分离物在48小时的时间内导致电浮法处理的制革厂废水TDS水平下降约11％和在所述未经处理废水中降低约8.0％的结果，所述结果无疑优于更早前公开的使用所述聚生体的15天持续时间。因此，在完整的专利说明书中，已展示了通过使用所述单一细菌培养物所获得的结果；所述结果明显优于通过所述细菌聚生体获得的结果。
本发明的菌株保存在国际保藏单位中。保藏号为MTCC 5097。本发明的贮藏库位于印度的Chandigarh，称为微生物典型培养物中心(MTCC)。近年来，其依布达佩斯条约被赋予国际保藏单位的地位。
上述发明利用少数几个实施例来验证说明之。这些实施例只是用作说明性的而不应该被认为是限制本发明范围的。
实施例I从制革厂的共同废水处理厂的未经处理和电浮法处理的废水中分离细菌。检查所述废水的pH并发现未经处理废水的为7.0±0.2和电浮法处理的废水的为8.3±0.2，用1N HCl中和所述废水。用于分离的不同培养基是培养基A将带有琼脂的经过滤和灭菌的废水用作培养基。使用2％琼脂制备废水琼脂培养皿。
培养基B嗜盐培养基所使用的具有不同NaCl浓度(即1％、2.5％、5％和10％)的嗜盐培养基的组成如下KCl 2gMgSO4.7H2O 20g柠檬酸三钠 3g酵母提取物(Oxoid) 10g酪蛋白水解物7.5gFeCl2.4H2O 36mgMnCl2.4H2O 0.36mgpH 7.0±0.2琼脂2％通过将所述浓缩接种物系列稀释至10-12的稀释度来进行系列稀释涂板。通过取出9ml等份的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.8，0.05M)并且在第一个小瓶中加入1ml浓缩接种物，涡流振荡并从该小瓶中取出1ml加到下一个小瓶中进行稀释，直至获得10-12的稀释度来进行系列稀释。
按三份重字样本将100μl各稀释物进行平板涂布、倾倒平板和以菌环划线于不同琼脂培养基上。将由此获得的平板颠倒放置于37+2℃下温育16-24小时。
对具有不同形态的菌落进行相应的标记，挑出并划线到相应的培养皿中以获得纯培养物。将所述纯培养物保持在各自的斜面和穿刺上，于4℃下保存等待进一步用于实验。
选择出15个形态学上有差异的细菌分离物并制备起始培养物。取出菌环量的培养物并接种在灭菌的营养肉汤等份中，涡流振荡并保持在37℃/120rpm下温育16-18小时。检查这些起始培养物在650nm的光密度并保存在4℃下等待进一步使用。制备工作培养物以筛选其降低电浮法处理的制革厂废水总溶解固体的能力。用100μl各起始培养物接种100ml灭菌NB等份并在37℃/120rpm下温育16-18小时。记录起始和最终650nm的光密度。按照所述聚生体的组成以相同比例取出OD650为2.0的培养物并混合在一起。以7000rpm于4℃下离心所得的细菌悬浮液20分钟。用无菌磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.8，0.05M)将获得的沉淀洗涤两遍并且重新悬浮于很小体积的相同缓冲液中。然后将该悬浮液以1∶1的比例进行处理可能性测定，即用从100ml培养基中获得的沉淀处理100ml废水样品。
在圆锥形振荡烧瓶中于37℃以120rpm对电浮法处理的废水的大量(batch)培养物样品中进行为期15天的所述TDS减少实验。也维持着无任何添加接种物的对照烧瓶并且将结果与这些样品对比。根据APHA中所述的标准方法对15天内的TDS进行分析。观察到TDS水平随加入的生物量上升，这可能是由于穿过GFC滤器(孔径大小1.2μ)细菌的通过造成的，因此对所获残留物重量作出贡献(表1)。因此在所有将来的实验中对所述分析方法进行修改。
实施例II再次制备所述细菌聚生体并用于检查其降低电浮法处理的制革厂废水TDS的功效，通过使用如进一步所述的修改版的标准APHA方法。将所述单个包含所述聚生体的细菌培养在合适的NB等份试样中直至O.D.650为1.0。以实施例I中所述的相同方式制备所述细菌聚生体。用所述制备的聚生体以1∶1的比例处理100ml等份试样。通过下面描述的修改的标准APHA方法对15天内TDS水平进行分析。
以合适的等份取出所述样品并以7000rpm离心20分钟。然后将所述上清液通过0.45μ(Millipore)滤器。然后用干净、预先漂洗的量筒测量所述滤液并转移至干净、预先称重的烧杯中。在转移所述样品前预先称重时，所述烧杯已用三蒸水预先漂洗，在180℃烘烤过夜，干燥。接着将含有所述样品的烧杯置于热空气烘箱中于180℃下干燥过夜。然后将所述烧杯干燥以冷却到室温并称重以计算残留物的重量。接着进行同样的计算以发现实际TDS值，用mg/l(表2)表示。15天后在电浮法处理的样品中记录到超过4％的最大TDS减少。
实施例III由于TDS的减少甚至在15天后仍非常低，所以从加灰处理的洗涤水中分离细菌。通过使用实施例I中所描述的稀释涂板方法在营养琼脂板上分离细菌。将分离物作为斜面培养物和穿刺培养物贮存在4℃下直至进一步使用。
以如实施例1中所描述的相同方法用这些细菌分离物配制三种不同的聚生体并筛选其减少来自电浮法处理的制革厂废水的TDS的能力。通过实施例II中所描述的修改的TDS分析方法分析样品中TDS的水平。15天后观察到13-16％的百分比减少。
实施例IV将实施例III中所使用的来自所述聚生体的单一细菌重新组合以形成如前面所述的不同聚生体并筛选其减少未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中TDS的能力。更早前的聚生体在15天后显示TDS减少13-16％。因此，为了减少持续时间同时也想知道通过配制新的聚生体是否可以获得更好的表现。
以如实施例III中所描述的相同方式连同其对照一起设立实验并且在五天内进行分析。在电浮法处理的样品中观察到高达8％的百分比减少(表4b)而在未经处理的废水中高达5％(表4a)。
实施例V选择产生超过7.0％和超过4.5％TDS减少的聚生体并单个地筛选组成的细菌分离物。根据实施例II中所描述的相同方法制备所述单独的细菌沉淀。不过，通过用磷酸缓冲液(0.05M，pH 6.8)对其进行第一次洗涤和通过将所述磷酸缓冲液洗涤过的沉淀悬浮在10ml各废水中进行最后的洗涤来对所述细胞进行洗涤。接着将所述悬浮液以7000rpm离心20分钟并将所获得的细胞悬浮在最小量所述废水中以用于接种适合等份的未经处理和电浮法处理的制革厂废水。在5天的时间内观察到分离物ET7在电浮法处理的样品中产生高达9.0％的百分比减少(表5b)而在未经处理废水中高达7.0％(表5a)。
实施例VI为了进一步提高TDS减少效率，决定从采自制革厂废水处理厂不同位置的不同样品中分离细菌。选择来自8个不同位置的固体废物，在所述位置收集了从兽皮到皮革的加工过程中产生的废水。所述如位置如下位置A倾倒的废物[废水处理厂的淤泥和其它废物的堆积场]位置B旧池废物[更早前用于收集来自铬鞣皮、染色和加灰漂洗水的废水的场地]。
位置C灰处理废物[皮革灰处理后收集废水和固体废物的场地]。
位置D公共废水[来自所有皮革加工过程即从铬鞣革、染色和灰处理加工的固体废物和废水存放的池子]。
位置E铬废物[在铬鞣革后收集废水的场地]。
位置F淤泥(制革厂的废水处理厂)。
位置G染色废物(皮革染色后收集废水的池子)。
位置H铬和染色废物(铬鞣革和染色后收集废水的池子)。
从来自各位置采集的固体中制备提取物。将1kg各固体废物于50℃下干燥48小时直至保留非常少量的湿气并且达到与园艺土壤相似的粘度。将400gm上述各干燥固体废物与960ml单蒸水一起在15psi下灭菌1小时。灭菌后，以6000rpm于5℃下将样品离心10分钟。收集上清液(提取物)并贮存在无菌容器中用于制备不同培养基。
通过向200ml来自各位置的各自提取物中加入1.3gm营养肉汤和67μl Candid B、在15lbs下于121℃灭菌20分钟制备浓缩培养基。加入5gms来自各位置的新鲜土壤并且将所述培养基以120rpm于37℃温育48小时。
将浓缩的土壤样品在Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.8，0.05M)中进行系列稀释。将100μl各自分别的稀释物成双份涂布在培养基平板上，所述培养基具有来自各自位置、不同浓度的提取物和营养肉汤(培养基A营养琼脂，培养基B具有2％琼脂的土壤提取物(200ml)+1.3gm营养肉汤，培养基C具有2％琼脂的土壤提取物)。将由此所得的平板颠倒放置于37±2℃下温育16-24小时。
挑出具有不同形态的菌落并划线于各自的培养基平板上以获得纯培养物。将纯培养物维持在各自的斜面和穿刺上并保存在4℃等待进一步使用。
获得136个细菌培养物并且设计聚生体以筛选其减少来自电浮法处理的和未经处理制革厂废水的TDS的功效。以前面实施例中描述的相同方式制备所述聚生体并且以如实施例I中所描述的1∶1废水∶生物量比例进行接种。在48小时内通过实施II中所描述的修改的TDS分析方法对所述样品进行分析。
与在实施例IV和V中展示的在5天后观察的类似减少相比，在48小时内观察到在电浮法处理的制革厂废水中高达9.0％的百分比减少(表6b)和在未经处理制革厂废水中高达7％的百分比减少(表6a)。
实施例VII据猜测生长在富含氯化物、硫酸盐和硝酸盐位置的细菌是TDS贡献组分的更佳降解者。因此，从富含上述盐的位置收集土壤样本并且用各种培养基从上述样品中分离细菌。
在下列培养基(每升的组分)中进行所述细菌群落的浓缩培养基A培养基A的组分如下溶液A980ml溶液B10ml溶液C10ml溶液A(每1000ml蒸馏水)由KNO3(5.0g)、(NH4)2SO4(1.0g)、K2HPO4.3H2O(0.87g)、KH2PO4(0.54g)和葡萄糖(4.0g)组成。溶液B通过加入2g/100ml MgSO4.7H2O制备和溶液C通过每100ml 0.1NHCl溶解下列盐制备，即CaCl2.2H2O(0.2g)、FeSO4.7H2O(0.1g)、MnSO4.H2O(0.05g)、CuSO4.5H2O(0.01g)、Na2MoO4.2H2O(0.01g)。将所有上述溶液于121℃在15psi下灭菌15分钟并冷却到25℃。然后将这些在无菌条件下混合并用于浓缩和分离细菌。
培养基B使用不同NaCl百分比，即，1.0、2.5、5.0、10.0和12.5制备该培养基。其它的组分是(每升蒸馏水)MgCl2.6H2O(50.0g)、K2SO4(5.0g)、CaCl2.6H2O(0.2g)、胰化蛋白胨(5.0g)和酵母提取物(5.0g)。将所述培养基于121℃在15psi下灭菌15分钟并冷却到25℃并用于浓缩和分离细菌。
培养基C制备含有(每升蒸馏水)5.0g动物组织胃酶消化液、5.0g氯化钠、1.5g牛肉膏、1.5g酵母提取物和0.2ml Tween-80的营养肉汤培养基，对其进行灭菌并用于浓缩和分离细菌。
于37℃在7天时间内进行浓缩。如更早前所描述的对细菌进行分离并将所获得的纯的培养物贮存在4℃下直至进一步使用。
将分离的细菌单个地培养和配制成前面所描述的聚生体并用于筛选其减少电浮法处理的和未经处理废水TDS的能力。在48小时的时间内，根据实施例II中所述的修改的TDS分析方法对TDS进行分析(表7a和7b)。在电浮法处理的废水中观察到聚生体EDK2产生高达9.3％的减少而在未经处理废水中聚生体RDK3和RDK5产生高达5.5％的减少。
实施例VIII对组成实施例VI中最优表现的细菌聚生体的单一细菌进行筛选以筛选出其从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少TDS的能力。以前面实施例所描述的相同方式形成用于接种处理可能性实验的细菌沉淀。维持1∶1废水∶生物量比例并使用如实施例II中所描述的修改的TDS分析方法在48小时内对TDS水平进行分析。
在48小时内，展现了在电浮法处理的样品中保藏号MTCC 5097的分离物造成大约10.3％的百分比减少(表8b)和在未经处理废水中保藏号5097的分离物造成高达8.0％的百分比减少(表8a)。
实施例IX为了找出何种生物上样量可产生最好的结果，以不同的废水∶生物量比例即1∶0.5和1∶1对在未经处理废水中表现超过6.0％和在电浮法处理的废水中表现超过9.0％的细菌在各自对应的废水样品进行重新检验。以如前面描述的方法培养所述单一细菌并在最终O.D.650为1.5时进行收获。
在第0小时和第24小时取出合适样品等份进行TDS分析。据发现与1∶0.5的比例相比，废水∶生物量比例为1∶1时表现出更优的结果。同样，将培养物的O.D增加到1.5，表现出在电浮法处理的废水中保藏号MTCC 5097的分离物造成高达11.1的百分比减少而在未经处理废水中造成8.1的百分比减少。
表-1用从来自制革厂废水的细菌分离物制备的不同聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少(通过标准Standard APHA方法分析)

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-2用不同聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水百分比减少(修改的APHA方法)

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-3用从分离的处理水制备的不同聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-4a使用不同由聚生体P1、P2、P3配制的不同聚生体产生的未经处理制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-4b使用由聚生体P1、P2、P3配制的不同聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-5a通过使用改变的洗涤沉淀的方法用单一细菌产生的未经处理制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-5b通过使用改变的漂洗沉淀的方法用单一细菌产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-6a用来自制革厂不同位置的聚生体产生的经处理制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-6b用来自制革厂不同位置的聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-7a用不同的从来自富含氯化物、硫酸盐和硝酸盐场地的细菌分离物制备的聚生体产生的未经处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-7b用不同的从来自富含氯化物、硫酸盐和硝酸盐场地的细菌分离物制备的聚生体产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-8a使用单一细菌分离物产生的来经处理制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-8b使用单一细菌培养物产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％
表-9a使用不同生物量载量产生的未经处理制革厂废水TDS的百分比减少

所有值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％表-9b使用不同生物量载量产生的电浮法处理的制革厂废水TDS的百分比减少

所有的值都是重复实验的平均值，SD为±0.2％本发明的有利方面1.所述分离的细茵能够以可重复的方式减少制革厂废水的TDS水平。
2.所述天然分离的细菌是非致病性的并且可在无任何经济负担的简单营养培养基上培养。
3.这种从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少TDS的细菌减少方法是新的方法。
权利要求
1.一种保藏号为MTCC 5097的细菌菌株，所述菌株用于从未经处理的以及经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平。
2.制备权利要求1的菌株的接种物的方法，所述菌株用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平，所述方法包括步骤a)分离所述菌株，b)在包含土壤提取物和营养琼脂的营养琼脂培养基上培养所述菌株以获得纯培养物，c)将所述菌株接种到营养肉汤中以获得起始培养物，d)在大约37℃优选地以100rpm温育所述起始培养物约16-18小时，e)用所述起始培养物接种营养肉汤直至获得具有光密度1.0的培养物，f)从所述培养物中收获所述细胞以获得沉淀，g)通过溶解在0.05M pH6.8的磷酸盐缓冲液中洗涤所述沉淀，h)将经洗涤的沉淀离心，i)将经洗涤的沉淀溶解在最少量的废水中，和j)匀浆化所述溶解的沉淀以获得准备用于从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的细胞浆液。
3.权利要求2的方法，其中在大约37+/-2℃下在琼脂培养基中培养所述菌株大约16-24小时。
4.权利要求2的方法，其中营养肉汤包含大约5.0g动物组织胃酶消化液、大约5.0g氯化钠、大约1.5g牛肉膏、大约1.5g酵母提取物和大约0.2ml Tween-80。
5.权利要求2的方法，其中将所得到的培养物在大约4℃下以大约6000rpm离心大约20分钟。
6.权利要求2的方法，其中通过溶解在浓度0.05M和pH6.8的PO4-3缓冲液中对所得到的沉淀进行洗涤。
7.一种通过使用权利要求1的保藏号为5097的细菌菌株减少来自制革厂废水的总溶解固体(TDS)的需氧方法，所述方法包括步骤a)用所述菌株接种所述废水以获得细胞浆液，b)在大约37℃下以大约100rpm温育所述细胞浆液，和c)使用改良的APHA方法估量TDS水平。
8.权利要求7的用途，其中废水与生物量的比例在1∶3到3∶1之间的范围内变化(很好地确定)。
9.权利要求7的方法，其中废水与生物量的比例是大约1∶1。
10.权利要求7的用途，其中制革厂废水是未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水。
11.权利要求7和10的用途，其中所述菌株在大约24小时的持续时间内在未经处理的制革厂废水中显示大约8.5的TDS百分比减少。
12.权利要求7和10的用途，其中所述菌株在大约48小时的持续时间内在未经处理制革厂废水中显示大约8.3的TDS百分比减少。
13.权利要求7和10的用途，其中所述菌株在大约24小时的持续时间内在经电浮法处理的制革厂废水中显示大约11.1的TDS百分比减少。
14.权利要求7和10的用途，其中所述菌株在大约48小时的持续时间内在经电浮法处理的制革厂废水中显示大约10.7的TDS的百分比减少。
15.权利要求7的用途，其中所述废水的pH约为7.0。
全文摘要
本发明涉及用于从未经处理的和经电浮法处理的制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的保藏号为MTCC 5097的菌株、制备用于从未经处理的和经电浮法处理的鞣革厂废水中减少总溶解固体(TDS)水平的菌株接种物的方法和使用所述菌株从制革厂废水中减少总溶解固体(TDS)的需氧方法。
文档编号C02F103/24GK1764606SQ200380110273
公开日2006年4月26日 申请日期2003年12月9日 优先权日2003年3月21日
发明者R·库马, P·沙尔马, D·K·提库 申请人:科学与工业研究会