专利名称：一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选具有降解氯酚功能的厌氧菌方法。属于微生物领域。
背景技术：
氯酚是一类用于非农业杀虫用的氯代碳氢化合物、杀虫剂或抗微生物试剂。它对人体产生毒害作用的浓度阈值仅为40ppm，对鱼类产生毒害作用的阈值为1ppm，在水体中1ppb的氯酚即可导致水体的污染。被美国EPA列为优先污染物(Priority Pollutants)以及中国关键污染物黑名单(Blacklist)。目前氯酚类物质常用的超滤法、化学沉淀法、生物法等处理方法存在能耗大、成本高、药剂投加易造成二次污染。因此对氯酚这种难降解有机物物的厌氧生物处理技术将为难降解有机物的降解提供一个选择。虽然人们已经利用生物反应器驯化和培养出具有降解氯酚功能的厌氧污泥，并且取得很好的去除效果(70-90％)，但驯化周期较长，处理效果不稳定。这种驯化后具有降解氯酚功能的厌氧污泥并非纯种氯酚降解菌，并且没有经过初筛和复筛，因此没有得到纯度较高的氯酚降解菌。因此无法科学调节厌氧条件下氯酚类物质的降解工艺，获得厌氧工艺运行方面充分的理论依据和技术指导，达到满意效果。众所周知，厌氧细菌，尤其是产甲烷菌的生长需要严格厌氧环境，在氧化还原电位超过-0.33V(即在一升30℃的水中，氧的含量仅1.48×10-55分子)时是不能生长的。可见，厌氧菌的生存环境要求十分苛刻，造成人们在实验室条件下很难分离或者培养单菌落厌氧功能菌。对于培养和筛选具有降解某种有毒难降解有机物污染物功能的厌氧菌，人们普遍采用“Hungate滚管法”、厌氧缸法、厌氧袋(Bio-bag)法、焦性末食子酸法等。但这些培养方法普遍存在操作繁琐，厌氧环境不易维持等缺点。例如焦性末食子酸法是在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撤上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法可用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，如有梭状芽孢杆菌。厌氧袋(Bio-bag)即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管(有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5％柠檬酸安瓿)、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。厌氧手套箱(Anaerobic Chamber)是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气(H2、CO2、N2)达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱，或将孵箱附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均为自动调节。可以看出，其他厌氧培养法由于自身特点，一般只用于厌氧菌的培养和观察，而不能进行筛选所需的必要操作。利用厌氧手套箱既可以方便地接种、培养、分离和筛选，又可以方便地观察细菌培养和生长情况。因此，与其他厌氧培养法比较，使用厌氧手套箱培养和筛选具有明显的优势。
发明内容
本发明的目的公开一种操作简便的筛选出一株具有高效降解氯酚和耐酸特征的厌氧菌的方法。
为达到上述目的，本发明根据厌氧细菌特殊的生长条件和氯酚驯化和降解特性，采用了能够创造和维持较好的厌氧环境的厌氧手套箱进行分离和纯化试验。本发明按照下面步骤进行A.厌氧颗粒污泥的筛选选择色泽乌黑、颗粒较大的厌氧污泥，用8mm孔筛筛选出直径大于8mm的颗粒污泥；B、氯酚降解的厌氧颗粒污泥驯化接种A步的厌氧颗粒污泥到UASB厌氧反应器进行驯化；对驯化得到的颗粒污泥内生物菌群采用稀释倍数法和平板涂布确定颗粒污泥菌液的接种浓度，并进行细菌分离和纯化；C、降解氯酚的厌氧菌的初筛对分离和纯化得到的菌体用生理盐水或灭菌蒸馏水溶解，成为菌液，取1-2ml混合菌液接种到液体培养基上，富集培养，其中液体培养基中加入氯酚；D、降解氯酚的厌氧菌的复筛取初筛得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，将1-2ml菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养的方法进行分离和纯化，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止。
本发明的方法具有如下优点和效果1.由于本发明使用当前国际领先并公认为最佳的厌氧细菌培养装置—厌氧手套箱，因此可以方便地接种、培养、分离和筛选，又可以方便地观察细菌培养和生长情况，与现有方法相比本发明培养出的具有降解氯酚功能的厌氧菌更纯。
2.由于本发明采用了UASB反应器驯化和培养具有降解氯酚功能的厌氧颗粒污泥接种，开发和使用硫乙醇酸钠等四种改进的厌氧菌培养基，通过初筛和复筛培养出具有降解氯酚功能的厌氧细菌，因此与现有的其他厌氧培养驯化和培养方法相比，工艺简单，操作更容易，细菌种群多样性有明显的优势。
3.采用本方法得到的筛选菌株可以进行相关的生理代谢和降解规律研究，为降解氯酚功能菌的研究提供基础，更能为优化处理氯酚类等有毒有害废水的厌氧处理工艺设计和运行方式提供理论依据和技术保障。
4.本发明在对各种培养基培养的纯种氯酚降解菌和反应器内细菌的种群多样性比较的基础上，研究各种筛选出的功能菌各自对氯酚降解规律和它们之间的相互联系和影响机理，为氯酚废水的厌氧生物处理工程应用提供理论依据和指导。
图1为本发明中实验室规模的驯化和培养厌氧颗粒污泥的UASB反应器流程示意2为颗粒污泥取样器示意3为1029Thermo Forma Anaerobic System型号厌氧手套箱示意4为氯酚浓度和菌液OD600曲线随时间变化曲线，其中氯酚为邻位氯苯酚，菌液为接种了约1.3×107个具有降解氯酚功能的厌氧菌菌液图5为萨布培养基培养出的纯菌株形态
具体实施例方式
实施例1请参阅图1、2和3。
本实施方式按照下面步骤进行A、厌氧颗粒污泥的筛选从处理高浓度有机废水如柠檬酸废水的厌氧反应器中取品质良好的颗粒污泥，过筛将絮状污泥弃掉，保留粒径大于8mm颗粒污泥；B、氯酚降解的厌氧颗粒污泥驯化采用实验室规模的上流式厌氧颗粒污泥反应器(UASB)，将A步富集到的品质良好的厌氧颗粒污泥装入UASB进行培养和驯化，葡萄糖和微量元素及生长因子营养液用蠕动泵从底部泵入UASB，对厌氧颗粒污泥进行驯化，UASB的恒温水浴夹套进水是通过恒温水浴箱内设置的加热棒和温度传感器用温控仪控制恒温35℃，泵入夹套进行循环的。葡萄糖模拟的COD浓度范围在0～2000mg/L，氯酚在进水中的浓度从0逐渐提高到100mg/L；以COD去除率和氯酚降解率作为监测指标，当COD去除率和氯酚降解率达到并维持在80-90％时，COD浓度保持不变，提高氯酚在进水中的浓度；当COD去除率和氯酚降解率再次达到并维持在80-90％时，继续提高氯酚浓度，降低葡萄糖浓度，直至以氯酚为单一基质运行厌氧反应器并且氯酚降解率在80％以上；驯化过程中使用的微量元素及生长因子营养液成分和浓度mg/L为CaCl2·2H2O 100；CuSO410；MgCl2·6H2O 200；FeSO4·7H2O 100；CoCl2·6H2O 25；MnSO4·H2O 100；硼酸10；ZnSO4·7H2O 25；NiCl2·6H2O 20；(NH4)6Mo7O24·4H2O10；NaCl 50；酵母浸膏10。
C、降解氯酚的厌氧菌的初筛a.对固体培养基平板涂布分离得到的菌体用生理盐水或灭菌蒸馏水溶解，用自制的由针筒和与针筒连接的橡皮管组成的污泥取样器(附图2)插入反应器颗粒污泥内部抽吸1-3ml污泥液体；b、将污泥取样器迅速移入厌氧手套箱内，然后把取样器中污泥转到10ml无菌塑料离心管中，用玻璃棒充分搅动污泥液体以使颗粒污泥破碎；c、取出1-2ml破碎的污泥液体依次稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等梯度溶液；d、取1-2ml各梯度溶液均匀涂布到固体培养基平皿上，对平皿上生长的菌体用生理盐水或灭菌蒸馏水溶解，取1-2ml混合菌液接种到液体培养基富集培养，其中液体培养基中加入5-10mg/L浓度的氯酚；24-48小时后观察菌落生长情况，最终确定对4种培养基选取方便于菌落计数和观察的稀释倍数。
D、降解氯酚的厌氧菌的复筛取初筛得到的菌液1-2ml接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌落后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，取1-2ml菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，判断分离纯化是否成功。如果菌体不纯继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化。其中用90cm玻璃平皿倒入10-20ml固体培养基，用100ml锥形瓶装液体培养基并用棉塞和纱布塞住瓶口以免污染；通过上述步骤纯化的细菌可以高效降解氯酚，图4为萨布培养基得到的一种纯菌株对氯酚(以邻位氯苯酚为例)降解过程的氯酚浓度和菌液OD600(Optical Density)随时间变化曲线(接种细菌个数约1.3×107)。图5为上述纯菌株的显微镜照片。
本发明中采用的四种培养基及其成分为a、硫乙醇酸钠培养基的组成和含量g/L为胰酪胨15；氯化钠2.5；葡萄糖5；L-半胱氨酸0.5；硫乙醇酸钠0.5；琼脂20；酵母浸汁5；pH为7.1±0.2。b、萨布培养基组成和含量g/L蛋白胨10；琼脂20；麦芽糖20-40；pH为6.4±0.2；c、马丁培养基配方和含量g/L蛋白胨5；磷酸氢二钾1；酵母浸汁2；MgSO4·7H2O 0.5；琼脂20；pH值6.8；d、同济培养基组成和含量g/L葡萄糖10-20；胰蛋白胨4；营养肉汤2；酵母浸汁1；NaCl 5；K2HPO41.5；MgCl20.1；FeSO4·7H2O 0.1；L-半胱氨酸0.5；琼脂20。其中固体培养基是在液体培养基成分基础上添加20g/L琼脂制成的。
实施例2A、厌氧菌种的收集选取受到氯酚类废水污染的深层土壤(厌氧菌发挥主要降解作用)；B、氯酚降解的厌氧颗粒污泥驯化流程与实施例1相同。用预先准备好的脱氧无菌水在50-500ml玻璃广口试剂瓶中配制污泥储存液(液体体积为试剂瓶的1/3)，将约100mg的氯酚污染深层土壤迅速装入玻璃广口试剂瓶中，封好瓶口；污泥储存液成分可参照以下成分，g/LNaHCO3，0.5；乙酸钠，0.5；NH4HCO3，0.01；KH2PO4，0.005；酵母，0.1；将污泥样品放入厌氧手套箱，然后把取样器中污泥转到10ml无菌塑料离心管中，用玻璃棒充分搅动污泥液体以使污泥破碎均匀；取出1-2ml污泥液体依次稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等梯度溶液；取方便于菌落计数和观察的稀释倍数接种浓度溶液均匀涂布到固体培养基平皿上；C、降解氯酚的厌氧菌的初筛对平皿上生长的菌体用生理盐水或灭菌蒸馏水溶解，取1ml-5ml混合菌液接种到液体培养基富集培养，其中液体培养基中加入0-50mg/L浓度梯度的氯酚，最终根据细菌生长与否确定合适的氯酚投加浓度；D、氯酚降解菌的复筛取初筛得到的菌液1-2ml体积接种到90cm玻璃平皿固体培养基中涂布培养，待长出菌落后，用灭菌针挑出一个菌落接种到液体培养基中。待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，取1ml液接种到固体培养基进行形态鉴定，判断分离纯化是否成功。如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化。其中用90cm玻璃平皿倒入10-20ml固体培养基，用100ml锥形瓶装液体培养基并用棉塞和纱布塞住瓶口以免污染；本发明中采用的四种培养基成分见权利要求书第3点。
权利要求
1.一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，其特征在于它是从厌氧颗粒污泥中进行筛选的，并按照下述步骤进行A.厌氧颗粒污泥的筛选选择色泽乌黑、颗粒较大的厌氧污泥，用8mm孔筛筛选出直径大于8mm的颗粒污泥。B、降解氯酚的厌氧颗粒污泥驯化接种A步的厌氧颗粒污泥到UASB厌氧反应器进行驯化，对驯化后得到的颗粒污泥内生物菌群采用稀释倍数法和固体培养基平板涂布确定颗粒污泥菌液的接种浓度，并进行细菌分离和纯化；C、降解氯酚的厌氧菌的初筛对分离和纯化得到的菌体用生理盐水或灭菌蒸馏水溶解，成为菌液，将菌液接种到液体培养基上，富集培养，其中液体培养基中加入氯酚；D、降解氯酚的厌氧菌的复筛取初筛得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，将菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止。
2.根据权利要求1所述的一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，其特征在于所述的B步中的氯酚降解的厌氧颗粒污泥的驯化方法是这样实现的a、接种厌氧颗粒污泥到UASB厌氧反应器；b、驯化初始，以葡萄糖作为共代谢基质和主要碳源，使葡萄糖模拟的COD浓度范围在0～2000mg/L，用美国HP公司生产的HP-1050高效液相色谱仪测定氯酚在进水中的浓度，从0逐渐提高到100mg/L；以COD去除率和氯酚降解率作为监测指标，当COD去除率和氯酚降解率达到并维持在80-90％时，COD浓度保持不变，提高氯酚在进水中的浓度；当COD去除率和氯酚降解率再次达到并维持在80-90％时，继续提高氯酚浓度，降低葡萄糖浓度，直至以氯酚为单一基质运行厌氧反应器并且氯酚降解率在80％以上，驯化程度达到将氯酚进行完全脱氯和生物降解为止。
3.根据权利要求1所述的一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，其特征在于所述的D步的液体/固体培养基分别是硫乙醇酸钠培养基、萨布培养基、马丁培养基和同济培养基，其中固体培养基是在液体培养基成分基础上添加20g/L的琼脂制成的；其成分分别为a、硫乙醇酸钠培养基的组成和含量g/L为胰酪胨15；氯化钠2.5；葡萄糖5；L-半胱氨酸0.5；硫乙醇酸钠0.5；琼脂20；酵母浸汁5；pH为7.1±0.2；b、萨布培养基组成和含量g/L蛋白胨10；琼脂20；麦芽糖20-40；pH为6.4±0.2；c、马丁培养基配方和含量g/L蛋白胨5；磷酸氢二钾1；酵母浸汁2；MgSO4·7H2O 0.5；琼脂20；pH值6.8；d、同济培养基组成和含量g/L葡萄糖10-20；胰蛋白胨4；营养肉汤2；酵母浸汁1；NaCl5；K2HPO41.5；MgCl20.1；FeSO4.7H2O 0.1；L-半胱氨酸0.5；琼脂20；上述每升培养基中加10ml维生素液和10ml微量元素液，维生素液的组成和含量mg/L是钴铵素0.01；抗坏血酸0.025；核黄素0.025；柠檬酸0.02；叶酸0.01；苯甲酸钠0.01；肌酸，0.025；微量元素液的组成和含量mg/L是MnSO4·7H2O 0.01；Zn2SO4·7H2O 0.05；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5；CaCl2·2H2O 0.01；Na2MoO40101；CoCl2·6H2O 0.2。
4.根据权利要求2所述的驯化降解氯酚厌氧颗粒污泥的方法，其特征在于驯化过程中使用的微量元素及生长因子营养液成分和浓度mg/L为CaCl2·2H2O100；CuSO410；MgCl2·6H2O 200；FeSO4·7H2O 100；CoCl2·6H2O 25；MnSO4·H2O100；硼酸10；ZnSO4·7H2O 25；NiCl2·6H2O 20；(NH4)6Mo7O24·4H2O 10；NaCl 50；酵母浸膏10。
5.根据权利要求1所述的一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，其特征在于C步的初筛过程取反应器内厌氧颗粒污泥接种到培养基的方法是这样实现的a、用自制的污泥取样器插入反应器颗粒污泥内部抽吸1-3ml污泥液体；b、将污泥取样器迅速移入厌氧手套箱内，然后把取样器中污泥转到10ml无菌塑料离心管中，用玻璃棒充分搅动污泥液体以使颗粒污泥破碎；c、取出破碎的污泥液体依次稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等梯度溶液；d、取各梯度溶液均匀涂布到固体培养基上，24-48小时后观察菌落生长情况，最终确定对4种培养基选取方便于菌落计数和观察的稀释倍数。
6.根据权利要求1所述的一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，其特征在于C和D步的筛选过程的操作条件是a、采用1029 Thermo Forma AnaerobicSystem型号的厌氧手套箱进行分离和筛选操作，箱内维持N2∶H2∶CO2比例为85∶10∶5，氧气含量低于1％；b、Resazurin或其他厌氧指示剂表征箱内厌氧纯度箱内氧浓度达到一定水平后指示剂立刻变色；c、箱内维度维持35℃。
全文摘要
一种能降解氯酚的厌氧菌的筛选方法，即一种涉及培养、筛选具有生物降解氯酚功能的厌氧菌的方法，利用厌氧手套箱以及多种改进的新型培养基培养筛选出一株具有高效降解氯酚和耐酸特征的厌氧菌，其工艺如下A.厌氧颗粒污泥的筛选；B.细菌分离和纯化；C.降解氯酚的厌氧菌的初筛；D.降解氯酚的厌氧菌的复筛采用固体－液体培养基交替培养方法进行分离和纯化，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止。本发明操作简便，具有重大的理论意义和经济价值。为氯酚废水的厌氧生物处理工程应用提供理论依据和指导。可广泛适用于氯酚类降解菌的分离、筛选和培养，为研究氯酚降解规律以及功能菌及其之间相互作用提供培养筛选良好的菌种的方法。
文档编号C02F3/28GK1827765SQ20061002353
公开日2006年9月6日 申请日期2006年1月23日 优先权日2006年1月23日
发明者陈玲, 张文, 傅以钢, 黄爱群, 夏四清 申请人:同济大学