专利名称：侧孢芽孢杆菌及由该菌种制备的土壤接种剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及侧孢芽孢杆菌及由该菌种制备的土壤接种剂。
背景技术：
我国是一个农业大国，农业是国民经济的基础，是“安天下的产业”。我国和世界大多数农业国家一样，目前均面临着因大量施用化肥农药而造成的环境污染、土壤酸化板结、地力衰退、农产品质量下降、有毒化学物质残留超标、危害人类健康等日趋严峻的问题。尤其是食品安全、餐桌污染给人类带来的危害，已引起国际社会普遍关注。因此，发展生态农业，生产绿色食品，保障人民健康，倍受各国政府重视和支持。“绿色、环保、健康”已成为当今社会发展的主题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种侧孢芽孢杆菌类的新菌种及由该菌种制备的土壤接种剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案对从土壤中分离的菌株进行鉴定并定名为侧孢芽孢杆菌WY9701((Bacilluslaterosporus WY9701).→利用侧孢芽孢杆菌WY9701菌株进行发酵配方及发酵条件试验→进行工业化生产工艺条件试验→确定生产工艺→毒性试验→大田使用效果试验。
本发明所述的侧孢芽孢杆菌WY9701已于2006年7月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1755，CGMCC No.1755菌是由自然分离的侧孢芽孢杆菌，经菌种选育后得到。
CGMCC No.1755菌株具有以下微生物特性1、形态学特性形状及排列菌体杆状，端稍细，单生成对、成堆；芽孢呈椭圆形，(1～1.2)×(2.5～3)μm，附着于芽孢一侧有独木舟形体，芽孢在纺锤形孢囊中侧生、中生。
运动及鞭毛能运动2、生理特性(1)明胶穿刺培养液化阳性；液化速度慢、弱(2)淀粉水解阴性；(3)与氧的关系有氧、无氧均生长(4)酪蛋白水解阳性；(5)酪氨酸分解阴性；(6)二羟丙酮的形成阴性；(7)NaCl中生长2％NaCl生长；5，7，10％NaCl不生长；(8)0.001％溶菌酶中生长阴性CGMCC №.1755菌株能利用葡萄糖，不利用木糖、阿拉伯糖(9)硝酸盐还原阳性3、培养学特性
1与温度的关系培养基J-肉汁 PH7.3-7.5最高温度47℃ 最适温度30-40℃ 耐受温度80℃ 10分钟附表1、WY9701菌株特征
注“v”在一个菌株内性质不稳定，“+”为阳性反应，“-”为阴性反应，“+/-”为反应较弱，“d”为反应不同，11～89％的菌株阳性。利用侧孢芽孢杆菌
WY9701生产土壤接种剂的制备工艺斜面菌种→摇瓶种子→发酵罐发酵→发酵液→超级过滤→过滤液→吸附干燥→混配→成品；上述的培养基配方及培养条件(1)斜面菌种配方(％)营养肉汁琼脂培养基.PH7.0-7.5；培养温度32-34℃；时间48-60hr(2)摇瓶菌种配方(％)豆粕粉0.2-0.5 麦麸粉0.8-1.2 酵母膏0.1-0.3氯化钠0.25-0.3硫酸镁0.015-0.02 磷酸氢二钾0.2-0.3硫酸锰0.005PH7.0-7.5 摇床转速160-200r/min培养温度32--34℃，培养24-30hr至对数生长期时接种。
(3)种子培养基配方(％)豆粕粉0.3-0.6 麦麸粉0.8-1.5 硝酸铵0.15-0.2酵母膏0.2-0.4 氯化钠0.25-0.3 硫酸镁0.015-0.02磷酸氢二钾0.2-0.4 硫酸锰0.005PH7.0-7.5 通气量1∶0.6-0.7 培养温度32-34℃，培养至对数生长期时移种入发酵罐。
(4)发酵培养基配方(％)豆粕粉0.3-0.6 麦麸粉0.8-1.5 硝酸铵0.15-0.2酵母膏0.2-0.4 氯化钠0.25-0.3 硫酸镁0.015-0.02磷酸氢二钾0.2-0.4 硫酸锰0.005
PH7.0-7.5通气量1∶0.6-0.7培养温度32--34℃，培养至80％以上形成芽孢时放罐。
上述制备工艺中的超级过滤发酵液经超级过滤浓缩二十倍，温度控制在50℃以内，时间控制在8hr以内；上述制备工艺中的吸附干燥利用轻质碳酸钙、草碳、锯木屑和硅藻土等做载体，吸附剂∶浓缩液＝(1-2)∶(2-3)，混合均匀后经100℃闪蒸干燥得孢子粉剂。
本发明的优点1、原料易得、价廉、发酵工艺稳定，发酵产品有效活菌数高，适合大规模工业化生产，生产设备可与其他微生物菌剂生产设备通用。
2、产品抗逆性强，活化性好，繁殖速度快。遇到适当的温度、水分、养分等条件，便迅速活化繁殖，形成优势有益菌群发挥作用。
3、将侧孢芽孢杆菌WY9701菌株接种于BCP液体培养基中，36±1℃兼性厌氧培养48h，培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgBW给小鼠连续灌胃3d，观察7d，未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
4、产品稳定性好，有效期长，在常温下保存两年不失效，使用方便；对作物无害，无特殊异味，不刺激皮肤。
5、经试验示范和应用证明，产品适用作物范围广泛，应用效果显著。作用机理①、防病抗病，促进作物生长。本土壤接种剂施用于土壤后通过空间、营养的竞争，抑制病原菌等有害微生物繁殖；通过拮抗作用，杀死或抑制病原菌，在根际周围形成一圈生物屏障，阻止病原菌的入侵、定殖，起到减少病害(特别是土传病害)的作用。本土壤接种剂可有效地阻止以下病菌病毒对作物的侵害细菌密执安棒形杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧文氏菌、青枯假单胞菌、丁香假单胞菌、油菜单胞菌等；真菌曲霉菌、离蠕孢、头孢霉、毛壳菌、刺盘孢、尖镰孢、肉桂疫霉、柑桔生疫霉、柑桔黑腐病疫霉、寄生疫霉、仙人掌疫酶、瓜果腐霉、终极腐霉、立枯丝核菌、齐整小核菌、黄萎轮枝孢、大丽菊轮枝孢、轮枝孢属等；病毒烟草花叶病毒、马铃薯病毒、黄瓜花叶病毒等。
在上述致病菌中，有相当部分是农作物主要病害的病原菌②、促进养分分解、增加土壤肥力。本土壤接种剂通过互生作用，促进土壤中有益微生物如解磷菌(巨大芽孢杆菌)、解钾菌(硅酸盐细菌)、酵母菌等繁殖，一方面促进土壤有机质分解转化，释放出氮、磷、钾等营养元素，另一方面能增加生物固氮量或将土壤矿物质中含有的磷、钾等元素分解、释放，增加土壤肥力，供植物吸收利用，减少化肥使用量，改善农产品品质。
③、改良土壤，平衡施肥。本土壤接种剂可促进土壤有益微生物大量繁殖，保持土壤微生态平衡，改善因长期施用化肥而导致的土壤板结、酸化状况，改良土壤理化特性和土壤结构，增强土壤保水保肥能力，提高土壤中营养物质的供应水平，使养分供应均衡，提高肥料利用率。
④、分泌生长物质，促进根系发育。侧孢芽孢杆菌在其代谢过程中分泌的多种植物生长物质，可促进植物根系生长，增加吸收养分的能力。其分泌的营养物质还可直接被植物吸收利用，促进植物生长。用稀释50倍和100倍的土壤接种剂原液处理小麦种子后，其麦苗分别比对照增高25％和16％；百株干重分别为5.88克，5.75克，分别比对照增重15.7％和13.1％。
⑤、表现较强的生物酶活性。侧孢芽孢杆菌在代谢过程中会表现出较高的SOD酶活性，可使植物体内酶活性提高2-3倍。SOD酶可参与植物的防御反应，增强植物的抗病抗逆性，减少病害，提高产量。同时增加产品中的P、K、Ca等矿物质及维生素，还原糖、氨基酸等的含量，使农产品品质提高，口味变佳，耐贮、耐腐、耐运输。
⑥、降解土壤有毒有害物质，改善农产品品质。本土壤接种剂对土壤的氮污染有很强的降解作用，可使农产品中的硝酸盐含量降低48.6-87.7％；本土壤接种剂对土壤中的有毒有害物质也有较强的降解作用(如降解土壤中的残留除草剂、降低烟草中氯的含量等)，并对已经劣化的土壤起到生物治疗和生物修复作用，从而改良土壤，使农产品品质大幅度提高。
主要功效及实例(一)改良土壤使用土壤接种剂后，土壤肥力、微生物活性及种群结构明显改善。经对使用后的土壤进行对比测试表明它能够增加土壤中有益微生物数量；减少有害微生物数量，提高土壤中营养物质的供应水平。同一地块，施用30天后土壤中的微生物数量比例发生巨大变化霉菌、酵母菌+43％；速效氮+13％；速效钾+13％；速效磷+3％。好气性细菌-42％；总大肠杆菌-95％；粪便大肠杆菌-99％；凝结阳性葡萄菌-87％；沙门氏菌-99％；克雷伯氏菌-99％。使用结果证明土壤中侧孢芽孢菌越多，活性越强，理化性状越好，土壤越肥沃。
(二)促进生长农作物施用本土壤接种剂后，根系发达、植株增高、茎秆增粗、叶片增多增厚、叶色浓绿，生长稳健。本土壤接种剂具有明显促进烟株生长的作用。采烤前其株高和叶面积均比对照增加。据某两地在蔬菜上施用土壤接种剂20天后调查，比未施用的叶片数增多1.1-1.7片，株高增加1.8-8.6cm，茎粗增加0.1-0.5cm，初采期提早4-10天。
(三)增强抗性1、增强抗病能力。农作物施用上壤接种剂均表现抗病能力增强。被喻为“植物癌症”的烟草花叶病、棉花枯黄萎病，在施用上壤接种剂后发病率明显降低。据大田病毒接种试验均表明施用土壤接种剂烟草花叶病发生率降低60-70％；蔬菜类作物施用土壤接种剂后，猝倒病、炭疽病、根腐病、软腐病、疫病、白粉病、霜霉病、叶斑病等发病率均明显下降，尤其根肿病和根结线虫病发生率大幅度降低。
2、增强抗寒能力。某地遭三十年未遇的特大寒潮，施用土壤接种剂的香蕉、荔枝，抗寒能力明显增强，活叶率达68％，比未施用的提高55％。浙江某地茶厂在其它茶树遭到严重冻害的情况下，使用土壤接种剂的茶树抵御了“倒春寒”袭击，叶片未受冻害，表现了较强的抗霜冻能力，产量大幅度提高。
3、增强抗旱抗涝能力。施用土壤接种剂后，作物耐干旱、涝渍能力均有增强；无论酸性土壤还是碱性土壤，施用土壤接种剂后，作物生长优势均明显好于对照。
(四)改善品质能改良土壤，平衡供肥，促进作物稳健生长，对病害有明显防效，减少农药、化肥施用量，降解有毒有害化学物质残留，从而有效改善农产品品质。对烟样进行检测分析，施用土壤接种剂的烟叶组织疏松，上等烟比例提高10.2％；香气增加，品味改善达显著水平，可提高烟叶的感官评吸质量，有利于生产安全无公害烟叶。
(五)提高产量土壤接种剂在不同地域、不同作物上应用，均表现出良好的丰产性能。作物产量明显提高蔬菜增产12-30％；水果增产20％左右；水稻增产10-15％；烟草增产7.5-19.8％；茶叶鲜产量增收26.8％，蚕桑产量增加20.8％。
(六)增加效益土壤接种剂对各类农作物均具有不同程度地提高产量、改善品质、提早上市，减少农药、化肥用量，减少农业投入等作用，经济效益十分可观。据统计，蔬菜类作物亩增值一般为120-400元，投入产出比为1∶12-20；烟草等经济作物亩增值为100-540元，投入产出比为1∶10-27；粮食作物亩增值为50-200元，投入产出比为1∶7-10。烟草使用土壤接种剂，可使上等烟比例提高5-10个百分点，均价提高0.25-1.93元，亩产能增加72-430元，投入产出比为1∶9-50。
利用侧孢芽孢杆菌生产的土壤接种剂能明显抑制有害病菌病毒的生长繁殖，增强作物根系活力，促进作物生长，对减少化肥农药用量、保护环境有明显作用。
具体实施例方式
实施例1CGMCC No.1755菌的选育将自然分离的侧孢芽孢杆菌野生菌株通过自然选育得到一株生物量较大的纯培养菌株，以此菌株为出发菌株，其发酵液芽孢菌数为1亿/ml，再用紫外诱变15-50s，取得了较好的诱变效果，得到一株CGMCC No.1755，其发酵液芽孢菌数高达10亿/ml，是出发菌株的10倍。
实施例2、利用CGMCC No.1755菌生产土壤接种剂制备工艺是将CGMCC No.1755置于摇瓶中进行种子培养，条件是PH7.0-7.5摇床转速160/min培养温度33±1℃，培养24-30hr至对数生长期时接种入种子罐，在种子罐内培养24-30hr，再转接发酵罐中培养至80％以上形成芽孢；将发酵放罐液经超级过滤、载体吸附、干燥工艺得到高浓度的厚壁休眠孢子粉剂；摇瓶菌种配方(％)豆粕粉0.5 麦麸粉1.2 酵母膏0.1 氯化钠0.3硫酸镁0.02磷酸氢二钾0.3 硫酸锰0.005PH7.0-7.5 摇床转速160r/min培养温度33±1℃培养18-36hr至对数生长期时接种。
种子培养配方(％)豆粕粉0.6 麦麸粉1.5 硝酸铵0.15 酵母膏0.2 氯化钠0.25
硫酸镁0.015磷酸氢二钾0.4硫酸锰0.005PH7.0-7.5 通气量1∶0.6 培养温度33±1℃培养24-30hr至对数生长期时接种。
发酵培养基配方(％)豆粕粉0.6 麦麸粉1.5 硝酸铵0.2 酵母膏0.3 氯化钠0.25硫酸镁0.015 磷酸氢二钾0.4 硫酸锰0.005PH7.0-7.5 通气量1∶0.6 培养温度33±1℃培养至80％以上形成芽孢时放罐。
2后处理工艺(1)超级过滤发酵液经超级过滤浓缩二十倍，温度控制在50℃以内，时间控制在8hr以内；(2)吸附干燥利用轻质碳酸钙、草碳、锯木屑和硅藻土等做载体吸附超滤液，吸附剂∶浓缩液＝(1-2)∶(2-3)，混合均匀后经100℃闪蒸干燥得孢子粉剂。
权利要求
1.侧孢芽孢杆菌WY9701，按照张经忠“微生物分类学”，依据“伯杰系统细菌分类学手册”和“芽孢杆菌属”，用侧孢芽孢杆菌ATCC64作模式菌株，WY9701菌株被鉴定为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)，定名为侧孢芽孢杆菌WY9701(Bacillus laterosporus WY9701)，保藏号为CGMCCNo.1755。
2.一种土壤接种剂，其特征在于利用侧孢芽孢杆菌WY9701菌株经微生物液体深层发酵得到。
3.根据权利要求2所述的土壤接种剂的制备方法，其特征在于将CGMCC No.1755置于摇瓶中进行种子培养，条件是PH7.0-7.5，摇床转速160-200r/min，培养温度32--34℃，培养24-30hr至对数生长期时接种入种子罐，在种子罐内培养24-30hr，再转接发酵罐中培养至80％以上形成芽孢；将发酵放罐液经超级过滤浓缩、吸附、干燥工艺得到高浓度的厚壁休眠孢子粉剂。
4.根据权利要求3所述的土壤接种剂的制备方法，其特征在于厚壁休眠孢子粉剂可拌入底肥或追肥中施用，也可拌种施用或加水浇灌作物根部。
5.根据权利要求2所述的土壤接种剂在阻止有害菌繁殖、改善作物营养条件、防病、促生、增产上的用途。
全文摘要
本发明涉及侧孢芽孢杆菌及由该菌种制备的土壤接种剂，该菌种保藏号为CGMCC No.1755；利用侧孢芽孢杆菌WY9701菌株经微生物液体深层发酵得到土壤接种剂，土壤接种剂在阻止有害菌繁殖、改善作物营养条件、防病、促生、增产上的用途。本发明的优点1.原料易得、价廉、发酵工艺稳定，发酵产品有效活菌数高，适合大规模工业化生产，生产设备可与其他微生物菌剂生产设备通用。2.产品抗逆性强，活化性好，繁殖速度快。遇到适当的温度、水分、养分等条件，便迅速活化繁殖，形成优势有益菌群发挥作用。3.产品稳定性好，有效期长，在常温下保存两年不失效，使用方便；对作物无害，无特殊异味，不刺激皮肤。
文档编号B09C1/10GK1966670SQ20061003692
公开日2007年5月23日 申请日期2006年8月4日 优先权日2006年8月4日
发明者张新雄, 韩斌, 林满文 申请人:东莞市保得生物工程有限公司