专利名称：凝结芽孢杆菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌菌株(Bacillus coagulans)及其用途。
背景技术：
改革开放以来，我国水产养殖业发展迅速，养殖规模不断扩大，养殖品种日益增多，产量也迅速增加，我国已经成为世界第一水产养殖大国。目前开发利用的水产养殖面积近700万hm2，2003年全国实现水产品养殖产量3029万吨，占水产品总量的64％，是世界上惟一养殖产量超过捕捞产量的国家，2004年淡水养殖产量和海水养殖产量又分别比2003年增长了4.8％和3.7％。但是随着高密度人工养殖快速发展，带来了排泄物以及残存饵料在水体中过度沉积，造成水体自身污染，水质不断恶化，直接或间接导致了水体的富营养化、水产养殖病害的频繁发生以及水产品失去固有的鲜味等，这给全国的水产养殖业造成了巨大损失，严重影响了水产养殖业的可持续发展。与此同时，未经处理的养殖废水的任意排放，不仅使天然水域受到污染，水产养殖水体生态环境进一步恶化，而且还威胁到人类自身的生存。
作为水生动物赖以生存的基本环境条件，水体水质的好坏直接影响到它们的生长状况和水产养殖业的经济效益。“养鱼就是养水”，要实施水生动物的绿色高效和可持续养殖，其不可缺少的条件是具有有益于它们健康生长的水体。众多学者已经认识到水生动物疾病的暴发也同养殖水体环境密切相关，如不改善水质，水生动物健康就得不到保证，水体生态就会被破坏，病害会越来越多，严重影响水产品的产量和质量。如在虾类养殖业中，由于水体污染恶化而直接或间接引起的疾病已成为限制水产产量的主要因素。1993年，我国半密集型对虾养殖产量大幅度滑坡(从1992年的22万吨下降到1993年的5万吨，降低约70％)，其原因就主要是水质恶化。同时，人类的健康也会因食用不安全的水产品而受到威胁。因此，水产养殖水体的净化已成为水产养殖业可持续发展之关键，如何解决这一难题成为关系到国计民生的大事。
目前，国内外水产养殖水质净化的方法一般采用物理法、化学法或者生物法。物理法主要采用吸附、沉淀、过滤等形式，利用物理作用来分离水中的悬浮物或采取物理手段来改善水中溶解氧或杀灭致病微生物。但物理处理存在净化不彻底、重复利用率差、投入成本大等缺点。化学法多采用药物如抗生素、高锰酸钾、重金属类等进行消毒的形式。化学法虽然可以在短时间内起到较为明显的效果，但是也存在净化不彻底的问题，并且在水产养殖中也存在着抗生素过量使用问题。国内外研究均表明，长期使用抗生素和其它化学药物会导致药物在水产动物体内富聚。如2001年11月，香港从大陆进口的大闸蟹被检查含有氯霉素、土霉素等抗生素，从而引起人们对水产品食用安全性的极大关注。
近年来，国内外养殖业普遍采用生物法来净化养殖水质，其中以利用有益菌制备的微生态制剂来处理水体为主，取得了显著的成绩。在欧美、日本以及印度尼西亚、泰国等国家的水产养殖业中，微生态制剂得到较为广泛的应用。但是，目前所用微生态制剂存在有益菌株种类偏少，特别是能够产生有机酸的菌株种类偏少、有效活菌数目低、不耐高温、耐盐范围较窄等缺陷，不能完全满足生产实践中的需要，制约了微生态制剂在水产养殖水质净化上的应用。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能够产生有机酸、具有净化水质作用的凝结芽孢杆菌菌株。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种凝结芽孢杆菌菌株，该菌株的保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏号CCTCC M206012。
本发明的凝结芽孢杆菌菌株HN-0301，在营养琼脂平板上菌落直径为2.0～2.5mm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地较软；显微镜下该菌株细胞呈直杆状，细胞大小在0.5×1.0μm～1.5×4.0μm，具有圆端，芽孢椭圆端生；在液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。该菌株适宜的生长温度为30℃～45℃，最适初始pH值为6.0～7.0。
本发明还提供了上述凝结芽孢杆菌菌株HN-0301的用途用于净化水质。具体为将该菌株制备成微生态制剂后用于净化水质。
本发明的凝结芽孢杆菌菌株HN-0301，代谢可产生有机酸，其中主要为乳酸和醋酸以及少量的丁二酸和丙酸，乳酸产量达到7.65±0.14g/L。
该菌株可以在以麸皮为主要原料的培养基中生长，发酵后菌株数量可高达1×1011cfu/g以上。将本发明的凝结芽孢杆菌菌株HN-0301，制成微生态制剂的方法如下1、液体发酵方法为碳源为麸皮，氮源为蛋白胨和酵母膏；发酵20～28hr，菌种量达到1×1010cfu/ml以上。
2、固体发酵方法为依次进行以下步骤a)一级种子将原始菌种接种至试管营养琼脂斜面培养基，30～35℃过夜培养20～28hr；b)二级种子将一级种子接种至试管营养肉汤液体培养基，30～35℃过夜培养20～28hr；c)三级种子将二级种子接种至50～150ml三角瓶含5～20％麸皮浸出液培养基，30～35℃过夜培养20～28hr；d)培养基配制麸皮和大豆粉混合原料经粉碎后加入等比例水，0.11Mpa灭菌30～50min，冷却；e)发酵培养基按1～10％的重量比接入三级种子，培养基含水量控制在50～55％，发酵室内相对湿度保持在85％以上，pH范围为6.0～7.0，温度维持在30～35℃，通风发酵24～48hr，菌种量达到1×1011cfu/g以上；将上述培养物在40～45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包装即成固态的微生态制剂。
本发明凝结芽孢杆菌菌株，具有如下优点1)培养方便，生长速度快，能在廉价的原料上生长；2)能产生以乳酸为主的有机酸，降低消化道pH值，使肠内处于酸性环境，抑制病原菌；3)培养发酵后的活菌菌株数目高；4)该菌不产生有害物质，以它制备的微生态制剂是绿色的水产养殖用水质净化剂，可以有效改善养殖水质。
具体实施例方式
实施例1、菌种筛选和分离在海宁某高产南美白对虾(Penaeus vannamei；Boone，1931)池塘采样。将样品制成悬浮液，经富集培养24小时后(30℃)，置于80℃水浴锅中加热10～20分钟，杀死不形成芽孢的菌体。取出静置10分钟，划线法进行分离纯化，利用芽孢生长培养基，根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为HN-0301，然后在营养琼脂平板上进行纯培养。
实施例2、菌种鉴定(1)形态特征在营养肉汤液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。在营养琼脂平板上菌落HN-0301直径为2.0～2.5mm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地较软。显微镜下菌株细胞呈直杆状，细胞大小在0.5～1.0μm×1.5～4.0μm，具有圆端，芽孢椭圆端生。
(2)生化特性菌株HN-0301革兰氏染色阳性，接触酶试验和V-P试验阳性，明胶液化、苯丙氨酸脱氨酶试验阴性。能够分解淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、木糖以及乳糖、麦芽糖等多种糖类，分解葡萄糖产酸不产气。反硝化试验为阳性，这说明该菌株可以降解池塘中的含氮化合物。
(3)16S rRNA序列分析对分离筛选到的菌株HN-0301进行进一步的16S rRNA序列分析与比对。细菌鉴定通用正向引物P1和通用反向引物P6分别相应于E.coli的16S rRNA的8～17nt和1479～1506nt。引物序列如下上游引物(P1)5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′和下游引物(P6)5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′，引物由上海生工合成。以筛选得到的菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，反应条件95℃预变性3min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，反应30个循环。目的片断按照常规方法(Sambrook，et al.，2001)进行克隆和序列测定，测定结果与GenBank中所登录的16S rRNA序列(登录号AB116143，AB116136，AB116142，AF466695等)进行比对分析，基因同源性达到99％以上。根据《Bergey′sMannual of Determinative Bacteriology》(Holt，J.G.，Gibbons，N.E.，1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001)，通过性态特征、生化特性和16S rRNA序列分析，确定菌株HN-0301为凝结芽孢杆菌。将该菌株进行保藏，保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏号CCTCCM206012。
(4)培养特征菌株HN-0301适宜的生长温度为30℃～45℃，最适初始pH值为6.0～7.0。此外，HN-0301对盐的浓度同样具有广泛的适应性，盐度在0.0～3.5％的范围内均可以较好地生长，满足了淡水和海水养殖的需要。该菌株可以在以麸皮为主要原料的培养基中生长，发酵后菌株数量可高达1×1011cfu/g以上。
实施例3、代谢产物分析菌株HN-0301发酵液代谢产物有机酸组分分析参照沈萍等(2004)，菌株在30℃、250rpm条件下，培养24h后，进行样品制备。批处理萃取样品有机酸后加入一定量0.1mol/LNaOH从乙醚萃取液中萃取分离有机酸，旋转蒸发回收乙醚，调节pH值6.5，用气相色谱测定(HP6890GC，USA)。代谢产物有机酸主要为乳酸和醋酸以及少量的丁二酸和丙酸，其中HN-0301乳酸产量达到7.65±0.14g/L，没有检测出丁酸和苹果酸，具体含量详见下表1。
表1 菌株HN-0301发酵液代谢产物有机酸组分分析
注括号中的数字代表标准差(n＝3)实施例4、制作微生态制剂(本实施例中所有的“％”均为重量比。)方法1、液体发酵法斜面培养基营养琼脂培养基和10％麸皮浸出液，2％琼脂，自然pH，121℃高压灭菌30min。
营养盐溶液组成(％)KH2PO4，0.05；MgSO4.7H2O，0.05；NaCl，0.10，其余为水。
培养基在营养盐溶液中加入5％麸皮浸出液、0.5％酵母膏，调pH7.0。
培养条件250ml三角瓶装入培养基100ml，用菌株HN-0301的孢子悬液接种1.0ml，在30℃下，250rpm振荡培养24h，使菌种数量达到1×1010cfu/ml以上。
方法2、固体发酵法a)一级种子(试管斜面种子)将原菌种接种至营养琼脂培养基，30℃培养24hr；b)二级种子(试管液体种子)将一级种子接种至营养肉汤液体培养基，30℃培养24hr；c)三级种子(三角瓶液体种子)将二级种子接种至5％麸皮浸出液培养基，30℃培养24hr；d)培养基配制原料(麸皮∶大豆粉＝4∶1)经粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却至30℃；e)发酵在培养基中按5％的比例接入三级种子，30℃通风发酵36hr，使菌种数量达到1×1011cfu/g以上。
实施例5、应用在12个1m×0.8m×0.6m的玻璃水族箱中分别放入从同一精养虾塘取的水，其中氨氮含量为1.25mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.64mg/L，硫化氢含量为5.83μg/L，化学需氧量COD为14.26，可溶性总磷含量为2.05mg/L。玻璃水族箱分为对照组和试验组2组，每组6个。按终浓度为105cfu/ml的量将凝结芽孢杆菌HN-0301加入试验组的每一个水族箱，3天后分别检测试验组和对照组的水质指标变化。水质各指标变化平均值如下试验组，氨氮含量为0.42mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.11mg/L，硫化氢含量为1.58μg/L，化学需氧量COD为6.17，可溶性总磷含量为0.98mg/L；对照组，氨氮含量为1.32mg/L，亚硝酸盐氮含量为0.59mg/L，硫化氢含量为5.75μg/L，化学需氧量COD为15.03，可溶性总磷含量为1.97mg/L。因此凝结芽孢杆菌HN-0301有明显降低水中污染物质含量的效果，改善了养殖水质，适合于作为水质净化剂在水产养殖上应用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种凝结芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏号CCTCC M206012。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株在营养琼脂平板上菌落直径为2.0～2.5mm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地较软；显微镜下该菌株细胞呈直杆状，细胞大小在0.5×1.0μm～1.5×4.0μm，具有圆端，芽孢椭圆端生；在液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。
3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株适宜的生长温度为30℃～45℃，最适初始pH值为6.0～7.0。
4.如权利要求1～3所述的凝结芽孢杆菌菌株的用途用于净化水质。
5.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌菌株的用途将该菌株制备成微生态制剂后用于净化水质。
全文摘要
本发明公开了一种凝结芽孢杆菌菌株，该菌株的保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HN－0301，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏号CCTCC M206012。该菌株能用于净化水质。
文档编号C02F3/34GK1831113SQ20061004982
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者李卫芬, 王彦波, 周绪霞, 姚江涛 申请人:浙江大学