专利名称：：一种控制蓝藻水华的方法
技术领域：
：本发明涉及环境保护
技术领域：
，具体涉及一种控制蓝藻水华的方法。技术背景水华是淡水中的一种自然生态现象，只是仅由藻类引起的，如蓝藻、绿藻、硅藻等，也就是水的富营养化。水华发生时，水一股呈蓝色或绿色。这种在自然界就有的水华现象，在我国古代历史上就有记载。在自然界中它们很快消失，并没有给水产动物和人类带来危害。水华可以说是湖泊地区的"赤潮"现象。淡水中富营养化后，水华频繁出现，面积逐年扩散，持续时间逐年延长。太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都有水华，就连流动的河流，如长江最大支流——汉江下游汉口江段中也出现水华。淡水中水华造成的最大危害是饮用水源受到威胁，藻毒素通过食物链.影响人类的健康，蓝藻水华的次生代谢产物MCRST能损害肝脏，具有促癌效应，直接威胁人类的健康和生存。此外，自来水厂的过滤装置被藻类水华填塞，漂浮在水面上的水华影响景观，并有难闻的臭味。当藻类大量生长时，这些藻类能释放出毒素——湖靛，对鱼类有毒杀作用。藻类大量死亡后，在腐败、被分解的过程中，也要消耗水中大量的溶解氧，使水体严重恶臭。而造成水华现象的出现，主要原因还是水域沿线大量施用化肥、居民生活污水和工业废水大量排入江河湖泊，致使江河湖泊中氮、磷、钾等含量上升。湖泊富营养化依然是我国目前以及今后相当长一段时期内的重大水环境问题。寻求一种高效控制蓝藻水华的方法迫在眉睫。目前，控制湖泊富营养化藻类暴发的技术包括物理法、化学法、生物法和生态修复工程法等。物理法有底泥疏浚、稀释或调水、藻类过滤与捞取、粘土法等，化学法有投加杀藻剂、抑藻剂等，生物法有微生物控藻、原生动物控藻、大型水生植物控藻和鱼类的投放等，生态修复工程法有草型生态系统构建、生态调控等技术。各种方法各有优缺点和使用的局限性，有的不适合大型湖泊，有的有二次污染，有的经济性较弱，因此，在我国湖泊富营养化日趋严重的今天，开发环境友好的藻华控制技术非常具有必要。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种控制蓝藻水华的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种控制蓝藻水华的方法，采用添加赖氨酸并实施光照的方式。其中，所述赖氨酸的加入量为3-5g/m3。其中，所述的光照包括白天自然光和人工补光。所述的人工补光为水面上白炽灯补光或/和水面下白炽灯补光。采用人工晚间补光(白灯)可提高抑藻的效果；采用水下补光，可提高光利用效率，达到高效的抑藻效果。有益效果本发明的控制蓝藻水华的方法简单易行，通过光照可极大的促进赖氨酸的抑藻效果，控制水华作用明显。图1为赖氨酸抑制铜绿微囊藻的半致死浓度(ECso)。图2为赖氨酸对铜绿微囊藻生长的影响。图3为赖氨酸对铜绿微囊藻可溶性蛋白质含量的影响，其中^^表示与Omg/L对照组差异显著，PO.05;**表示差异极显著，PO.Ol，以下相同。图4为赖氨酸对铜绿微囊藻SOD酶活性的影响。图5为赖氨酸对铜绿微囊藻MDA含量的影响。图6为赖氨酸对铜绿微囊藻Ca2+Mg2+-ATPase活性的影响。图7为光照条件下赖氨酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响。图8为黑暗条件下赖氨酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响。图9为弱光照条件下赖氨酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响。具体实施例方式实施例h赖氨酸和光照联合作用控制水华试验2007年6月在太湖边，分别在直径为50cm的塑料桶中，添加90L湖水和铜绿微囊藻，起始藻密度为1.3xl06cell/L，加入赖氨酸范围为0-5mg/L，同时在每个桶中水下中间悬挂40w防水白炽灯进行补光。以不添加赖氨酸相比，96h后能有效抑制铜绿微囊藻的生长，在赖氨酸浓度为5mg/L，铜绿微囊藻密度为空白对照的一半，体现出其控藻的能力，结果见表l。表1赖氨酸和光照联合作用控制蓝藻暴发试验结果(藻液OD值)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>同时，多次重复试验，发现(1)新鲜配置的赖氨酸，在处理48小时后，5mg/L的水平即可杀灭微囊藻；(2)放置一段时间后的赖氨酸，作用效果时间延迟，作用剂量上升一可能跟赖氨酸分解有关。通过对赖氨酸半致死浓度(EC5o)的研究，表明赖氨酸半致死浓度(EC5o)为2.6mg/L，结果见图1。实施例2:赖氨酸和光照联合作用控制水华机理研究1材料和方法l丄藻种和培养基铜绿微囊藻(M/cra《戸他aen^/mwflFACHB469)由中科院武汉水生生物研究所提供。试验采用BG11培养基，250ml锥形瓶内装150ml藻液。取对数生长期的藻液接种，接种初时密度为1.5xlO、ell/ml左右。培养条件温度25。C，光暗比12h:12h，光照度2200Lx。赖氨酸配成母液后经0.22pm滤膜过滤灭菌，4'C存放；当藻种接入培养基后，按比例把赖氨酸加入藻液中。1.2.铜绿微囊藻生长曲线的测定测铜绿微囊藻培养液的光密度OD46ton和用血小球计数板计数铜绿微囊藻的浓度，获得光密度(x)与细胞数量(y)的线型方程为y=8xl(r8x+0.0166，(一=0.997)。1.3.生理生化指标的测定1.3丄可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法。1.3.2.酶活性的测定粗酶液的制备取各处理组藻液20ml，4'C、10000rpm冷冻离心10min，去上清液，加入3ml缓冲溶液(测SOD和MDA用PBS缓冲液，0.05M,pH7.0，4°0预冷；测ATPase用STN缓冲液，pH7.8，含0.05mol/LTris-HCl、0.4mol/L蔗糖、0.01mol/LNaCl，4。C预冷)，冰浴下超声破碎(3min，5s，5s)，在4。C、7000rpm冷冻离心10min，上层清液即为粗酶液，用于酶活性测定。SOD酶活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；Ca2+Mg2+-ATPaSe活性测定采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶测试盒。1.3.3.叶绿素a含量测定采用95n/。乙醇低温暗处提取，后分光光度法测定。1.3.4.藻胆蛋白含量测定取各处理组藻样20ml，10000rpm离心5min，去上清液后，加入3mlPBS(0.05M，pH6.8),放入低温冰柜中(-86'C)冷冻8h，然后暗处解冻，如此反复冻融3次，再7000rpm离心10min，上清液用酶标仪测定620nm,650nm，565nm下的光吸收值，按下式计算藻胆蛋白各组分含量藻蓝蛋白(PC，mg/L)=(OD620-0.7xOD650)/7.38;别藻蓝蛋白(APC，mg/L)=(OD650-0.19xOD620)/5.65;藻红蛋白(PE，mg/L)=[OD565-2.8(PC)-1.34(AP)]/1.27。1.4.实验数据采用SPSS13.0软件包进行独立样本T检验统计分析，以P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。2结果及讨论2.1赖氨酸对铜绿微囊藻生长的影响由图2可知，以不同浓度赖氨酸处理的铜绿微囊藻在24h内会继续生长。在24h之后，0.6mg/L赖氨酸对微囊藻没有显著影响；2.0mg/L赖氨酸对微囊藻有微弱的抑制作用；而5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸开始明显抑制微囊藻的生长，在96h时大部分藻细胞被抑制。由图3可知，藻细胞可溶性蛋白质含量被抑制过程与藻细胞类似，在96h时镜检可以看到大部分藻细胞发生裂解。利用赖氨酸处理微囊藻时，24h内各浓度处理的藻液颜色没有明显变化；而48h之后，5.0mg/L和10.0mg/L处理的藻液开始变白、变黄，96h后培养液逐渐变成乳白色，甚至出现藻体结块、粘壁现象，藻细胞大量破裂死亡。喻国策等提到乳酸、柠檬酸、谷氨酸和甘氨酸这四种有机物的存在对鱼腥藻7120"""Z^e"flsp.7120)的生长有抑制作用，在培养6d后，培养液渐趋无色喻国策，丛威，蔡昭铃等.有机碳化合物对鱼腥藻7120生长的影响[J].水生生物学报，2003,27(3):238-242.。这与本试验结果很一致，因此可推测某些酸性有机物对蓝藻细胞可能存在相似的抑制机理。2.2赖氨酸对铜绿微囊藻抗氧化系统的影响由图4可知，不同浓度赖氨酸在48h内对微囊藻细胞的SOD酶活性没有影响，而在96h时，5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸显著抑制它的活性。由图5可知，在24h时不同浓度赖氨酸对微囊藻MDA含量没有影响，而5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸在48h时使微囊藻细胞MDA含量显著下降，96h时则极显著下降。根据图2和图3的分析，5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸从24h时开始抑制微囊藻细胞的生长，而藻细胞的SOD酶活性在48h内没有显著变化、MDA含量在48h时没有升高而反而下降，说明赖氨酸并没有抑制藻细胞的SOD酶活性，也没有诱发藻细胞产生MDA。48h时作为酯质过氧化产物的MDA含量的下降、96h时SOD酶活性的下降应是藻细胞本身趋于死亡、裂解而引起的。SOD是细胞体内消除活性氧自由基最关键的酶类之一；MDA是酯质过氧化的关键产物，它基本上代表了细胞酯质过氧化的程度。由以上分析可知，赖氨酸不是通过诱导藻细胞产生自由基从而进一步损伤藻细胞这一途径来抑制微囊藻的。2.3赖氨酸对铜绿微囊藻Ca2+Mg2+-ATPase活性的影响由图6可知，在24h时不同浓度赖氨酸对微囊藻细胞的Ca2+Mg2+-ATPase活性没有影响，48h和96h时5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸则极显著抑制藻细胞的ATP酶活性。C^+Mg^-ATPase存在生物细胞多个部位，如细胞质膜上和内囊体上，对细胞营养物质的转运和光合作用起着重要作用。Hehmann(2002)认为，赖氨酸可能通过抑制微囊藻细胞的ATP酶活性或磷酸循环，从而抑制了微囊藻对钙、镁或其它矿质元素的吸收，进而引起微囊藻细胞的裂解。由图6的分析可知，赖氨酸对微囊藻细胞的ATP酶活性抑制极为显著，因此，ATP酶可能是赖氨酸对微囊藻细胞起抑制作用的一个靶位点。2.4赖氨酸对铜绿微囊藻光合作用系统的影响由图7可知，在光照条件下，从24h开始5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸即对微囊藻叶绿素a含量具有极显著的抑制作用。由表2可知，在48h时，藻胆蛋白各组分中藻蓝蛋白(PC)相对含量下降，藻红蛋白(PE)相对含量增高，别藻蓝蛋白(APC)相对含量不变。说明光照条件下，5.0mg/L和10.0mg/L赖氨酸会影响藻细胞藻胆蛋白组分构成，其作用点在于藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)。藻胆蛋白是蓝藻光合作用捕光天线的主要功能团，位于捕光天线——藻胆体内，它包括PC和APC和PE三种蛋白，具有捕获光能并将能量高效传递给光系统II(PSII)反应中心——叶绿素a的功能。因此，微囊藻藻胆蛋白组分构成的变化会直接影响到它的光反应效率。表2光照条件下，48h时铜绿微囊藻藻胆蛋白各组分含量赖氨酸(mg/L)PC(%)APC(%)PE(%)020.78±1.0217.90±0.4061.32±1.422.019.20±0.5417.74±0.3563.06±0.855.05.39±0.49**19.83±3.2674.78±3.48**10.06.4U0.55**20.39±3.4173.19±3.52**(+表示与Omg/L对照组差异显著，PO.05;**表示差异极显著，PO.01;以下同)试验中发现，在黑暗条件下(将培养微囊藻的锥形瓶用铝箔严密包裹，置于光照培养箱内培养)，96h内不同浓度赖氨酸对微囊藻均无明显的抑制作用，直到一星期以后藻液才逐渐变黄死亡。据报道铜绿微囊藻在黑暗条件下具有利用有机底物进行化能异养生长的能力。由图8可知，在96h之内，黑暗条件下不同浓度的赖氨酸对微囊藻叶绿素a含量没有抑制作用，其中2.0mg/L赖氨酸处理的叶绿素a含量出现显著增加。由表3可知，赖氨酸对微囊藻藻胆蛋白组分构成没有影响。说明在黑暗条件下，微囊藻具有利用赖氨酸进行化能异养生长的能力，但是此能力很微弱，不足于维持藻细胞的持久生长。表3黑暗条件下，96h时铜绿微囊藻藻胆蛋白各组分含量赖氨酸(mg/L)PC(%)APC(%)PE(%)019.85±1.0820.43±0.1659.72±0.932.019.48±1.2920.29±0.7160.23±1.995.020.02±0.8419.87±0.3460.1U1.1310.017.88±0.8419.70±1.3562.41±0.69试验中还发现，在微弱光照条件下(光照度600Lx1100Lx)，不同浓度赖氨酸对微囊藻也没有抑制作用，因此笔者对微囊藻在弱光照条件下利用赖氨酸的能力，即其光异养生长能力进行了研究。光异养生长可以通过在含有有机碳源的培养基中加入合适浓度的光合作用抑制剂——二氯苯基二甲基脲(DCMU)来实现。此时细胞光合作用系统II(PSII)的活性被抑制，非环式电子传递被阻止，NADPH不再产生，C02不再被还原同化，但光系统I(PSI)仍在起作用，细胞仍可通过环式磷酸化进行ATP的合成。实验表明10pmol/LDCMU即可完全抑制微囊藻生长。接种后，加入赖氨酸的同时加入10pmol/LDCMU，并在弱光照条件下培养，并以正常光照条件下10pmol/LDCMU处理作为空白对照。由图9和表4可知，各处理组与DCMU空白对照对微囊藻叶绿素a含量和藻胆蛋白组分构成的影响情况是基本一致的。因此，在弱光照条件下起抑制作用的是DCMU，即微囊藻在弱光照条件下不能通过PSI系统来维持生长，它没有利用赖氨酸进行光异养生长的能力。由以上分析可知，赖氨酸对微囊藻光合作用系统中的叶绿素a含量、藻胆蛋白组分构成以及Ca2+Mg2+-ATPase活性都具有显著影响；光照条件是赖氨酸对微囊藻起抑制作用的一个敏感条件，也说明光合作用系统是赖氨酸抑制微囊藻的一个作用位点。表4弱光照条件下，96h时铜绿微囊藻藻胆蛋白各组分含量赖氨酸浓度(mg/L)02.05.010.0DCMU(对照)PC(%)24.66±0.7517.45±0.27**17.83±1.24**16.91±0.44**19.62±0.11APC(%)15.93±0.1518.88±0.47**19.08±0.34**18.13±0.45**20.89±0.10**PE(%)59.41±0.6063.67±0.64**63.09±0.98**64.96±0.42**59.49±0.033讨论蓝藻除了可以利用N03'等无机氮源进行生长，也可以利用一些有机氮进行生长，如Neilson&Larsson研究了7种蓝藻对有机氮作为唯一氮源的生长情况，结果发现这7种蓝藻只能利用尿素、尿酸盐和少数一些氨基酸(谷氣酸、天门氨酸、精氨酸和鸟氨酸)进行生长；另外一些单细胞蓝藻(如分"ectococc^PCC7002)利用有机氮源的范围较广，可以利用大部分的氨基酸。但是某些氨基酸也可以对蓝藻的生长起抑制作用，如苯丙氨酸可以抑制S;v"ec/wc，^sp.29108的生长，不过其抑制机理目前并不清楚。一般来说，化学物质的抑藻机理主要是抑制细胞壁的合成、酶活性或者光合作用。本试验发现外加的L-赖氨酸对铜绿微囊藻的抑制作用主要表现在抑制其光合作用。蓝藻是原核生物，细胞内无叶绿体，但是有非垛叠类囊体，类囊体表面结合藻胆体，PSI、PSII、Cytb6/f复合体和ATP合成酶等4种蛋白都在类囊体上。光合作用的光反应，即光化学反应、电子传递和光合磷酸化就是在4种复合体上进行的。PSI和PSII是多亚基蛋白，主要包括天线系统和反应中心部分，前者的主要作用是捕获光能，而后者主要是利用前者捕获的光能进行原初光化学反应。在光照条件下，赖氨酸对光反应中心叶绿素a具有显著的抑制作用；在黑暗条件下，赖氨酸对铜绿微囊藻不起抑制作用，且PSI不能单独维持藻细胞的持久生长，说明PSII的损伤是赖氨酸抑制微囊藻生长的重要原因。一般情况下，PSII受损伤的部位有PSII氧化侧、PSII反应中心或者PSII原初电子受体。赖氨酸可能抑制了微囊藻的PSII反应中心，扰乱了D1蛋白周转，降低反应中心的光反应效率，使得天线系统捕获的大部分光能只能以热辐射形式耗散，即微囊藻利用光的效能降低，其半饱和光强可能下降，因此正常光照的光照强度在此时可能超过光反应的界限而产生光抑制。外加L-赖氨酸在光照条件下使微囊藻的PC相对含量下降、PE相对含量升高，而黑暗条件对藻胆蛋白组分构成没有影响，说明光照条件是赖氨酸影响藻胆蛋白组分构成的影响因子。由于不同的光质和光强可以引起蓝藻藻胆蛋白的类型和含量的变化，蓝藻可以通过改变藻胆蛋白的组分和含量来有效地捕获光能，因此当PSII受到损伤、光反应效率降低时，可能会诱发光反应的天线系统一藻胆蛋白通过调节其组分构成来适应这一变化。由以上分析可推测，外加L-赖氨酸可能主要通过抑制微囊藻细胞的PSII反应中心，以及抑制光反应中心叶绿素a的含量、扰乱藻胆蛋白组分构成等，使微囊藻的光合作用系统受到破坏。PSI和PSII之间的电子传递过程中会在光合膜两侧建立质子电化学梯度，它可以驱动ATP酶合成ATP。因此，当PSII受到损伤时，会使这种ATP合成缺乏驱动能量，导致ATP酶活性降低。另外一方面，由于在活体中不管是氧化磷酸化还是光合磷酸化，ATP合成均与电子传递耦联，因此ATP合成受到抑制反过来也会导致细胞内电子传递链受到限制，由此可能进一步导致细胞功能紊乱，如抑制细胞对钙镁等矿质元素的吸收等，进而使细胞生长受到抑制。权利要求1.一种控制蓝藻水华的方法，其特征在于采用添加赖氨酸并实施光照的方式。2、根据权利要求1所述的控制蓝藻水华的方法，其特征在于所述赖氨酸的加入量为3-5g/m3。3、根据权利要求1所述的控制蓝藻水华的方法，其特征在于所述的光照包括白天自然光和人工补光。4、根据权利要求1所述的控制蓝藻水华的方法，其特征在于所述的人工补光为水面上白炽灯补光或/和水面下白炽灯补光。全文摘要本发明公开了一种控制蓝藻水华的方法，其特征在于采用添加赖氨酸并实施人工光照的方式。本发明的方法简单易行，通过光照可极大的促进赖氨酸的抑藻效果，控制水华作用明显。文档编号C02F1/00GK101264944SQ20081002500公开日2008年9月17日申请日期2008年4月28日优先权日2008年4月28日发明者巾曾,杨柳燕,林必桂,王晓蓉,琳肖,谷孝鸿申请人:南京大学