专利名称：工业废水生物脱氮的反硝化假单胞菌sh12及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株反硝化假单胞菌SH12的筛选及其在工业废水中 生物脱氮的用途。
背景技术：
随着工农业的飞速发展，环境污染问题日益成为人们关注的焦点。在环境问题中最为突出的是水 污染问题。氮和磷是废水中常见的无机营养物，由工业排放的含氮废水，农业便用氮肥的冲淋流失以 及城市生活污水的排放引起的氮的富营养化现象，破坏了自然界的生态平衡。特别是工业废水，如造 纸、皮革、食品加工、化肥、煤炭化工等外排的工业废水富含氮磷元素很高，是富营养化污染的源头。 它不仅消耗水中的溶解氧，而且在转化过程中产生亚硝酸盐或亚硝酸铵，对人和牲畜的健康产生多方 面的危害。水环境污染和水质富营养化问题的尖锐化迫使越来越多的国家和地区制定严格的排放标 准。如何有效处理这些工业废水，同时减少环境资源的消耗和二次污染，已成为人们关注的问题。
针对氮元素污染，国外从20世纪60年代末开始研究开发废水的生物脱氮工艺技术，80年代开 始广泛应用于城市污水和部分工业废水中营养物质的去除。我国从20世纪80年代也开始了脱氮方面 的研究工作，并取得了一定的进展。近年来新兴一种微生物脱氮技术，主要是培养微生物菌群，加入 曝气池混合液以达到对硝态氮的代谢作用。该法作为一种最有前景的水体脱氮方法，具有成本低、出 水水质好，旦运行过程安全稳定可靠、操作管理方便等优点，得到了世界各国广泛采用。但是目前国 内市场尚无可有效治理水体硝态氮及亚硝态氮污染的微生物制剂产品，其主要原因是没能开发出高效 的反硝化菌种，而且在反硝化作用过程中，由于环境中能量物质的不足，经常会导致亚硝态氮和氨氮 的积累，这也给微生物制剂的使用带来巨大风险。所以处理含氮废水时有必要开发出高效的反硝化菌 种，能够耐受环境能量供给的不足，减少有毒中间产物的积累，实践中迫切需要解决这一技术瓶颈， 这对已开发和未开发的反硝化菌提出了更高的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有环境富营养污染生物脱氮技术的一些缺陷，分离得到一株高效的反硝 化菌SH12，该菌株可以将水体环境中硝态氮成亚硝态氮还原为气态的氮气'同时几乎没有亚硝态氮 和氨氮的积累。本发明还涉及其用途。
本发明通过以下技术方案实现
本中诺人分离、筛选到一株高效的反硝化齒'该菌株被命名为SH12'属假单胞幽(尸seWw"o"必W)。本发明的假单胞菌(尸sewfomo"os5p) SH12于2008年11月25日送交湖北省武汉市武汉大学内 的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏，其保藏号为CCTCCNO: M208238。
假单胞菌SH12的筛选方案先采集中国湖北省武汉市石油化工厂排水车间废水池底淤泥样品， 加一定浓度KN03 (见后面的详细描述，下同)进行富集培养，再对富集培养的样品进行稀释并涂布 硝酸盐固体培养基平板，培养长出硝酸盐还原菌，挑取不同形态的菌落划线得单克隆，再用格里斯试 剂法(见后描述)检测出反硝化菌，再对检测出的反硝化菌做16S核糖体RNA基因(16S rDNA)、 形态学等相关鉴定工作，最终得到本发明所需要的假单胞菌SH12。
更详细的技术步骤如下
(1) 样品采取2005年8月中旬采集湖北省武汉市石油化工厂排水车间废水池底淤泥样品。
(2) 样品富集精确称取淤泥样品100g于250ml灭菌三角瓶中，加5ml 2g/L的KN03，轻轻搅匀 置3i:温箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品不干。
(3) 硝酸盐还原菌分离精确称取KN03富集样品10 g于装有90 ml无菌生理盐水的三角瓶中，置 37X:摇床中振荡半小时，再依次取1 ml到9 ml无菌生理盐水中逐步稀释至l(T3， IO"4， 10—5，分别取 O.lml涂布硝酸盐固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置37'C温箱中培养一周，长出的菌株 为硝酸盐还原菌，将平板置4'C冰箱中待用。硝酸盐固体培养基配方如下2gKN03， 0.2gK2HPO4, 0.5gMgSO4*7H2O， 20g酒石酸钾钠，补加到1.5%灭菌并熔解的琼脂中，加蒸馏水使其终体积为1 L, 调pH至7.2-7.6，在121'C灭菌20分钟。
(4) 划线分离将步骤(3)中得到的硝酸盐还原菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划线用 TSA培养基平板，待菌长出后放4'C冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于-8(TC冰箱。TSA培养基 配方如下，称取40gSCD琼脂(Soybean-CaseinDigest)补加去离子水至1 L, 121'C灭菌15分钟。
(5) 反硝化菌筛选将步骤(4)中得到的硝酸盐还原菌单克隆转接到硝酸盐液体培养基中，置37'C 温箱中静置培养，待菌长浓后筛选产生气泡较多者，并用格里斯试剂检测。所述的格里斯试剂检测方 法如下，各取400 ul格里斯试剂A和B到1.5 ml离心管中，再补加1 ml上述培养的菌液，若培养液 由无色变为粉红或红色说明有亚硝酸积累(格里斯试剂与亚硝酸发生反应变红色)，若培养液仍为无 色说明无亚硝酸，有没有发生还原则需加入过量Zn粉进一步确认，如仍不变色说明还原反应完全' 硝酸盐均被还原成气态氮气；如培养液由无色变为红色说明未发生还原。(Zn粉可以将硝酸盐还原为 亚硝酸盐，菌液中如存在硝酸盐，与Zn粉反应后'格里斯试剂与亚硝酸发生反应变色)。硝酸盐液体 培养基配方同硝酸盐固体培养基，只是不含琼脂。
(6) 反硝化菌的分类鉴定利ffl 16SrDNA鉴定，即采W原核生物16S rDNA通用引物27F (正向引 物)5，AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'和1492R(反向引物)5'GGYTACCTTGTTACGACTT3，做PCR。扩增其16S rDNA并测序，再与国际NCBI GenBankfwww.ncbi.nlm.nih.gov、核苷酸数据库比对， 其核苷酸同源性为99%，举定为假单胞菌尸WMrfo附o"as; 二是利用革兰氏染色分析和生长特性鉴定。 本发明的假单胞菌SH12菌学特征如下
菌体直杆状，革兰氏阴性菌，适宜生长温度30-37。C,适宜pH 7.0-7.5，兼性好氧，在LB、 TSA 和硝酸盐固体培养基上均为黄色、木规则形、粗糙的菌落。 假单胞菌SH12的保藏
本发明的假单胞菌SH12可以在常用的LB或TSA固体培养基上在28-37。C培养，培养后可在4 'C下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(参见赵斌，何绍江.微生物学实 验.第一版.科学出版社.2002: 202—205)保藏菌株比较合适。
本发明的积极效果是
本发明分离筛选到的假单胞菌SH12可以在兼性厌氧的条件下将工业废水中的硝态氮或亚硝态氮 还原成气态的氮气， 一般2-3天即可达到国家排放标准，在不外加能量物质的情况下，过程中几乎没 有亚硝态氮和氨氮的积累，而且还可以配合新兴的微生物固定包埋法，达到对富营养污染环境的有效 净化。本发明菌株是从工业废水环境中分离筛选到的，对工业废水环境具有较强的抗性和适应性，有 望在工业废水生物脱氮方面发挥重要作用。
图1:是本发明的技术路线图。
图2:是本发明的假单胞菌SH12的革兰氏染色光学显微镜观察图，放大倍数为100倍。 图3:是本发明的假单胞菌SH12的反硝化曲线图，X轴代表时间(天)，Y轴代表离子态氮的浓 度(mg/L)。
图4:是本发明的假单胞菌SH12的硝态氮去除效果图，X轴代表时间(天)，Y轴代表离子态氮 的浓度(mg/L)。
具体实施方式
实施例l:从工业废水池底淤泥中分离假单胞菌SH12
实验样品取自中国湖北省武汉市石油化工厂排水车间废水池底淤泥，具体操作步骤如下，见图1: (1 )样品富集精确称取淤泥样品100 g于250 ml灭菌三角瓶中，加5ml 2g/L的KN03,轻轻 搅匀置37'C温箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品不干。
(2)硝酸盐还原茵分离精确称取KN03富集样品10 g于装冇90 ml无菌生理盐水的二角瓶中， 置37。C摇床中振荡半小时，再依次取1 ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至10-3, 10-4， 10-5，分 别取O.l ml涂布硝酸盐向体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置37'C温箱中培养一周，L《出200810236658.7
说明书第4/5页
的菌株为硝酸盐还原菌，将平板置4'C冰箱中待用。硝酸盐固体培养基配方如下2g KN03, 0.2g K2HP04, 0.5gMgS04'7H20， 20g酒石酸钾钠，补加到1.5%灭菌并熔解的琼脂中，使其终体积为1 L，最终pH为7.2-7.6， 12rC灭菌20分钟。
(3) 划线分离将步骤(2)中得到的硝酸盐还原菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划 线用TSA培养基平板，待菌长出后放4'C冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于-8(TC冰箱。TSA培 养基配方如下，称取40 g SCD琼脂(Soybean-Casein Digest)补加去离子水至1 L, 121'C灭菌15分 钟。
(4) 反硝化菌筛选将步骤(3)中得到的硝酸盐还原菌单克隆转接到硝酸盐液体培养基中，置 37'C温箱中静置培养，待菌长浓后筛选产生气泡较多者，并用格里斯试剂检测。方法如下，各取400 ul格里斯试剂A和B到1.5 ml离心管中，再补加1 ml上述培养的菌液，若培养液由无色变为粉红或 红色说明有亚硝酸积累(格里斯试剂与亚硝酸发生反应变红色)，若培养液仍为无色说明无亚硝酸， 有没有发生还原则需加入过量Zn粉进一步确认，如仍不变色说明还原反应完全，硝酸盐均被还原成 气态氮气；如培养液由无色变为红色说明未发生还原。(Zn可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，菌液中如 存在硝酸盐，与Zn反应后，格里斯试剂与亚硝酸发生反应变色)。硝酸盐液体培养基配方同硝酸盐固 体培养基，只是不含琼脂。
(6)反硝化菌的分类鉴定利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR。扩增其 16SrDNA并测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对，核苷酸同源性 为99%，鉴定为假单胞菌Pseudomonas; 二是利用革兰氏染色分析和生长特性鉴定。
菌学特征如下菌体直杆状，革兰氏阴性菌，适宜生长温度30-37'C,适宜pH 7.0-7.5,兼性好氧， 在LB、 TSA和硝酸盐固体培养基上均为黄色、不规则形、粗糙的菌落(见图2).
实施例2:假单胞菌SH12的反硝化曲线
挑取假单胞菌SH12单克隆接种到10 ml硝酸盐液体培养基中，置37'C温箱中静置培养48小时， 此时细胞密度OD600为1.00左右，保存在4'C冰箱，作为种子菌液用于接种。以1%的接种量吸取1 ml到100ml新鲜硝酸盐液体培养基中，间隔12个小时设置一个监测点，每个监测点做3个重复，置 37。C温箱中静置培养。每间隔12个小时取出相应监测点的菌液，其中5ml用于测定pH值，5ml用于 测定细胞密度OD600,其余液体于12000rpm离心10min，将上淸通过大孔树脂吸附柱预处理后'用
紫外-可见光分光光度法测定滤液中硝态氮'亚硝态氮，氨氮的含量。；i体做法如下 一是硝态氮浓
皮(OD220-2XOD275)，用常W的双波长紫外分光光度法(可参照常用的教科书或技术手册或生产该仪器厂家的使用说明书操作)测定稀释后的样品在波长220和275nm处的吸光值，并用OD220-2 XOD275得到校正吸光值，再根据标准曲线的公式和相应的稀释度计算硝态氮的浓度。二是亚硝态氮 浓度(OD540),用N- (l-萘基)-乙二胺法测定稀释后的样品在波长540111 处的吸光值，再根据标准 曲线的公式和相应的稀释度计算硝态氮的浓度。三是氨氮浓度(OD420)，用纳氏试剂法测定稀释后 的样品在波长420nm处的吸光值，'再根据标准曲线的公式和相应的稀释度计算硝态氮的浓度。绘制 假单胞菌SH12的反硝化曲线(图3)。
实施例3:假单胞菌SH12在造纸工业废水中对硝态氮的去除效果
采用湖北省武汉地区造纸厂未处理的废水(该废水的采集时间为2007年10月，采集时水温 为30-40'C, pH为7.2-7.6。其硝态氮的起始浓度为18.94mg/L，而亚硝态氮和氨氮的浓度很低)加入 KN03使硝态氮终浓度为200mg/L，来考察假单胞菌SH12对硝态氮的去除效果。具体做法如下将 采集的造纸厂废水经过简单的单层滤纸过滤后,接入预先活化了的反硝化菌(OD600-1.0 ) lml每100ml 废水，37'C静置培养。每间隔12个小时取出菌液，对样品的处理方法和检测方法同上，培养6-15天 后观察硝态氮的实际去除效果，同时检测亚硝态氮和氨氮的积累量(图4)。
由图4看出，在不外加能量物质的情况下，加入本发明的假单胞菌SH12后，硝态氮的浓度在最 初的12小时内直线下降，降解率达到85%以上，且全过程中几乎没有亚硝态氮和氨氮的积累。本发 明菌株是从工业废水环境中分离筛选到的，对工业废水环境具有较强的抗性和适应性，有望在工业废 水生物脱氮方面发挥重要作用。综上所述，假单胞菌SH12对工业废水环境具有较强的抗性和适应性， 在低营养、与其它微生物共存的情况下对硝态氮有很好的去除效果，显示本发明具有较好的应用前景。
权利要求
1、一株反硝化假单胞菌SH12(Pseudomonassp.)SH12保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NOM208238。
2、权利要求1所述的反硝化假单胞菌SH12在工业废水生物脱氮方面的应用。
全文摘要
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株有反硝化作用的假单胞菌SH12选育及其在工业废水生物脱氮方面的应用。本发明的特征是从石油工业废水中分离得到一株有反硝化作用的假单胞菌SH12。该菌株可以将富营养化污染环境中的硝酸盐还原为氮气，极大地降低了环境中硝态氮的浓度并减少了硝态氮转化为有毒的亚硝态氮和氨氮的可能性。本发明菌株被命名为假单胞菌SH12(Pseudomonas sp.)SH12，其保藏号为CCTCC NOM208238。初步研究表明，本发明的菌株在工业废水生物脱氮方面具有较好的应用前景。
文档编号C02F3/34GK101418273SQ200810236658
公开日2009年4月29日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者露 俞, 刘颜军, 王革娇 申请人:华中农业大学