专利名称：：大宝山伯克霍尔德菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物
技术领域：
，特别是涉及一种能耐重金属镉的新的细菌大宝山伯克霍尔德菌及其应用。
背景技术：
：在珠江三角洲地区，重金属污染是土壤污染的重要构成，严重地威胁着农产品的安全性和人体的健康。土壤的重金属污染具有隐蔽性或潜伏性、不可逆性和长期性，造成的后果很严重，影响对象广泛，影响区域广、危害人口多。研发经济高效的污染土壤修复技术是改善我国环境质量的迫切要求，也是世界科技的研究热点。重金属污染土壤的修复包括两种策略一是改变重金属在土壤中的存在形态使其固定从而降低其在环境中的迁移性和生物可利用性(stabilization)，二是从土壤中去除重金属(extraction)。微生物在重金属污染土壤的修复中具有重要的意义，筛选能够耐受重金属的微生物菌种资源成为目前重金属污染修复的热点之一。
发明内容本发明的目的是提供一种能够耐受重金属镉的新的菌种——大宝山伯克霍尔德菌。该菌命名为大宝山伯克霍尔德菌(5wttoWm'aJaZ;acw/w"em/sGIMN1.004)，编号为CCTCCNo.M209109。本发明所述的大宝山伯克霍尔德菌是从广东翁源大宝山矿区的重金属污染土壤中分离培养获得。该菌培养条件为-(1)培养基MGY具体配方如下KCIO.01%;MgS(V7H200.025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025o/o;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;琼脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0;(2)培养温度28°C。本发明大宝山伯克霍尔德菌CSw狄o她由fl^ao^a"e"^GIMN1.004)的分子分类地位的确定。该菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。本发明所述大宝山伯克霍尔德菌具有以下有益效果-本发明所述大宝山伯克霍尔德菌具有耐受重金属镉的能力，其耐受能力强，可以耐受22ramol/L即2640mg/L镉离子浓度，在对重金属污染的土壤修复中起着重要作用。本发明所述大宝山伯克霍尔德菌(万",MoWm'arfakzo^uwCTw/sGIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址武汉大学)，保藏编号为No.M209109。图1是本发明大宝山伯克霍尔德菌的透射电子显微镜照片(A，3000倍；B:6000倍)；图2是本发明大宝山伯克霍尔德菌及部分相关菌株依据16SrDNA序列构建的系统发育树。具体实施例方式以下通过具体实施例来详细说明本发明。实施例l:本发明大宝山伯克霍尔德菌的分离从广东大宝山重金属污染区采集0-30cm土样，取10g土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)，在180rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取O.lmL均匀涂布在MGY琼脂培养基板上，翻转平板置于28"C培养箱中培养2天，即可获得本发明所述的大宝山伯克霍尔德菌(5"Wt/wWe"arfa&jas/w"eH^GIMNI.004)。所述大宝山伯克霍尔德菌(Swtto她n'adfl^as/w"m^GIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址武汉大学)，保藏编号为No.M209109MGY琼脂培养基KCIO.01%;MgS04.7H200,025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025%;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;琼脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0:本发明的大宝山伯克霍尔德菌CBw狄o她riacfa6aos/!OTOT^GIMN1.004)具有下述性质1.形态特征大宝山伯克霍尔德菌在MGY琼脂培养基平板上能产生紫色颗粒；在加有重金属的MGY土音养基中的菌落先呈淡粉色后逐渐转为乳白色，菌落圆形，表面皱縮。在NA培养基中菌落圼蓝灰色；菌株GIMN1.004革兰氏染色为阴性，菌体杆状；通过投射电镜'菌体内可观察到颗粒状物质。如图1所示。.2.生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通过Bk)log试验，本发明的大宝山伯克霍尔德氏菌能利用一下碳源AdonitolAmygdalinArbutinD-Cellobiosea-CydodextrinB-Cyclodextrini-ErythritolD-FructoseL-FucoseD-GalacturonicAcidGertibioseGlucose-1-PhosphateGlucose-6-Phosphatea-D-LactoseLactuloseMaltoseMaltotrioseD-MetezitoseD-Melibiose3-Methyl-D-GlucoseB-Methyl-D-GalactosideB-Methyl-D-GlucosideL-RhamnoseStachyoseSucroseTuranoseFormicAcida-HydroxybutyricAcidItaconicAcida-KetobutyricAcida-KetovalericAcidD，L-LacticAcidL丄acticAcidD-LacticAcidMethylEsterD-MalicAcidPropionicAcidPyruvicAcidMethylEsterD-SaccharicAcidSuccinamicAcidSuccinicAcidSuccinicAcidMono-MethylEsterUrocanicAcidL-AlaninamideL-Alanyl-LThreonineL-AsparagineL-GlutamicAcidGlycyl-L-AsparticAcidGlycyl-L-GlutamineGlycyl-L-Proline2ADeoxyAdenosineThymidineUridineUridine-5/-Monophosphatem-Inositola-Methyl陽D-Galactosidea-Methyl-D-GlucosideD-RaffinoseSalicinAceticAcidFumaricAcidL-Alanyl-L-GlutamineL-MethionineN-Acetyl-D-GlucosamineN-Acetyl-B-D-MannosamineD-GluconicAcidD-GlucosaminicAcidPyruvicAcidL-Alanyl-L-HistidineInosinea-D-LactosePalatinoseL-Alanine]L-Serine。3.其他性质甲基萘醌的主要类型为MK-8，细胞壁脂肪酸种类和含量如表1。表1细胞壁脂肪酸种类和含量PercentCommentlComment212:01.77ECLdeviates0.002Reference0.00213:1at12-130.91ECLdeviates-0.00214:04.18ECLdeviates-0.007Reference-0.00813:0iso3OH2.40ECLdeviates0.00715:1isoF2.14ECLdeviates0.010SumInFeature11.34ECLdeviates-0.00413:03OH/15:liH15:1anteisoA0.81ECLdeviates0.00515:0iso0.15ECLdeviates-O扁Reference-0.00215:0—ECLdeviates0.00016:0iso0.14ECLdeviates0,005ReferenceO細16:025.05ECLdeviates0.001Reference0.00017:1anteisow9c0.09ECLdeviates-0.00317:0cyclo5.52ECLdeviates0.00317:00.67ECLdeviates0.001Reference0.00116:120HO.卯ECLdeviates0.00416:020H0.90ECLdeviates0.00416:030H1.76ECLdeviates0.00118:3w6c(6，9，12)0.38ECLdeviates0.005SumInFeature50.58ECLdeviates-0.00218:0ante/18:2w6,9c18:1w9c5.23ECLdeviates0.001SumInFeature817.76ECLdeviates0.00118:1w7c18:010.57ECLdeviates-O扁Reference-0.00219:0iso0.47ECLdeviates-O扁Reference-0.00119:0cyclow8c4.55ECLdeviates0.00118:120H0.73ECLdeviates0.00320:4w6,9，12,15c2.35ECLdeviates0.003SummedFeature11.3415:1isoH/13:03OH13:03OH/15:liHSummedFeature22.7412:0aldehydeunknown10.928SummedFeature35.9316:1w7c/16:lw6c16:1w6c/16:lw7cSummedFeature50.5818:2w6,9c/18:0ante18:0ante/18:2w6,9cSummedFeature817.7618:1w7c18:1w6c实施例2:本发明大宝山伯克霍尔德氏菌16SrDNA的序列测定1、PCR模板DNA的快速制备将细菌划线接种在NA培养基的平板上，3(TC培养过夜。取单一菌落悬浮于10nl无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA.2、16SrRNA基因PCR扩增PCR引物由上海英骏公司合成。PrimerA:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'PrimerB:5'-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3'PCR反应体系(总体积50^1):10倍缓冲液5)al,dNTP(2mmo1/1)4[al，PrimerA(10pmo1/1)1^1，PrimerB(10pmo1/1)l(J，Taq酶(2U/1)0.4|al，DNA模板lial,灭菌ddH2037.~1。6PCR扩增条件94。C5min:94。Clmin，58。Clmin,72。C2min,30个循环；72。C7min。3、序列测定PCR产物纯化后，送上海英骏公司用3730全自动测序仪测序，测试结果见附图2。其16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示(登录号FJ210816.1)，测序结果与GenBank数据库中的己知序列进行BLAST比较，确定与本发明的菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。大宝山伯克霍尔德菌的基因序列与Swv^oWeW^TO//sp.nov.(KACC11589)的同源性为99.0%,但是两株菌在菌落形态以及生理生化方面都有较大差异。从系统发育树可以看出，大宝山伯克霍尔德菌与KACC11589和SwrttoWer/asp.A6.2两株菌关系密切，聚成一类构成一个分支，但又独立两株菌。通过DNA-DNA杂交显示，大宝山伯克霍尔德菌与亲缘关系最近的模式菌株KACC11589的DNA-DNA杂交结果为25.0%。本发明的大宝山伯克霍尔德菌与其同源性最高的^/"狄o/c/m'asp.nov.(KACC11589)菌株微生物学特性的比较见表2。表2大宝山伯克霍尔德菌与其同源性最高的Swrtt;/o/c/en'aw//菌株微生物学特性比较特征GIMN1据接触酶一+厌氧生长—一V-P测定一一D-葡萄糖产酸+一L-阿拉伯糖++D-木糖+NDD-甘露醇++明胶水解+一淀粉一一柠檬酸盐利用ND一硝酸盐还原++生长温度最适30°c最适28°C脂肪酸C16:0C18:lw7c醌型泛醌-8ND注+:阳性；-:阴性；ND:表示没有测定综合16SrDNA序列分析和DNA-DNA杂交结果(1987年国际系统细菌学委员会ICSB规定，DNA同源性小于70%或杂交分子的热解链温度差小于或等于2'C为细菌种的界线，Wayneetal,19S7)，本发明的伯克霍尔德氏菌是一种新的细菌，命名为大宝山伯克霍尔德菌(丑wr^2o/c/er/"Z)"Zaas^"wew^s7^GIMN1.004)。实施例3:本发明所述大宝山伯克霍尔德氏菌耐重金属能力测定通过测定微生物对重金属的最大耐受浓度(Maximaltolerantconcentration,MTC)，来确定细菌对某种金属离子的极限耐受浓度。挑取本发明的大宝山伯克霍尔德氏菌菌株的单菌落，接种至装有50mL液体NA培养基的三角瓶中，在28'C的摇床上培养(180转速)至对数生长期，然后将培养好的菌液用接种针划线接种到一系列包含不同浓度的镉离子的NA固体平板上，翻转平板置于28'C培养箱中培养4d后观察菌落的生长。如果在某个浓度只能细微地观察到有菌落的生长，并且在略微高于这个浓度的平板上观察不到菌落的生长，这一浓度便是本发明大宝山伯克霍尔德氏菌菌株对这种金属的最大耐受浓度MTC。测试结果表明，本发明大宝山伯克霍尔德氏菌菌株耐受镉的能力达到22隱ol/L即2640mg/L。序列表〈110〉广东省微生物研究所〈120〉大宝山伯克霍尔德菌及其应用<160>1〈170〉Patentlnversion3.1<210>1〈211〉1437〈212〉醒〈213>^/rA力cJcferz'at/a630s力a"e/357's〈400〉1acacatgcaagtcgaacggcagcacgggggcaaccctggtggcgagtggc50gaacgggtgagtaatacatcgg33CgtgtCCtgg3gtgggggatagcccg100gCg333gCCggattaataccgcatacgctctacggagga33gCggggg3t150cttcggacctcgcgctcaaggggCggCCgEltggcggattagctagttggt200agggtaa鄉cctaccaaggcgacgatccgtagctggtctg3g3gg3Cg3250CC3gCC3CaCtgggactgagacacggcccagactcctacggg3ggC3gC3300gtggggaattttggacaatgggggcaaccctgatccagcaatgccgcgtg350tgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatcc400tttgggctaatacctcggaggg3tg3Cggtaccggaagaataagcsccgg450ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttaatc500gg犯tt3Ctgggcgtsaagcgtgcgcaggcggttcgctaagaccgatgtg550aaatccccgggcttaacctgggsactgcattggtg3Ctggcgagctagag600tgtggcagaggggggt卿attccacgtgt3gC3gtg333tgcgtag3ga650tgtggaggaataccgatggcgsaggcagccccctgggctaacactgacgc700tcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc750acgccctaaacgatgtcaactagttgttggggattcatttccttagtaac800gt3gct犯cgcgtg33gttgaccgcctgggg3gt3CggtCgcaagattaa850aactc犯agg犯ttgacgggasttcgatgc33cgcg犯a3cctgctg卿ggtgagagtgatggctgtcgtcagctcgtgagcgcaacccttgtctctagCCggtg3C333ccggagg犯ttatgggtagggcttcacacaacccgcg3ggggg3gCt33actctgcaetctcgagtgcatgcatgccgcggtgsatacgtccatgggsgtgggtttt3CCggtcaccacggtaggattcagacccgcac3agcggtggstaccttacctacccttgacatctcga犯gag3accgtcgcatCgtg卿tgttgggtt33gttgctacgaaagggcactctggtggggatgacgtcaagtcgtc3tac3atggtcgg犯C3tcccaga犯accgatcgtaggaagctggaatcgctagtaatcccgggtcttgtacacacc3gaagtggct3gtcta3ccgtgsctggggtgaagtcgg3tgtgg3tt■ggacggaatc950C3ggtgCtgC1000tcccgcaacg1050agagag2ictg1100ctcatggccc1150gsgggttgcc1200tccggattgc1250tcgcggatca1300gcccgtcaca1350C33gg3gg3C1400143权利要求1.大宝山伯克霍尔德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，其特征在于其保藏编号为CCTCCNo.M209109。2.根据权利要求1所述的大宝山伯克霍尔德菌(^/nWwWm"i/aMayfejTKTO:"G1MN1.004),其特征在于该大宝山伯克霍尔德菌Ow狄。/血riacfo&aas/w朋m^GIMN1.004)的16SrDNA序列如SEQIDNO:l所示。3.根据权利要求1或2所述的大宝山伯克霍尔德菌(S"7^。Wen'aifaZ)ao^朋era"GIMN1.004)，其特征在于具有以下的微生物学特征-a)形态特征所述大宝山伯克霍尔德菌在MGY琼脂培养基平板上能产生紫色颗粒；在加有重金属的MGY培养基中的菌落先呈淡粉色后逐渐转为乳白色，菌落圆形，表面皱縮；在NA培养基中菌落呈蓝灰色；菌株GIMN1.004革兰氏染色为阴性，菌体杆状；通过投射电镜，菌体内可观察到颗粒状物质；b)生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>C)其他特征所述大宝山伯克霍尔德菌甲基萘醌主要类型为MK-8。4.权利要求1-3任一项所述的大宝山伯克霍尔德菌(5w狄oWeh"(foZ)ao^a"e"^'GIMN1.004)在耐重金属镉中的应用。全文摘要本发明公开了一种大宝山伯克霍尔德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，该菌已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2009年5月10日，保藏编号为CCTCCNo.M209109。本发明大宝山伯克霍尔德菌具有耐重金属镉的能力，其耐重金属能力强，在对重金属污染的土壤修复中起着重要作用。文档编号B09C1/10GK101684452SQ200910040518公开日2010年3月31日申请日期2009年6月24日优先权日2009年6月24日发明者朱红惠,俊郭,郭建华,黎志坤申请人:广东省微生物研究所