专利名称：脱除水体中亚硝酸态氮素污染的产碱杆菌mb-n6及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物治理污染领域，具体涉及一种治理废水或环境中有毒物质的微 生物菌株以及它的用途。
背景技术：
水产养殖和环境保护中，氮素污染尤其是氨氮和亚硝酸盐氮的污染对许多水产动 物有一定的毒害作用。因养殖水体的环境承载能力有限，其自身氮素污染日趋严重，养殖水 域的环境质量日益下降。水域环境污染不仅直接对养殖品种造成危害，而且可通过改变水 域的微生态，使得病原微生物滋生繁衍，导致养殖品种暴发病的发生。在养殖水域氮素污染 的控制上，以往一般采用单一的理化方法，虽然取得了一定的成效，但同时存有种种弊端， 如能源消耗过大，易产生二次污染等。因此生物控制技术便得到人们的重视。目前国内外 一般采用单一或复合微生态菌种来控制氮素污染。二十世纪八十年代，我国的台湾省和东 南亚等国率先应用光合细菌来控制养殖水体的水质，取得了一定的成果，并开创了生物制 剂控制养殖水质的先河。九十年代后国内也采用光合细菌来净化养殖水域环境，效果比较 明显。九十年代中期开始，国内外又采用如玉垒菌、硝化细菌等生物制剂来净化水质，效果 也不错。这些生物处理的方法，由于具有投资少，成本低，应用范围广等特点，已越来越受水 产工作者的重视和欢迎。因此研制高效与专一的复合微生态制剂调控养殖水体环境，促进 水产养殖业的可持续发展，保证水产品质量及降低成本具有非常重要的意义。目前普遍认 为生物脱氮是从水体中去除氮素污染的经济有效的方法之一。在此基础上，国内外在90年代后期大量采用复合微生态制剂技术。复合微生态 制剂技术是脱除不同种属微生物的不同性质，通过微生物的互生和共生作用，最大限度地 去除水体中的各种有害成分。目前应用较为成功的是EM菌。但这些产品均是从国外引进 的，国外最初在研制这些产品时并非从水产养殖水体控制的目标出发，而主要侧重于环保 领域。因此在菌株的选择上主要考虑其降解性能，没有考虑其对水产养殖生物的安全性问 题。如有些产品中含有荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)等，这些菌株对养殖水 生生物来说是致病菌。综合来看目前尚无一种比较适合我国水产养殖业的高效复合菌制剂 及其控制技术。传统生物脱氮包括硝化和反硝化两作用过程。一般认为硝化作用只发生在好氧 条件下，而反硝化只能在厌氧或缺氧的条件下进行。但是，在虾等特产高密度养殖中，由于 必须连续充氧以保证水中一定的溶解氧，厌氧反硝化细菌的反硝化作用不能充分发挥(Pai s L, Chong N M, Chen C H. Bioresource Technology, 1999,68 179—85)。20 世纪 80 年代 以来，科学家对好氧反硝化的研究日趋活跃，一些好氧反硝化菌被陆续筛选出来作为新型 脱氮细菌。目前国外已发现的好氧反硝化菌有异养球硫细菌(Thiosphaera Pantotropha) (Robertson, L. Α. ,Ε. W. J. van Niel, R. A. M. Torres mans, et al. Appl. Environ. Microbiol, 1988,54 :2812-2818.)、海洋假单胞菌(Pseudomonas nautical) (Frette L, Gejlsbjerg B, Westermann P. FEMS Microbiology Ecology, 1997,24 :363_370.)和奈瑟菌科的
3Microvirgula aerodenitrifica等。国内对好氧反硝化菌的筛选、研究和应用研究还处于 起步阶段。目前尚未见到有关专门筛选选育可脱除亚硝酸盐氮、改良水体氮素富营养化的菌 株以及微生物制剂和它的用途方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术的缺陷，通过人工驯化，筛选得到一株好氧反硝 化菌，研究了在不同浓度亚硝酸盐氮、硝态氮和多种配合菌协同条件下该菌反硝化能力的 强弱，并且试验了混合微生物菌剂降解氨态氮和实际大田应用的效果，探讨了该菌和脱氮 微生物制剂脱除水中亚硝酸盐氮和氨氮的能力，为水产养殖生物除氮寻求了更为高效、经 济的水质改良方法。本发明通过以下技术方案实现本发明所述的脱除废水或环境中残留的亚硝酸盐氮的菌株，是产碱杆菌 (Alcaligenes sp. )MB_N6，保藏在 CCTCC,保藏编号 M2010014。一种脱除微生物菌株脱除废水或环境中残留的亚硝酸盐氮的方法，是用产碱杆菌 CCTCCM2010014脱除废水中残留的亚硝酸盐氮。本发明公开了上述产碱杆菌在脱除水体中亚硝酸态氮素污染中的应用。本发明所述的亚硝酸盐氮素是亚硝酸及其可溶性盐。本发明所用的菌株分离筛选方法、脱除力测定方法及所分离筛选得到的菌株的特 性如下采集南京市一市政污水处理厂曝气池污污水样品本，依据Naoki Takaya等建立的 有氧反硝化菌平板分离方法进行初步筛选。将菌落划线培养于添加亚硝酸盐的培养基进行 复筛和纯化。通过测定纯化菌株对亚硝酸盐的降解能力作进一步的验证。将初筛时出现的 阳性结果挑选到反硝化培养基中，摇瓶培养并测定硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度。根据亚硝 酸盐氮脱除的速度和能力选出的高活性反硝化细菌取合适稀释度的纯培养菌液涂平板培 养。待长出菌落后，观察菌落的大小、颜色等特征。革氏染色，显微镜观察其个体形态。经 革兰氏染色阴性，芽孢染色观察，不产芽孢。葡萄糖氧化不产酸产气，接触酶试验阳性，吲哚 试验阴性，甲基红试验阳性，伏普试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硫化氢试验阴性。经《伯杰 氏细菌鉴定手册》鉴定，初步鉴定该菌为产碱杆菌。将其命名为MB-N6。菌株MB-N6的系统 发生树的结构如图1所示。菌株MB-N6于2010年1月18日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位 地址武汉大学。分类命名为产碱杆菌MB-N6 (Alcaligenes sp. MB-N6)，保藏在，保藏编号 CCTCCNo. M2010014ο在好氧条件下菌株MB-N6对亚硝酸盐氮的脱除实验证明，在最适脱除温度下 MB-N6菌株在60小时内对不同浓度的亚硝酸盐氮均有反硝化能力，且亚硝酸盐氮浓度越高 反硝化能力越强。现据报道已知多数反硝化菌的反硝化能力在50%左右，而MB-N6菌株最 高反硝化脱除能力可达78%，明显高于其他。在脱除过程中没有积累中间代谢产物。且在 不同浓度的硝态氮胁迫条件下，MB-N6均可在60小时内高效脱除亚硝酸盐氮，反硝化能力 增强达到90%以上，反硝化能力提高。
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采用对氨氮脱除和蛋白质降解效果较好的菌株MB-HKF(购自南京尊微生物技术 有限公司)和MB-LA(购自南京尊微生物技术有限公司)与MB-N6协同作用脱除亚硝酸盐 氮试验方法证明混合菌剂在模拟自然水体中能有效脱除氨态氮素，其脱除率在48小时内 达到最大。将混合菌剂田间对亚硝酸盐氮和氨氮脱除显示使用混合菌剂后亚硝酸盐氮和氨 氮浓度均有显著降低，同时水色在使用后有明显改善，由含有绿藻和绿藻的青绿色转变为 含有绿藻和硅藻的黄绿色。本发明的积极效果亚硝酸盐是一种有毒、致癌的化合物，对含亚硝酸盐废水的处理是环保工作者面 临的重要课题。本发明分离筛选的脱除亚硝酸盐氮的产碱杆菌菌株MB-N6不但具有较强的 好氧脱除亚硝酸盐氮的能力，和其他微生物复配后能更好的发挥好氧反硝化作用，其性能 稳定。菌株MB-N6是从污水处理系统中取样，并经过驯化和纯化分离出来的，对有毒环境有 一定的适应能力，有望在含亚硝酸盐废水处理中发挥重要作用。
图1 是基于16S rDNA序列同源性构建的本发明菌株MB-N6和其它相关细菌的系 统发生树。图2 是本发明的产碱杆菌MB-N6对不同浓度亚硝酸盐氮的脱除曲线。图中纵坐 标代表亚硝酸盐氮的浓度；横坐标代表时间。图3 是本发明的产碱杆菌MB-N6在不同硝酸盐氮浓度下对亚硝酸盐氮的脱除曲 线。图中纵坐标代表亚硝酸盐氮的浓度；横坐标代表时间。图4 是本发明的产碱杆菌MB-N6和另外两种功能菌复配后制成的微生物制剂对 亚硝酸盐氮的脱除曲线。图中纵坐标代表亚硝酸盐氮的浓度；横坐标代表时间。图5 是本发明的产碱杆菌MB-N6和另外两种功能菌复配后制成的微生物制剂对 氨氮的脱除曲线。图中纵坐标代表氨氮的浓度；横坐标代表时间。
具体实施例方式本发明所述培养基配方中百分数均指质量百分数实施例一、菌株MB-N6的分离筛选(1)样品采集和驯化采集南京市江心洲污水处理厂曝气池污污水样品本。将样品放置于20 30°C摇 床150r/min，并经常向其中添加一定量的亚硝酸盐以对其中的微生物进行驯化。经过几个 月处理后，即开始从该样品中分离亚硝酸盐氮脱除菌株。剩余样品继续按上述方法保存和 驯化。(2)菌株分离筛选分离筛选用溴百里酚(BTB)培养基0. L-天冬酰胺酸，0. KN03，0. KH2P04,0. 005 % FeC12 · 6H20,0. 02 % CaCl2 · 2H20,0. 1 % MgS04 · 7H20,0. 1 % BTB, 2 % 琼 脂，ρΗ 7. 0 7. 2，培养基呈墨绿色。溴百里酚(BTB)培养基配方为上述液体培养基再添 加琼脂1.6%。LB培养基蛋白胨，0. 酵母膏，0. 8% NaCl，pH 7. 0 7. 5。以上培养基配制后均采用湿热灭菌(121°C ) 30分钟。菌株纯化将BTB培养基加热熔化，摇勻后倒平板。挑取在无机盐固体培养基平板 上长出的蓝色菌落，划线接种于其表面，置28°C培养24 48小时。挑取单菌落，按上述方 法再次纯化一至三次，直至最后长出的菌落均一、镜检后确定为纯种为止。亚硝酸盐氮脱除能力测定脱除力测定用反硝化培养基，其配方为0. 472%琥珀 酸钠，10mmol/L NaNO3,0. 11% KH2PO4,0. 042% Na2HPO4,0. 06% NH4Cl, 0. 5 % 酪蛋白，0. 1% MgSO4 · 7H20, 2mL的微量元素溶液/L，pH 7. 2。。湿热灭菌(121°C ) 30分钟。亚硝酸盐氮于 接种前分别添加。用接种环挑取2 3环纯化菌株，接种于上述添加亚硝酸盐氮的反硝化 培养基中，置28°C摇震培养2 7天。将培养液离心，采用N-(l-萘基)-乙二胺盐酸比色 法测定一次样品中的亚硝酸盐氮含量。采用有氧反硝化菌平板分离方法初筛得到6个BTB阳性反应菌株，摇瓶复筛中发 现其中1株即使周围有较高浓度溶解氧存在仍具有较强的反硝化能力。经革兰染色，镜检 观察，该菌株为革兰阴性杆菌、短杆状、不产芽孢、不发酵葡萄糖产酸产气。将其命名为菌株 ΜΒ-Ν6。实施例二、斜面菌种及其培养培养基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15 20g，水1000 毫升，pH7. 2。培养基分装试管(18X 180mm)，装量10ml，塞上棉塞，湿热灭菌(121°C ) 30分 钟。待温度降至50°C左右时，摇勻后摆成斜面。采用无菌操作接种MB-N6菌株于试管斜面，28°C培养24 48小时，肉眼观察菌苔 丰满。置4°C可保存三个月至六个月。实施例三、菌株MB-N6在液态条件下对亚硝酸盐氮的脱除(1)菌株MB-N6在LA培养基表面扩大培养LA培养基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培养基湿热灭菌(121°C)30分钟。将上述固体培养基加热熔化，待温度 降至50°C左右时摇勻倒平板。取试管斜面菌种，接种于液体LA培养基中，置28°C培养24 48小时。(2)对亚硝酸盐氮的脱除人工模拟池塘母液蔗糖27. 5克，酵母膏0. 3克，NH4Cl 7. 3克，KH2PO4 2. 5克， K2HPO4 · 3Η201· 3克，NaHCO3 33. 0克，水1000ml。将母液稀释60倍后作使用液。湿热灭菌 (121°C)30分钟。根据实验要求，将50-150mg/L的亚硝酸盐氮于接种前添加。用接种环 挑取2 3环试管斜面菌种，接种于上述添加亚硝酸盐氮的人工模拟池塘污水培养基中，置 28°C摇震培养4 7天，培养过程中取样测定培养液中的亚硝酸盐氮含量。方法为将培养 液离心，每12h采用N-(l-萘基)-乙二胺盐酸比色法测定一次样品中的亚硝酸盐氮含量。在上述液态条件下，菌株ΜΒ-Ν6对亚硝酸盐氮的最适脱除温度为25-30°C，脱除 期在25-30°C温度下为12-60h ；在15°C温度下，48h开始脱除。在最适脱除温度下MB-N6 菌株在60小时内对不同浓度的亚硝酸盐氮均有反硝化能力，且亚硝酸盐氮浓度越高反硝 化能力越强。现据报道已知多数反硝化菌的反硝化能力在50%左右，而MB-N6菌株最高反 硝化脱除能力可达78%，明显高于其他。典型的脱除曲线见图2所示。实施例四、菌株MB-N6在硝态氮胁迫下对亚硝酸盐氮的脱除
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(1)菌株MB-N6在添加亚硝酸盐氮的LA培养基表面扩大培养和活化LA培养基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培养基湿热灭菌(121°C)30分钟。将上述固体培养基加热熔化，待温度 降至50°C左右时摇勻倒平板。取试管斜面菌种，接种于液体LA培养基中，置28°C培养24 48小时。(2)在硝态氮胁迫下对亚硝酸盐氮的脱除人工模拟池塘母液蔗糖27. 5克，酵母膏0. 3克，NH4Cl 7. 3克，KH2PO4 2. 5克， K2HPO4 · 3Η201· 3克，NaHCO3 33. 0克，水1000ml。将母液稀释60倍后作使用液。湿热灭菌 (12ΓΟ30分钟。根据实验要求，调整初始亚硝酸盐氮浓度为30mg/L，硝态氮浓度分别为 50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L ；在 30°C，100r/min 摇床培养 60h，培养基 DO 值为(9.0士0.5)mg/L。每12h采用N-(l-萘基)-乙二胺盐酸比色法测定一次样品中的亚 硝酸盐氮含量。在不同浓度的硝态氮胁迫条件下，ΜΒ-Ν6均可在60小时内高效脱除亚硝酸盐氮， 反硝化能力增强达到90%以上，反硝化能力提高。实施例五、菌株ΜΒ-Ν6和其他功能菌复配制剂对亚硝酸盐氮和氨氮的脱除(1)菌株ΜΒ-Ν6、BMB-LA和BMB-HKF的扩大培养和活化LA培养基配方胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15 20g，水 1000毫升，PH7.2。培养基湿热灭菌(121°C)30分钟。将上述固体培养基加热熔化，待温度 降至50°C左右时摇勻倒平板。分别取试管斜面菌种，接种于液体LA培养基中，置28°C培养 24 48小时。按照3 2 1的比例进行复配制成混合制剂。(2) MB-N6和其他功能菌BMB-LA、BMB-HKF复配制剂对亚硝酸盐氮和氨氮的脱除将混合菌剂接种于IOOmL无氮源人工模拟池塘水三角瓶中，调整初始亚硝酸盐氮 浓度为 211^/1，301，10017/1^11摇床培养6011，培养基00值为(10. 0士0. 5)mg/L。每 12h 采 用N-(l-萘基)-乙二胺盐酸比色法测定一次样品中的亚硝酸盐氮含量。结果显示(图3)， 在模拟自然水体的亚硝酸盐氮浓度下，配合菌协同ΜΒ-Ν6脱除亚硝酸盐氮的速度很快，脱 除率在12小时内即可达到95%以上。相比较ΜΒ-Ν6单独进行反硝化脱除亚硝酸盐氮，加入 配合菌后其脱除率有了较大提高。将混合菌剂转接IOOmL无氮源人工模拟池塘水三角瓶中；调整初始氨态氮浓度为 10mg/L, 30°C，100r/min摇床培养60h混合培养，培养基DO值为(8. 0 士0. 5)mg/L ；每12h按 纳氏比色法测定一次样品中的氨氮含量。结果显示(图4)，混合菌剂在模拟自然水体中能 有效脱除氨态氮素，其脱除率在48小时内达到最大。实施例六、菌株MB-N6和其他功能菌复配制剂在大田条件下对亚硝酸盐氮和氨氮 的脱除(1)菌株MB-N6、MB-LA和MB-HKF的扩大培养和活化扩增培养基一级培养基蛋白胨，葡萄糖2%，0. 5% NaCl, 0. 5%酵母浸取汁， pH 7. 0 7. 5 ；二级培养基蛋白胨，葡萄糖 2%，0. 5% NH4H2PO4,0. 3 % KH2PO4,0. 2% MgSO4,0. 2%酵母膏，3mL的微量元素素溶液化―1，pH 7. 0 7. 5。挑取单菌落分别将MB-N6、 MB-LA和MB-HKF接种一级培养基，过夜活化。按1 %接种量转接扩增二级培养基，30°C， 120r/min摇床培养48h。把三种扩培的菌液按3 2 1的比例复配制成混合菌剂。
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(2) MB-N6和其他功能菌MB_LA、MB_HKF复配制剂大田条件下对亚硝酸盐氮和氨氮 的脱除2007年8月，在江苏省吴江市某南美白对虾养殖池塘中先后进行了两次田间试 验第一次塘口面积12. 5亩，水深1. 3米，水体中初始氨氮浓度0. 5mg mg/L，亚硝酸盐氮浓 度0.9mg/L。使用浓度2亩 米/500mL(0.25mg mg/L)；第二次使用，塘口面积15亩，用量3 亩 米/500mL (0. 167mgmg/L)，水体中亚硝酸盐氮初始浓度0. 35mg/L,氨氮初始浓度0. 4mg/ L。分别各连续使用六天。通过试剂盒测定池塘水中亚硝酸盐氮和氨氮的含量；通过水色观 察水质是否得到改善。结果显示(表1、表2)，使用混合菌剂后亚硝酸盐氮和氨氮浓度均有显著降低，同 时水色在使用后有明显改善，由含有绿藻和绿藻的青绿色转变为含有绿藻和硅藻的黄绿 色。表1是本发明的复配微生物制剂在第一次田间实验时对亚硝酸盐氮和氨氮的脱 除情况。表2是本发明的复配微生物制剂在第一次田间实验时对亚硝酸盐氮和氨氮的脱
除情况。
权利要求
一种产碱杆菌菌株，其特征在于，是产碱杆菌MB N6(Alcaligenes sp.MB N6)，保藏编号是CCTCC M2010014。
2.权利要求1所述产碱杆菌在脱除水体中亚硝酸态氮素污染中的应用。
3.根据权利要求2的所述的应用，其特征在于，所述的亚硝酸盐氮素是亚硝酸及其可 溶性盐。
全文摘要
本发明属于治理水产养殖及废水中氮素污染的微生物菌株的发明以及该菌株在好氧条件下脱除亚硝酸盐氮和其它残留物质的用途发明。本发明的主要特征包括，驯化筛选和选育成一种专门在好氧条件下脱除亚硝酸盐氮的产碱杆菌菌株MB-N6(Alcaligenes sp.MB-N6)，保藏编号是CCTCC M2010014。该菌株可在高溶氧条件下充分脱除目前水产养殖中产生的高浓度亚硝酸盐氮的污染。与已有技术相比，本发明的菌株专一性和适应性强，便于增殖和脱除开发。
文档编号C02F3/02GK101914464SQ20101016611
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者何伟, 钟文辉 申请人:南京师范大学