专利名称：一种ddt残留污染土壤生物修复方法
技术领域：
本发明涉及环境保护技术领域，尤其涉及一种DDT残留污染土壤生物修复方法。
背景技术：
农药是土壤的主要污染源之一，DDT等禁用农药残留污染，这在某些地区土壤中残 留水平仍居高不下，我们检测到某地土壤中DDT检出率100%，含量最高达1. 19mg/kg，大多 数在0. 46 0. 93mg/kg，低的达0. 14 0. 29之间。土壤中农药残留污染对土壤生态系统 构成一定程度的危害，更重要的是对农产品和中药材造成污染，危害人体健康，影响农产品 和中药材出口创汇。因此，同时研发DDT等禁用持久性农药残留污染土壤的生物修复技术 和产品，对于保障土壤环境质量和农产品、中药材安全，促进国民经济健康运行具有重要意 义。生物强化是促进有机污染物降解、优化土壤生物学功能的重要手段，以污染土壤 生物修复为目的的生物强化主要利用高效降解菌，通常采用的高效降解菌包括土著菌、外 源菌以及基因工程菌。高效降解菌进入污染土壤面临两个问题1)由于生物和非生物的 胁迫作用，引入的微生物难以适应土壤环境维持长期的降解活性；2)存活的降解菌在土壤 中难以达到良好的广深分散，限制了土壤整体降解能力与净化功能的提高(Gentry etal.， 2004 ；Moran et al.，2006)。如何有效地促进土壤微生物对污染物降解功能网络的形成是 土壤污染生物修复的关键问题和技术瓶颈。有机污染物在土壤中的降解主要是由微生物驱动的，土壤细菌适应并降解污染物 的分子机制包括基因水平转移(horizontal gene transfer)、突变以及DNA重组，其中基 因水平转移是细菌基因组和降解功能进化的重要机制(Ochman et al. ,2000 ；Arber, 2000 ； Gogarten 和 Townsend，2005 ；林晓燕等，2005)，Lawrence 和 Ochman (2002)通过序列分析指 出Escherichia coli基因组27%是通过基因水平转移获得的。土壤细菌对外源性有机污 染物的降解功能基因大多位于宿主广泛的IncP-I质粒(Nojiri et al.，2004)，如pMCP424 等质粒上的有机磷杀虫剂降解基因opd(Bhadbhade et al. ,2002 ；Horne et al. ,2002)；质 粒 pRCl 上的杀虫剂甲萘威水解酶基因(Hashimotoet al. ,2006) ；pJP4、pADP-1、pEST4011 等质粒上的除草剂阿特拉津的降解基因atzABC、atrzD、atzBC (Rousseaux et al.，2002， Trefault et al. ,2004 ；Aislabie et al.，2005)。IncP-1 质粒具有转移性和宿主广泛性的 特点，可以通过转化、接合和转导等途径在土壤细菌间发生转移，如除草剂2，4-D降解质粒 PJP4 πΤΙ^/Λ Escherichia coli ATCC 15224 Burkholderia^Pseudomonas
菌，转化子达到IO7-IO8/克土壤，后者获得2，4-D降解能力(Newby et al. ,2000a)；阿特拉 津降解质粒 PADPl :Tn5 可以从供体菌 Agrobacterium tumefaciens 转入 4 种 Variovorax 土壤细菌(Devers etal.，2005) ；Gelder等(2005)在活性污泥中检测到抗性质粒pB10从 不同供体菌 Pseudomonas putida SM1443、Ralstonia eutropha JMP228、Sinorhizobium meliloti RM1021 转入到 15 个属(α-and γ-Proteobacteria)的细菌，共分离到 306 个转 化。
发明内容
本发明提供了一种DDT残留污染土壤生物修复方法，解决了传统方法微生物难以 适应土壤环境和分散困难的问题。一种DDT残留污染土壤的生物修复方法，包括将鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留DDT的土壤中。鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp. )DDT_6保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学 的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2008年8月5日，保藏号为CCTCC M 208116，该菌株的生理学特征以及分离纯化方法已于专利200810120741. 8中公开。本发明方法适用于所有土壤，优选的，所述的土壤pH值为5 9 ；所述的土壤DDT 含量在0. 1 2mg/kg ；；所述的土壤有机质含量5 50g/kg。优选的，一种DDT残留污染土壤生物修复方法，具体包括将含鞘氨醇杆菌DDT-6 或所述转化子的菌液喷洒到土壤上，每平方米喷洒菌体数量为5 X IOki 5X 1012。优选的，所述转化子的宿主菌为E. Coli TG1。本发明还提供了 一种权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp.) DDT-6携带的质粒及包含该质粒的转化子。本发明鞘氨醇杆菌DDT-6携带的质粒具有降解DDT的基因，使得它具有降解DDT 的性能，更重要的是该质粒为可转移质粒，通过在土壤中接种该质粒或者含该质粒的菌株， 该质粒可以转化到土壤微生物中，甚至可能与土壤微生物中基因发生重组，一方面解决了 外源微生物在土壤中生存困难的问题，另一方面降解菌能最大限度的分散，尽可能地降解 DDT。
图1为室内试验土壤中DDT降解质粒在土壤微生物间转移的荧光观察图；图2为田间试验各处理土壤中DDT的降解情况图(A =CK ；B :pD0D_gfp ；C Sphingobacterium sp. DDT-6(pDOD-gfp) ；D :Ε·Coli TGl (pDOD-gfp))；图3为各菌株及质粒不同时间的DDT降解率；图4为各菌株及质粒接种到土壤后不同时间的降解菌数量。
具体实施例方式鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp. )DDT_6在2008年8月5日保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 208116，该菌株的生理学特征以及分离纯化方 法已于专利200810120741. 8中公开。培养基Luria-Bertani培养基(LB培养基)酵母膏5. Og ；蛋白胨10. Og ；氯化钠10. Og ； 蒸馏水IOOOml ；pH7. 0，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)；M 培养基=K2HPO4 · 3H20 2. 96g ；KH2PO4 0. 87g ； (NH4)2SO4L Ig ；MgSO4 0. 097g ； MnSO4 ·Η20 0. 025g ；FeSO4 ·7Η20 0. 005g ；CaSO4 0. 0015g ；抗坏血酸0. 005g ；蒸溜水 IOOOml ； PH7. 0，高压蒸汽灭菌(121°C，20min)；
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无机盐培养基=MgSO4· 7H20 0. 4g ；FeSO4 · 7H20 0. 02g ;Κ2ΗΡ040· 2g ； (NH4)2SO4O. 2g CaSO4O. 08g ；蒸馏水 1000ml ；ρΗ7· 0 ；高压蒸汽灭菌(121°C，20min)；LB固态培养基在LB培养基中加入20g琼脂，高压蒸汽灭菌(12rC，20min)；M固态培养基在M培养基中加入20g琼脂，高压蒸汽灭菌(12rC，20min)。降解质粒及其功能鞘氨醇杆菌DDT-6中的质粒DNA使用Axygen质粒DNA小量提取试剂盒提取，该 试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性的吸附DNA的方法快速纯化质粒 DNA，提取出的质粒DNA的大小和质量通过的琼脂糖凝胶电泳进行检测。挑取鞘氨醇杆菌DDT-6的单菌落于3ml LB培养基中，在30°C条件下在摇床中振荡 培养过夜，然后取200 μ L菌液，分别接入含吖啶橙浓度为150mg -L^^OOmg -L-\450mg -Γ1 的5ml LB培养基中，30°C摇床振荡培养24h，稀释至10_5，并涂布于LB固态培养基上，42°C 培养24h，再于30°C培养24h，然后取若干个单菌落分别稀释至10_5并涂布于LB固态培养基 上，30°C培养过夜，再挑取单菌落分别点种于LB固态培养基及M固态培养基(含p，p' -DDT 20mg · Γ1)的对应位置，培养2-3d观察在两种固态培养基的生长情况。在M固态培养基 (含p，p' -DDT 20mg · Γ1)上不生长的菌落可以初步视为质粒消除菌。降解质粒DNA 20 μ L加入感受态Ε. Coli TG1、土著菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)TST中(其中Klebsiella sp. TST为试验材料，无特异性要求)，轻轻摇勻，冰浴放 置30min，42°C水浴中热击90s后迅速置于冰浴冷却5min，加入Iml LB液体培养基，混 勻后在37°C振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状态，分别取100 μ L涂布M平板(含p， p' -DDT 20mg · L—1)，于30°C培养2_3d观察细菌生长状况，筛选转化子E. Coli TGl (pDOD) 和 Klebsiella sp. TST(pDOD)。在灭菌的IOOml三角瓶中加入20ml无机盐培养基，添加葡萄糖浓度为50mg · Γ1, ρ，ρ ‘ -DDT 浓度为 20mg · Γ1，分别接种 Sphingobacterium sp. DDT-6、E. Coli TGU Klebsiella sp. TST,Ε. Coli TGl (pDOD) ,Klebsiella sp. TST (pDOD)(菌浓度 0D_ = 0· 7)。 在PH7.0、30°C、150r .miiT1的条件下振荡培养，21d后定时取样。同时设不加菌的对照，对 照和处理各为3个重复。各处理DDTs降解情况见表1。表1不同菌株对ρ，ρ ‘ -DDT的降解
菌株降解率(％)Sphingobacterium sp. DDT-648.65±3.4E. Coli TGl4.8±0.6Klebsiella sp. TST5.2±0.7Ε. Coli TGl (pDOD)25.01士 1.9Klebsiella sp. TST (pDOD)24.32±2.8CK4.0±0.9 表1结果显示，不具DDTs降解功能的E. Coli TGU Klebsiella sp. TST转入质粒 PDOD后均获得降解功能，说明质粒pDOD编码DDTs降解功能。荧光标记质粒pDOD-gfp的构
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荧光标记质粒pDOD-gfp的构建采用三亲杂交法，具体操作如下 Sphingobacterium sp. DDT-6、E. coli DH5 α (pZP201_gfp)、E. coli HB 101 (pRK2013)的 单菌落分别接种至4ml LB液体培养基中30°C摇床中振荡培养7h，以Sphingobacterium sp. DDT-6 :E.coli DH5α (pZP201-gfp) :Ε·coliHBlOl(pRK2013) = 1 1 1、1 2 1、 2:1: 1三个比例混合，150rpm、30°C摇床振荡培养5h后取出50μ 1混合菌液至LB液体 培养基(P，P' "DDT IOmg -Γ1)中静置培养24h，培养液稀释至10_3接入含硫酸卡那霉素和 盐酸壮观霉素(SOmg·!/1)的LB琼脂培养基平板中培养，24h后观察菌落生长情况。利用 交叉抗性(表2)、荧光标记以及降解功能筛选出Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)。 采用“降解质粒及其功能”中的方法，制备pDOD-gfp、Ε. Coli TGl (pDOD-gfp)、Klebsiella sp.TST (pDOD-gfp)。^ 2 Sphingobacterium sp. DDT-6> E. coli DH5 α (pZP201-gfp) > E. coli HBlOl (pRK2013)的交叉抗性 注(+)阳性；(_)阴性实验室条件下土壤中DDTs降解的生物强化鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp.)DDT-6、E. Coli TGU Klebsiella sp. TST> Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、Ε. Coli TGl (pDOD-gfp)、Klebsiella sp. TST (pDOD-gfp)分别于 IOOmlLB 培养基中，在 30 °C、150r · mirT1 条件下培养 24h, 8000r ^irT1离心5min，弃上清液，用无机盐培养基清洗离心3次，用平板计数法计数待用。土壤样品采自浙江大学华家池校区试验田的0-15cm的新鲜土样(土壤主要理化 性质见表3，去除杂草树根石砾等杂质，过2mm筛，风干。每一试验称取干土重为Ikg 土壤， 添加P，P ‘ -DDT至Ippm并添加质粒(lmg/kg)或降解菌，菌量至105CFU/g，过2mm筛三次， 尽量使P，P' -DDT、菌与土壤充分混合，装入培养盆，以锡箔覆盖培养盆(在其上开五个小 孔通气)，在30°C培养箱中避光培养保持土壤含水量为最大持水量的60%，处理后0d、7d、 15d、30d、60d、90d定时取样分析DDT残留量同时采用激光供聚焦观察土壤中降解菌数量变 化情况。表3试验土壤理化性质 各处理土壤中p，p' -DDT的降解情况见图3。对照土壤、非降解菌E. ColiTGl和 Klebsiella sp. TST处理120天，土壤中ρ，ρ ‘ -DDT几乎不变，其降解率分别为8. 7 %、 9. 6%和9. 2%。质粒pDOD-gfp处理120天，土壤中p，p' -DDT的降解率达66. 7%。由 于降解质粒只有在转入微生物获得表达后才显示降解功能，因此，质粒PDOD处理土壤中p， P' -DDT的降解源于土壤微生物因质粒pDOD-gfp转入而获得的降解功能。如图1所示，土壤经质粒pDOD-gfp处理后15天明显观察到gfp标记的微生物，同 期采用MPN法测得DDT降解菌数量表明土壤经质粒pDOD-gfp处理后7天检测到降解菌的存 在，随后逐步增加(如图4，单位为CFU/g)。结果表明质粒pDOD-gfp处理土壤后可以转入 土壤微生物形成降解菌群，从而提高土壤中P，P' -DDT的降解。降解菌Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、Ε· Coli TGl (pDOD-gfp)处理土壤呈类似结果(图 3、图 4、图 1)，在降 解率和降解菌数量方面与直接质粒处理无差异。考虑到质粒提取费时、费时间，在实际应用 中采用质粒供体(如 Sphingobacteriumsp. DDT-6 (pDOD-gfp)、Ε. Coli TGl (pDOD-gfp))接 种处理更经济、方便。田间土壤中DDTs降解的生物强化试验在浙江省慈溪市庵东镇蔬菜基地进行，试验田分为12个小区，每个小区 的面积为 2. 0X5. Om2,分别设 Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD)、Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、E. coli TGl (pDOD-gfp)喷施处理，将 IOOml 5. O X 1010CFU/ml 的菌液 添加到4Kg水喷洒到田中，15d后以同样的菌量及方法再喷洒一次菌液，第一次喷菌前和喷 菌后15、30、90、120天采样分析土壤中DDTs残留量(图2)。对照处理土壤中DDT的初始 残留量为0. 79mg/kg,90天后残留量为0. 73mg/kg,降解率仅为7. 6% ；Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD)、Sphingobacterium sp. DDT-6 (pDOD-gfp)、Ε· coli TGl (pDOD-gfp)处理后 土壤中DDT的降解速率大幅提高，降解率分别为33. 8%,42. 5%和40. 7%。田间试验结果说 明，Sphingobacterium sp. DDT-6(pDOD)> Sphingobacterium sp. DDT-6(pDOD-gfp)> Ε.coli TGl (pDOD-gfp)菌剂处理土壤均可有效大幅加快土壤中DDT残留的降解，是一种有效的生 物修复方法。
权利要求
一种DDT残留污染土壤的生物修复方法，包括将鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT 6或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留DDT的土壤中，所述的鞘氨醇杆菌DDT 6保藏号为CCTCC M 208116。
2.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于所述的土壤PH值为5 9。
3.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于所述的土壤DDT含量为0.1 2mg/kg。
4.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于所述的土壤有机质含量为5 50g/kgo
5.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于，包括将含鞘氨醇杆菌DDT-6或 所述转化子的菌液喷洒到土壤上，每平方米土壤喷洒菌体数量为5 X IOKI 5X 1012。
6.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于所述转化子的宿主菌为E.ColiTGl。
7.一种权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6携带的质粒。
8.一种含权利要求7所述的质粒的转化子。全文摘要
本发明公开了一种DDT残留污染土壤的生物修复方法，包括将鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)DDT-6或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留DDT的土壤中，鞘氨醇杆菌DDT-6的保藏号为CCTCC M 208116。本发明鞘氨醇杆菌DDT-6携带的质粒具有降解DDT的基因，使得它具有降解DDT的性能，更重要的是该质粒为可转移质粒，通过在土壤中接种该质粒或者含该质粒的菌株，该质粒可以转化到土壤微生物中，甚至可能与土壤微生物中基因发生重组，一方面解决了外源微生物在土壤中生存困难的问题，另一方面降解菌能最大限度的分散，尽可能地降解DDT。
文档编号B09C1/10GK101920262SQ20101027680
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者方华, 虞云龙, 高春明 申请人:浙江大学