专利名称：一株对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种硫酸盐还原菌，属于环境微生物领域。
背景技术：
硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria, SRB)是以有机化合物或无机化合物为电子供体，还原硫酸盐产生硫化物的一类原核微生物具有多样的系统发育分支和生理学特性。硫酸盐还原菌在厌氧条件下通过异化硫酸盐还原作用产生硫化物，这一过程会消耗溶液中的硫酸根，可以用于处理硫酸盐废水；硫酸盐还原菌细胞表面的负电性和分泌的胞外物对重金属离子有较强的静电吸附和生物絮凝作用；其代谢硫酸根离子的同时会消耗氢离子，降低溶液酸度，可使金属离子形成氢氧化物沉淀，代谢产生大量的硫化物能与重金属阳离子结合，形成不溶性的金属硫化物沉淀，从而降低水体中的游离的金属浓度。硫酸盐还原菌处理废水适用性较强、价格低廉、处理效果较好、无二次污染，一直以来被广泛用于硫酸盐废水，重金属工业废水和酸性矿山废水的治理并得到较好的发展，处理菌种从原来的单一硫酸盐还原菌发展到复合硫酸盐还原菌，工艺由分批沉淀发展到厌氧污泥床、流化床工艺和固定化工艺等。砷是自然界中普遍存在的一种剧毒元素，近年来，人为活动的影响导致大量的砷释放到环境中，造成了世界上近百个国家都有地下水砷超标，而亚洲是砷污染最为严重的地区，砷污染是我国乃至全球极具关注的环境问题。因为大部分矿石中有伴生元素存在，所以金属开采及冶炼过程排放的废水中一般都含有铜、汞、镉、铅、锌、砷以及硫酸盐和硝酸盐等。如一种典型的金矿生物浸出液中含有高达10g/L的砷和20g/L的铁，对于这种酸性含砷废水常采用的是入加石灰的工艺，硫酸根离子转变成石膏，砷与氢氧化铁共沉淀得以去除，这种化学处理工艺去除砷的效率低并产生大量的固体废弃物，处理固废容易造成二次污染，现在人们普遍认为利用硫酸盐还原菌代谢产生的硫化氢与砷反应使得砷以雌黄(As2S3)沉淀的形式从溶液中去除是一种高效且无二次污染的工艺。但废水中高浓度的砷对微生物具有很强的毒性作用，因此为了保证硫酸盐还原菌处理法对含砷废水的处理能力，就需要在高浓度砷下仍具有较高的生长代谢活性的硫酸盐还原菌菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌，为硫酸盐还原菌处理砷废水工艺提供菌种来源。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—株对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌,其分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)taihuN3,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2012年
11月23日，保藏编号为CGMCC No. 6886。该菌株是发明人于2011年10月从太湖贡湖湾湖 底沉积物中分离得到。
上述对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌为革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，长为1. 7-3. 3 μ m，宽为O. 5-0. 7 μ m,生长代谢产生的硫化氢与固体培养基上的Fe2+使菌落呈黑色，圆形，边缘整齐，直径f 3mm。上述对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌对不同的碳源利用能力不同，它能以甲醇、乙醇、乳酸盐、乙酸盐、丙酸盐、葡萄糖、琥珀酸盐、柠檬酸盐、蔗糖为唯一碳源生长，其中以乳酸为碳源时，硫酸盐还原效率最闻。上述对砷具有耐受性的 硫酸盐还原菌，其16SrRNA基因上有效长度约为1500kb的核苷酸序列(GenBank中的序列登录号为JX847659)，将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Enterobacter cloacae的16S rDNA序列相似性较高，为99%。基于16S rDNA基因的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为肠杆菌属(Enterobacter)的一株新菌株。本发明菌株 Enterobacter sp. taihuN3 的 16S rDNA 序列如SEQ ID No.1所示。上述对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌在废水处理中的应用。其中，所述的废水为含砷和硫酸盐的废水。有益效果本发明提供的菌株具有以下优点(I)本发明菌株可利用的碳源范围广泛，易于培养。(2)生长代谢活性强，硫酸盐转化效率高。(3)本发明菌株在10-1000mg/LAs (V)浓度下能够正常生长。(4)本发明菌株在200mg/LAs (V)下硫酸盐的还原率达到50%，可用于处理较高浓度的砷废水，具有良好的应用前景。
图1为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3在固体培养基上的菌落形态图。图2为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3经革兰氏染色后电子显微镜照片。图3为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育进化树。图4为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3生长曲线和培养体系中硫酸盐浓度。图5为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3在不同碳源培养基中生长曲线。图6为肠杆菌(Enterobacter)taihuN3在不同碳源培养基中培养的硫酸盐浓度曲线。图7为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3在不同浓度As (V)处理下生长曲线。图8为肠杆菌(Enterobacter )taihuN3不同浓度As (V)处理下的培养液中S042_变化曲线。图9为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3亚硫酸盐还原酶(DSR)基因PCR扩增产物电泳图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 :本发明菌株的分离与鉴定。(I)肠杆菌(Enterobacter) taihuN3 的分离和纯化。采用液体培养基以硫酸亚铁作为指示剂，硫酸盐还原菌的代谢产物硫化氢可以和亚铁离子形成墨汁色，作为富集得到有硫酸盐还原菌菌群的标志。采用有螺旋口塞子的小口径容器(500ml血清瓶)，分装一定体积的富集培养基后高压灭菌。按20%的接种量接种太湖底泥至充满状态，盖紧盖于30°C恒温箱内培养，避光静置约一周，待富集液的颜色成为墨汁色瓶口处散发出H2S的臭鸡蛋味，即表示富集成功。将富集好的菌液分别采用无菌操作做成不同稀释度的菌悬液。培养皿经灭菌后无菌倒入一层培养基，待凝固后，分别采取10_5 10_9稀释度的菌悬液O.1ml在各琼脂平板上进行涂布。涂布完后，让菌液渗透五分钟，揭开培养皿一边将固体培养基再度倒入。在30°C 的条件下培养5-6天，平板中长出的许多黑色球状小菌落即为所需菌落(图1)，挑选合适稀释度的培皿，各个菌落分离得较开，揭去上层培养基，用牙签挑取单菌落接入新的液体培养基中。重复进行稀释涂布、夹层培养、挑选等两次，即可达到对硫酸盐还原菌的分离纯化，获得可以鉴定、保存、转接的纯菌株。对分离细菌Enterobacter taihuN3进行制片，革兰氏染色。镜检为革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，长为1. 7-3. 3 μ m，宽为O. 5-0. 7 μ m (图2)(2)富集与分离培养基。KH2PO4O. 5g, NH4Cl1. 0g, CaCl2 · 2H20 O. lg, Na2SO4L 0g, MgSO 4 · 7H20 2. Og,乳酸钠(80%) 3. 5ml，酵母浸膏1. 0g，FeSO4 · 7H20 O. 5g，Vc O. lg，巯基乙酸钠 O. lg，蒸馏水 1000ml,调pH到7. 5左右。上述培养基如制成固体培养基，则添加1. 6%琼脂。(3) 16S rDNA 的 PCR 扩增与测序。以提取的提取细菌的总DNA为模板，使用16S rDNA的通用引物(27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增，PCR 反应体系10 μ I 体系，IOXBuffer 1μ I, dNTP O. 5μ I, Mg2+O. 75 μ 1，引物各 O. 25 μ 1，模板dna O. 25 μ 1，rTaq 0. 0625 μ 1，ddH20 6. 9375 μ I。PCR 扩增条件94°C 4min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C1. 5min，30 个循环；72°C IOmin0 用 1% 琼脂糖凝胶对 16S rDNA 的 PCR 产物做电泳检测，找到1500bp的目标条带，进行割胶回收，对PCR产物纯化后用PMD19-T载体做TA克隆，挑取阳性克隆子经验证后委托华大基因测序。测序后得到肠杆菌(Enterobacter) taihuN3的16S rDNA长度为1391bp的序列，提交到GenBank与其他已有菌株序列进行比对，并用MEGA软件通过NJ方法对菌株的16SrRNA序列进行分类及系统发育分析(见图3),测序所得序列与Enterobacter cloacae的16S rDNA序列相似性较高，为99%。基于16S rDNA基因的系统发育分析结果，鉴定为肠杆菌属(Enterobacter)的一株新菌株。实施例2 :本发明菌株的生长特性。在厌氧管中加入9. 8ml培养基，接种O. 2ml对数期的肠杆菌(Enterobacter)taihuN3菌液，在厌氧箱中30°C避光培养。(培养基配方同上述富集分离培养基)，分别于接种后的 0、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、7011、8011、9011、10011取样，测定菌液在60011111处
的吸光度。用0. 22 pm滤膜过滤样品，用离子色谱测定样品中SO/—浓度。肠杆菌(Enterobacter) taihuN3生长曲线和培养基中S042_浓度变化曲线如图4所示，接种后的10-40小时为对数生长期，40-80h为稳定期，80h后菌液吸光度下降，菌体逐渐衰亡。在开始培养的20h内培养基中的硫酸盐含量没有变化，30-80h培养基中硫酸盐浓度逐渐下降，80h硫酸盐浓度趋于稳定。培养基中硫酸盐含量从初始的1400mg/L下降到430mg/L，硫酸盐转化率为70%。硫酸盐含量的下降与菌株的生长保持一致，在菌株生长的稳定期培养基中硫酸盐含量下降最快。实施例3 :本发明菌株对不同碳源的利用。在不含有机碳源的培养基(培养基配方KH2P040. 5g，NH4Cl1. 0g, CaCl2 2H200. lg, Na2SO41. 0g, MgSO 4 7H20 2. 0g，乳酸钠(80%) 3. 5ml，Vc 0. lg，巯基乙酸钠 0. lg，蒸馏水1000ml，调pH7. 5)中分别添加甲醇、乙醇、乳酸盐、乙酸盐、丙酸盐、葡萄糖、苯酚、琥拍酸盐、朽1檬酸盐、鹿糖，接种处于对数生长期的菌株肠杆菌(Enterobacter) taihuN3 (将大量培养细菌离心，用无菌水清洗菌体)，在厌氧箱中30°C避光培养，于24h、48h、72h、96h、120测定菌液在波长600nm下的吸光度和培养基中硫酸盐的浓度，以此评价菌株对不同碳源的利用能力。(糖醇类浓度为0. 8%，其他为0. 2%)除了苯酹外，添加的其他9种碳源都能被肠杆菌(Enterobacter) taihuN3唯一利用于菌株生长。图5中菌株对6种碳源利用速率葡萄糖 > 乳酸 > 甲醇 > 乙醇〉乙酸〉丙酸。葡萄糖的利用速度最快，但很快菌株衰亡。图6中肠杆菌(Enterobacter) taihuN3以6种不同有机物为唯一碳源生长还原硫酸盐。硫酸盐还原率乳酸 > 甲醇 > 乙醇 > 乙酸、丙酸、葡萄糖。综合起来肠杆菌(Enterobacter) taihuN3以乳酸为碳源生长代谢最好。实施例4 :本发明菌株对砷的耐受性。设置7个砷处理组，向富集分离培养基中添加Na3AsO4,配制含砷培养基其中As (V)浓度分别为 2. 5g/L, lg/L, 500mg/L, 200mg/L, lOOmg/L, 50mg/L, lOmg/L,调 pH7. 3,灭菌后接种处于对数生长末期的菌株肠杆菌(Enterobacter) taihuN3,在厌氧箱中30°C避光培养，分别在接种后的0h，24h，48h，96h和120h取样，测定菌液在在波长600nm下的吸光度和培
养基中硫酸盐的浓度。肠杆菌(Enterobacter)taihuN3 在 2. 5g/L, lg/L, 500mg/L, 200mg/L, 100mg/L,50mg/L和10mg/LAs(V)下的生长状况如图7所示，随着砷浓度增高，细菌生长的延迟期延长，但菌液吸光度值最大保持在0. 4-0. 5之间,说明肠杆菌(Enterobacter)taihuN3在生长初期受到了高浓度砷的影响，但通过自身的代谢调节可以完全消除砷的影响，并在生长的对数期和稳定期保持较高的生长率，因此认为肠杆菌(Enterobacter) taihuN3是一株能够耐受砷的菌株。肠杆菌(Enterobacter)taihuN3 在 200mg/L, 100mg/L, 50mg/L 和 10mg/LAs (V)下培养液中硫酸盐浓度变化曲线如图8所示，随着培养基中As浓度的逐渐升高，体系中硫酸盐的消耗量速率降低，但仍然保持50%以上的转化率，该菌株在硫酸盐还原菌用于处理较高浓度的砷废水方面具有良好的应用前景。实施例5 :本发明菌株肠杆菌(Enterobacter) taihuN3在处理金属废水中的应用亚硫酸盐还原酶(DSR)基因的扩增。以提取的提取细菌的总DNA为模板，使用DSR引物(DSR1F:5，-ACSCACTGGAAGCACG-3，;DRS4R :5，-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’)扩增。PCR 体系10μ I体系，IOXBuffer I μ I, dNTP O. 5 μ 1，Mg2+0. 75 μ 1，引物各 O. 25 μ 1，模板 dna O. 25 μ I,rTaq O. 0625 μ l，ddH20 6. 9375 μ I。PCR条件94°C 4min ；94°C 30s,53°C 50s,72°C1. 5min,30个循环；72°C IOmin。用1%琼脂糖凝胶对16S rDNA的PCR产物做电泳检测，在1900bp的位置有条明亮的条带，即是该菌株(图9)亚硫酸盐还原酶(DSR)基因的扩增产物。异化型亚硫酸盐还原酶(dissimilatory sulfite reductase, DSR)是硫酸盐还原菌还原S042_产生H2S的关键酶之一，S042_首先在ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸还原酶的作用下获得2个电子，成为SO广，SO广在DSR的催化下，通过一系列电子转移过程最终还原形成S2_。DSR广泛存在于各种硫酸盐还原菌中，且DSR基因在同一类群的SRB中相当保守，在不同类群SRB中却有较大差别，可以作为SRB的分类与进化的指标。实施例6 :肠杆菌(Enterobacter) taihuN3在处理砷废水中的应用。
将低温保藏的肠杆菌(Enterobacter) taihuN3菌种接种于装有富集分离液体培养基的厌氧管中活化，将活化后的菌种接种到500ml富集分离液体培养基中扩大培养，待长至对数生长期，将扩大培养的菌液接种于配制的含AsO广人工废水中，同时补加等体积的富集分离培养基，30°C密封培养处理金属废水(每隔3天补加培养基)。该水中5价As浓度200mg/L, SO广浓度800mg/L,经过处理后肠杆菌(Enterobacter) taihuN3将5价As还原成3价As，并与其产生的H2S生成As2S3沉淀，出水As (V)浓度下降到2. 4mg/L, S042_浓度169mg/L，As (V)去除率为98. 8%，SO广去除率为78. 9%。
权利要求
1.一株对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌,其分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.) taihuN3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012 年11月23日，保藏编号为CGMCCNo. 6886。
2.权利要求1所述的对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌在废水处理中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的废水为含砷和硫酸盐的废水。
全文摘要
本发明公开了一株对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌，其分类命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)taihuN3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年11月23日，保藏编号为CGMCC No.6886。本发明还公开了对砷具有耐受性的硫酸盐还原菌在废水处理中的应用。本发明菌株可利用的碳源范围广泛，易于培养。生长代谢活性强，硫酸盐转化效率高。本发明菌株在10-1000mg/LAs(V)浓度下能够正常生长。本发明菌株在200mg/LAs(V)下硫酸盐的还原率达到50%，可用于处理较高浓度的砷废水，具有良好的应用前景。
文档编号C02F101/10GK103013868SQ201210512360
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者肖 琳, 刘莹 申请人:南京大学