专利名称：一株类芽孢杆菌及其产生的微生物胞外多糖絮凝剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. ) ZD01,以及由其发酵产生的微生物胞外多糖絮凝剂及其应用。
背景技术：
随着我国工业迅猛发展，含重金属离子、色素及其他悬浮颗粒等污染物的工业废水及生活污水大量排放，对环境造成的污染日益严重。絮凝法是废水处理的重要方法之一，该技术己被广泛用于给排水、废水处理和污泥脱水等多个领域。其目的是使污水中悬浮物颗粒、色素、重金属离子等污染物凝聚为大的絮凝体，以便从水中分离出来，因此絮凝剂的好坏直接影响水质净化的效果。根据絮凝剂的组成，将其分为无机絮凝剂如铝盐、铁盐和无机高分子絮凝剂；人工合成的高分子有机絮凝剂如聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺等；天然的生物絮凝剂如海藻酸钠和其他微生物絮凝剂等。目前为止已报道的微生物絮凝剂的成分有多糖、蛋白质、糖蛋白和核酸等，其中以多糖居多。微生物胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是指微生物细胞在生长过程中合成并分泌到胞外的一类由多个单糖失水缩合连接起来的长链高分子聚合物。其中部分多糖能具有使废水中难降解的固体悬浮颗粒、菌体碎片及其他胶体粒子等杂质凝集、沉淀的絮凝特性，可成为新型的微生物絮凝剂。这类絮凝剂与传统的无机絮凝剂及人工合成的高分子絮凝剂相比，具有对人类和环境无毒无害，安全、高效，生物可降解无二次污染等独特优点，在城市生活污水、工业废水方面具有较大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. )ZD01及其所产的胞外多糖絮凝剂PE-1，并进一步提供了该絮凝剂在废水处理中固体悬浮物的沉淀、染料色素的脱色及重金属离子的去除等方面的应用。本发明采用的技术方案是一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. )ZD01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，提议的分类命名为Paenibacillus sp. ZD01，保藏日期2012年11月20日，保藏编号CCTCC No M 2012463。本发明提供的菌株类芽抱杆菌(Paenibacillus sp. ) ZDOl从多地多生境采集土样，采用平板稀释法分离，经鉴定具有产生物多糖絮凝剂的性能。本发明提供的菌株在营养肉汤平板上培养24h后菌落呈圆形,边缘整齐,表面光滑湿润，无色不透明，培养5-7天后表面突起褶皱。本发明提供的菌株革兰氏染色可变，好氧，杆状，长2. 8 4.8ym，宽O. 3 1.11 m，具有周生鞭毛，能产端生椭圆形芽胞；有氧化酶、接触酶活性，且硝酸还原反应为阳性。不产生硫化氢，能水解干酪素、明胶。所述的类芽孢杆菌ZDOl在制备微生物胞外多糖絮凝剂中的应用。
本发明还涉及由所述类芽孢杆菌ZDOl发酵产生的微生物胞外多糖絮凝剂PE-1，是由菌株经好氧发酵分泌到胞外产生的一种微生物多糖，其骨架由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、鼠李糖组成，其摩尔比为1:1 :2 :2 :0. 1，分子量7X IO6道尔顿。所述微生物胞外多糖絮凝剂PE-1由如下方法制得类芽孢杆菌CCTCC No M2012463接种至发酵培养基，28 32°C，100 200rpm旋涡振荡培养3 4天，得到含所述微生物胞外多糖絮凝剂PE-1的发酵液；所述发酵培养基组成如下蔗糖3(T60g/L ;酵母提取物O. Γ1. Og/ L ;蛋白胨5 8g/ L ;磷酸二氢钾f 5g/ L ;硫酸镁O. Γ . Og/ L ;氯化铁O. 01 O. 05g/ L ;氯化锰O. 01 O. 05g/ L，溶剂为蒸馏水，ρΗ7· 0 7· 5。在发酵培养之前通常还需要进行种子扩大培养，种子培养基可为常规的营养肉汤培养基，具体方法可如下(I)种子培养制作常规的营养肉汤培养基，接种菌株(Paenibacillus sp. )ZD01,30°C，200rpm培养24h，获得种子液；(2)发酵种子液以5 10% (v/v)的接种量转接至发酵培养基，28 32°C，100 200rpm旋涡振荡培养3 4天，得到含絮凝剂的发酵液。发酵培养基的组成蔗糖50g/ L ；酵母提取物O. 5g/ L ;蛋白胨6. 5g/ L ;磷酸二氢钾2g/ L ;硫酸镁O. 5g/ L ;氯化铁O. 02g/L ;氯化锰O. 02g/ L，溶剂为蒸馏水，ρΗ7· 2。通过上述步骤，本发明的絮凝剂产量在25g/L以上。该絮凝剂可直接以发酵液形式用于污水处理，也可经提纯后用于污水处理，具体提纯方法如下将发酵液于SOOOrpm离心10 25分钟，上层发酵液以加入溶菌酶(20万U/g，庞博生物，加入量为每升发酵液O. 5g)及碱性蛋白酶(2万U/g，庞博生物，加入量为每升发酵液lg)，40°C保温2h;S evag试剂(氯仿一正丁醇体积比为5 I混合液)除去残留的蛋白直至水相中无280nm的紫外吸收；加入2 5倍体积的乙醇，搅拌30分钟后4°C冰箱放置过夜，6000 12000rpm离心10 25分钟取沉淀，真空干燥，得微生物胞外多糖絮凝剂 PE-1。本发明还涉及所述的微生物胞外多糖絮凝剂PE-1在污水处理中的应用，具体可用于废水中固体悬浮物的沉淀、染料色素的脱色及重金属离子的去除等方面。本发明的有益效果主要体现在利用本发明提供的未纯化的(Paenibaci I Iussp. )ZD01发酵液或者是纯化后的PE-1多糖，处理模拟废水或者实际的工业废水时，均具有较高的悬浊悬浮颗粒絮凝活性、染料色素脱色活性及重金属离子去除活性。本发明制备高效微生物絮凝剂，在生活、工业等废水处理极具潜在用途，尤其在污水的预处理过程中发挥极大的作用，降低后续处理的步骤及成本。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :多糖絮凝剂PE-1的发酵工艺1、类芽孢杆菌CCTCC No M 2012463接种于营养琼脂培养基斜面上，30°C培养72h ;营养琼脂培养基按如下组成配制蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L,溶剂为蒸懼水，pH7. 2。
2、种子培养将斜面菌种接入50mL常规的营养肉汤种子培养基(盛于250mL三角瓶)，于30°C、200rpm振荡培养24h，即为种子液；营养肉汤种子培养基按如下组成配制蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化钠5g/L，溶剂为蒸馏水，pH7. 2。3、罐上发酵将种子液以10%体积比的接种量接入发酵培养基中，30°C、pH 6. 8 7. 2条件下,通风1. Ovvm,转速300rpm,培养96小时,得发酵液；发酵培养基组成鹿糖50g/L ;酵母提取物O. 5g/ L ;蛋白胨6. 5g/ L ;磷酸二氢钾2g/ L ;硫酸镁O. 5g/ L ;氯化铁O. 02g/ L ;氯化锰O. 02g/ L，溶剂为蒸馏水，ρΗ7· 2。4、粗多糖得率测定发酵液蒸馏水稀释10倍后，IOOOOrpm离心20分钟去除菌体沉淀，加入3倍乙醇，IOOOOrpm离心20分钟后，测干重并计算絮凝剂得率在25g/L以上。实施例2 :胞外多糖絮凝剂PE-1的提取纯化制备工艺1、发酵液预处理发酵液100L，8000rpm离心20分钟，取上清；2、蛋白酶处理上清恒温至40°C，用100g/L NaOH调ρΗ7· 0，加入50g的溶菌酶(20万υ/g，庞博生物)及IOOg的碱性蛋白酶(2万U/g，庞博生物)，保温2h ；3、Sevag法去除少量残留杂蛋白蛋白酶处理后的多糖溶液与Sevag试剂(氯仿一正丁醇体积比为5 :1混合液)以5:1的体积比混合，振摇30分钟，SOOOrpm离心30分钟，保留水相再加入水相体积I/ 5的Sevag试剂，重复上述过程，直到水相无OD28tl吸收值；4、沉淀，分离上述处理后的发酵液(步骤3水相)中加入300L无水乙醇，搅拌30分钟后，4 °C恒温过夜；5、离 心干燥SOOOrpm离心20分钟取沉淀，真空干燥，得纯化后的胞外多糖絮凝剂PE-1 (以下简称为PE-1 )。实施例3 :絮凝剂组成分析1、絮凝剂水解20mg纯化后的PE-1溶于2 M三氟乙酸溶液，105 °C水解8小时，
旋转蒸发去除残留的三氟乙酸；2、单糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化各种单糖标准品及PE-1水解产物分别溶于200 μ L O. 3M NaOH溶液，各加入200 μ L O. 5Μ PMP甲醇溶液，70°C反应70分钟，降温后加入240yL O. 3M HCl溶液中和，加水至2mL，各加入2mL氯仿萃取残留的PMP，
重复萃取3次；3、衍生化单糖HPLC分离测定色谱柱普通C18,250 mm X 4. 6 mm, 5 μ m ;流动相0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6. 7)_乙腈(V : V为83 : 17);柱温25°C;检测波长245nm ;流速1 mL/分钟；进样体积10μ L;4、PE-1组成的确定根据HPLC的测定结果，确定PE-1由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、鼠李糖组成，其比例为1:1:2:2:0.1。实施例4 :粗多糖发酵液及PE-1高岭土絮凝性能测定1、高岭土悬液制备25mL比色管中加入IOmL高岭土悬液(4g/L)与O. 5mL IOg/L CaCl2溶液，混合均匀；2、絮凝处理加入O. 25mL待测的发酵液或纯化的PE_1 (25g/L)，剧烈搅拌(500rpm) 2分钟，50rpm搅拌5分钟，静止5分钟。3、活性测定取上清液用分光度计测定在550nm处的吸光度，用未接种培养基或蒸馏水作对照。
4、活性计算絮凝率计算公式为絮凝率=(B-A)/AX 100%其中，A为待测样品在550nm处的吸光度，B为对照样品在550nm处的吸光度。5、经过测定，发酵液和PE-1的絮凝率分别为85%和87%。实施例5 :粗多糖发酵液及PE-1纺织工业染料色素去除性能测定1、纺织工业染料色素废水的制备纺织工业中常用的色素亚甲基蓝(methyleneblue)和阳离子红X-GRL (cationic Red X-GRL)作为待测色素。IOOml去离子水中分别加入IOmg亚甲基蓝或者阳离子红X-GRL ；2、絮凝处理加入O.1mL待测的发酵液或纯化的PE_1 (25g/L)，混合液磁力搅拌器下剧烈搅拌(200rpm) 12小时，4000rpm离心5分钟。3、活性测·定上清分光光度计测定光密度值，其中亚甲基蓝测定波长370nm ;阳离子红X-GRL测定波长530nm。4、活性计算色素去除率计算公式为脱色活性=(C0-Ce)/C0 X 100%其中Ctl为废水中色素的初始浓度，Ce为脱色处理后样品中色素的残留浓度。5、经过测定，发酵液和PE-1色素清除率见下表
权利要求
1.一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. ) ZD01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年11月20日，保藏编号CCTCC No M 2012463。
2.如权利要求1所述的类芽孢杆菌ZDOl在制备微生物胞外多糖絮凝剂中的应用。
3.由权利要求1所述类芽孢杆菌ZDOl发酵产生的微生物胞外多糖絮凝剂PE-1，其骨架由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、鼠李糖组成，其摩尔比为1:1 2 2 :0. 1，分子量7 X IO6道尔顿。
4.如权利要求3所述的微生物胞外多糖絮凝剂PE-1，其特征在于所述微生物胞外多糖絮凝剂PE-1由如下方法制得类芽孢杆菌CCTCC No M 2012463接种至发酵培养基，28 32°C, 100 200rpm旋涡振荡培养3 4天，得到含所述微生物胞外多糖絮凝剂PE-1的发酵液；所述发酵培养基组成如下蔗糖3(T60g/L ;酵母提取物0. n. Og/ L ;蛋白胨5 8g/L ;磷酸二氢钾I 5g/ L ;硫酸镁0.1 1. Og/ L ;氯化铁0. 01 0. 05g/ L ;氯化锰0. 01 0. 05g/L，溶剂为蒸馏水，pH7. 0 7. 5。
5.权利要求3所述的微生物胞外多糖絮凝剂PE-1在污水处理中的应用。
全文摘要
本发明提供了一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)ZD01及其所产的胞外多糖絮凝剂PE-1，并进一步提供了该絮凝剂在废水处理中固体悬浮物的沉淀、染料色素的脱色及重金属离子的去除等方面的应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心保藏日期2012年11月20日，保藏编号CCTCC NoM 2012463。利用本发明提供的未纯化的(Paenibacillus sp.)ZD01发酵液或者是纯化后的PE-1多糖，处理模拟废水或者实际的工业废水时，均具有较高的悬浊悬浮颗粒絮凝活性、染料色素脱色活性及重金属离子去除活性。本发明制备高效微生物絮凝剂，在生活、工业等废水处理极具潜在用途，尤其在污水的预处理过程中发挥极大的作用，降低后续处理的步骤及成本。
文档编号C02F1/56GK103031262SQ20121054537
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者李欧, 刘傲, 鲁翠, 朱亮, 钱朝东, 吴雪昌 申请人:浙江大学