太湖支浜底泥中筛选溶藻细菌及去除铜绿微囊藻的方法
【专利摘要】本发明太湖支浜底泥中筛选溶藻细菌及去除铜绿微囊藻的方法，属于环保水处理【技术领域】。提供了纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillusfusiformis，保藏编号为CGMCCNO.7520。本发明还提供了太湖支浜底泥中筛选溶藻细菌去除铜绿微囊藻的方法。本发明筛选的溶藻细菌对蓝藻水华中的优势藻种铜绿微囊藻具有一定的溶解作用，分离得到溶藻菌TR3。在最佳条件下，溶藻菌TR3对铜绿微囊藻96h去除率可达97.18%，溶藻效果非常理想，这一特点使得该菌能够更好地在天然水体中发挥溶藻特性，在大面积水体蓝藻水华污染治理中的应用前景更为广阔。
【专利说明】太湖支浜底泥中筛选溶藻细菌及去除铜绿微囊藻的方法【技术领域】[0001]本发明属于环保水处理【技术领域】，具体涉及一种从太湖流域支浜底泥中筛选的溶藻细菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法。【背景技术】[0002]我国淡水资源有限，日益严重的水污染问题加剧了我国淡水资源紧缺的现象。蓝藻的暴发对水生生态系统、渔业资源以及生态景观造成了巨大危害，随着蓝藻暴发事件的频发，水华污染问题逐渐被人们所重视，如何解决过量繁殖的藻类以及随着部分藻类死亡所释放出的藻毒素问题已成为众多学者的研究方向，探索预防与治理蓝藻暴发及其衍生的藻毒素污染问题关系到人类生命安全以及社会的稳定，具有现实意义。[0003]我国学者对太湖蓝藻水华进行长期跟踪研究，提出了蓝藻水华的形成是一个可测的过程，并提出了预防太湖蓝藻水华的思想，推测若在藻类越冬及春秋复苏期间，采取适当的物理、化学、生物手段，去除引发水华的蓝藻种源，能够在一定程度上减轻夏季蓝藻水华强度，从而达到预防或者减少蓝藻水华大规模发生的目的。此外，在蓝藻水华发生后，采用适当的物理、化学、生物手段也能够对蓝藻爆发起到遏制与治理的作用。[0004]针对蓝藻水华及其衍生的藻毒素污染的物理方法主要有混凝、吸附、过滤以及光催化氧化等。过滤技术主要是通过有机高分子形成膜离子或交换膜对分子量在一定范围内的藻毒素滤过去除，操作过程能自动控制且去除效果好，反渗透和超滤对藻毒素的去除率分别可达99.6%、98%，但由于有机高分子的成本较高，不利于大规模的水华治理。光催化氧化主要是利用特定波长范围的紫外光对藻毒素进行光催化，我国学者也发现紫外线的照射会对藻类的生长起抑制作用，TiO2 / GAC复合催化剂对MC-LR的具有吸附催化降解的作用。 但光催化的产物毒性及其化学性质需要进一步研究，并且其高昂的成本也是该法的一个弊端。[0005]化学法治理蓝藻是较为常用的方法之一，通常采用重金属杀藻剂如CuS04、Cu2+络合物等，利用化学法治理蓝藻问题较为方便，但长期使用某种药剂是否会使藻类产生抗药性而使得处理效果下降需要进一步研究。[0006]目前国内外专家学者普遍认为生物法是解决蓝藻水华问题最为有效、安全、经济的方法，很多研究人员发现在暴发蓝藻的天然水体、水库、池塘、除藻装置等不同环境中都存在着能够溶解或感染蓝藻细胞的微生物，它们主要归属于假单胞菌属、芽孢杆菌属等，并将统称为溶藻细菌，但是溶藻细菌的研究尚处于实验室阶段，并未规模性的应用于实际工程中，而系统的研究溶藻细菌的溶藻特性，寻找细菌的最佳溶藻条件，探索细菌溶藻方式， 可为蓝藻水华生物防治工作提供一定的技术基础。[0007]本发明以江苏省太湖流域支浜底泥作为溶藻细菌的菌种分离源，通过富集，从中筛选出去除铜绿微囊藻的细菌。本发明从河浜底泥中分离得到的溶藻细菌，其溶藻方式为接触溶藻与释放杀藻物质溶藻相结合，其中以细菌菌体接触溶藻为主，释放的杀藻物质可能是蛋白质类。该菌对光周期敏感，在光循环12 h:1`2 h条件下溶藻效果好，有利于该菌在自然条件下的水体中充分发挥溶藻特性，使得以铜绿微囊藻为处理对象的蓝藻水华污染得到有效控制成为可能。
[0008]
【发明内容】
[0009]本发明的目的是克服上述现有技术方法中的不足，针对太湖优势藻种铜绿微囊藻而提供的一种从太湖流域支浜底泥中筛选的具有溶藻性能的溶藻细菌，并利用其降解铜绿微囊藻的方法。
[0010]本发明所采用的技术方案如下:
本发明提供了一株从太湖流域河浜底泥中分离筛选的溶藻细菌TR3，经鉴定其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus并于2013年4月26日保藏于位于北京
市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，登记入册编号为CGMCC N0.7520。
[0011]利用上述溶藻细菌去除铜绿微囊藻的方法，按照下述步骤进行:
将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus /i/si/brffiis接种于营养肉汤液体培养基中于温度30°C、摇床转速130 r/min条件下16 h培养至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培养基中，相同条件下16 h培养至对数期，备用；
将上述培养至对数期赖氨酸芽孢杆菌按照菌藻比1:2-1:20的体积比例接种到初始叶绿素a浓度为202.11 -361.47 mg/m3的新鲜铜绿微囊藻液中，在温度28°C、光强2500 Iux的光照培养箱菌藻共同培养即`能够去除铜绿微囊藻，光周期分别设置全黑暗、光循环12 h:12 h、全光照。
[0012]其中所述的营养肉汤液体培养基组成为牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸馏水1000 mL ；pH 7.0-7.2。固体培养基添加琼脂粉2.4%。
[0013]藻液为实验室铜绿微囊藻纯培养液，而藻种为铜绿微囊藻FACHB-905，购自中科院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库，因此，叶绿素a浓度的变化可很好地表征铜绿微囊藻的去除效果。
[0014]上述降解铜绿微囊藻的方法优选:以菌藻比> I:10的体积比例接种到的新鲜铜绿微囊藻液中，在温度28°C、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱菌藻共同培养96 h0
[0015]本发明的主要优点:
1、本发明以太湖流域支浜底泥为菌种分离源，采用液体感染法以富集得到具有稳定溶藻能力的细菌混合菌群，采用价格低廉的营养肉汤培养基平板划线分离纯化溶藻细菌，具有成本低、简便、安全等优点。
[0016]2、本发明筛选的溶藻细菌对蓝藻水华中的优势藻种铜绿微囊藻具有一定的溶解作用，分离得到溶藻菌TR3。在最佳条件下，溶藻菌TR3对铜绿微囊藻96 h去除率可达97.18%，溶藻效果非常理想，这一特点使得该菌能够更好地在天然水体中发挥溶藻特性，在大面积水体蓝藻水华污染治理中的应用前景更为广阔。
【具体实施方式】[0017]I株从太湖流域支浜底泥中分离筛选溶藻细菌的方法，包括如下步骤:1、称取河浜底泥log，加入90mL无菌水，振荡混匀，置于振荡培养箱振荡6h，静置4h，取上清液过孔径0.8 μ m微孔滤膜，滤液再经0.22 μ m的滤膜过滤截留，无菌条件下剪碎滤膜投加到50 ml新鲜的铜绿微囊藻液中，以同样规格的无菌滤膜作对照，置于光照培养箱静置培养。[0018]2、 每天观察记录试验藻液和对照藻液的颜色变化，试验组藻液呈现黄化现象， 而对照组藻液正常生长，则可判断试验组含有能够溶解铜绿微囊藻的细菌。以1:10的比例转接，将该黄化藻液继续转移至新鲜铜绿微囊藻液中，黄化后再次转接，从而获得具有稳定溶藻能力的菌群。[0019]3、将黄化藻液采用梯度稀释法平板涂布，倒置于30°C恒温箱中进行培养。挑选其中长势较好的单菌落，划线分离培养2-3d，然后进行纯化培养，继代4-5次，对分离得到的纯菌株进行菌藻共培实验，出现黄化现象说明该菌为溶藻细菌。[0020]4、将溶藻细菌以斜面培养基保存，得到相对优势的溶藻细菌菌株，选择溶藻效果最明显的I株细菌进行生理生化鉴定。[0021]其中所述的营养肉汤培养基组成如下:牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸馏水1000 mL ；pH 7.0-7.2。固体培养基添加琼脂粉2.4%。[0022]菌株的分离筛选及鉴定 1、溶藻材料的选取以常州市武进区鸣凰河支浜的河浜底泥为菌种来源，取样富集培养其中的细菌。[0023]2、培养基配制铜绿微囊藻培养液:称取NaNO3 1.5 g, K2HPO4 0.04 g, MgSO4 7H20 0.075 g, CaCl2 2H200.036 g，柠檬酸(λ 006 g，柠檬酸铁铵(λ 006 g, EDTA-Na2 0.001 g，NaCO3 0.02 g 及微量元素溶液I mL于烧杯中，加入1000 mL蒸馏水搅拌溶解后调pH至7.1，于高压锅中121°C 灭菌20 min。[0024]微量溶液:称取硼酸2.86 g, MnCl2.4H20 1.86 g, ZnSO4.7H20 0.22 g, Na2MoO4.2H20 0.39 g, CuSO4.5H20 0.08 g, Co (NO3) 2.6H20 0.05 g，加入 1000 mL 蒸馏水，搅拌溶解。[0025]营养肉汤培养基:称取牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g于烧杯中，加入1000 mL 蒸馏水，加热搅拌至溶解，调节PH 7.0-7.2，分装100 mL于锥形瓶中，用纱布及牛皮纸封闭后置于高压锅中，121°C灭菌20 min。固体培养基添加琼脂粉2.4%。[0026]3、分离筛选方法 (I)富集驯化将步骤I溶藻材料的选取中所获得的样`品称取10g，加入90mL无菌水，振荡混匀后置于振荡培养箱振荡6h，静置4h，取上清液过孔径0.8 μ m微孔滤膜，滤液再经0.22 μ m的滤膜过滤截留，无菌条件下剪碎滤膜投加到50 ml新鲜的铜绿微囊藻液中，以同样规格的无菌滤膜作对照，置于28°C、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱静置培养。试验组藻液呈现黄化现象，而对照组藻液正常生长，则可判断试验组含有能够溶解铜绿微囊藻的细菌。以1:10的比例转接，将该黄化藻液继续转移至新鲜铜绿微囊藻液中，黄化后再次转接，从而获得具有稳定溶藻能力的菌群。[0027](2)梯度稀释与划线分离
将富集驯化后的菌液，通过梯度稀释，分别接种10_13、10_14、10_15稀释度的菌液0.1 mL于营养肉汤固体培养基，30 V培养24 h后,观察菌落形态特征,挑取不同的单菌落，米用平板划线分离法，进一步纯化菌种，每隔48 h划线分离I次，重复5次后得到纯化的菌株，并将分离得到的纯菌株接种于斜面培养基中保存备用。[0028](3)溶藻
①每个试管加入5 mL营养肉汤液体培养基，121°C灭菌20 min后置于超净台冷却备用。
[0029]②制备菌悬液:用接种环挑取保存的菌株，接种到营养肉汤液体培养基中，放入摇床中30°C、130 r/min培养至对数期(16 h)，再以5%的接种量转接至新鲜的细菌培养基中，培养至对数期(16 h)以获得菌悬液。
[0030]③接种藻液:用移液枪吸取2.5 mL菌悬液加入到25 mL新鲜铜绿微囊藻藻液中，并以不加菌液为空白对照，混匀后于28°C、光强2500 lux、光循环12h:12 h的光照培养箱
中静置培养I周。
[0031]④在上述步骤③中测定藻液初始叶绿素a浓度，以及I周后的叶绿素a浓度。从而对分离得到的各菌株溶藻性能进行判定，得到I株溶藻效率较高的溶藻细菌TR3。
[0032]4、菌株形态及生理生化性能
通过对菌株进行形态观察、染色反应和生理生化测定，
并根据科学出版社《常见细菌系统鉴定手册》(2001)对其进行鉴定。结果如下:菌落形态特征:菌落形状为圆形、较小，呈淡黄色，不透明，边缘平滑整齐，表面平坦微湿润。
[0033]菌落生理生化特征:菌株TR3的单细胞呈杆状，革兰氏阴性，接触酶反应、糖类发酵、产硫化氢、硝酸盐还原试验呈阳性，葡萄糖发酵产碱，V.P试验、甲基红、淀粉水解试验反应呈阴性。
[0034]5、菌株的16S rDNA序列同源性分析
通过将菌株的16S rDNA序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI) GenBank中的已知序列比对，该菌株与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3 {LysinibadIlus fusiformis )相似度高，且在基于距离法构建的系统发育树中两菌株处于同一分支，自展值为89，其中重复数设置为1000，可信度较高。
[0035]根据16S rDNA序列同源性分析，结合菌株的形态学特征及生化特性，经鉴定其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus并于2013年4月26日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，登记入册编号为CGMCC N0.7520。
[0036]以下提供本发明利用上述菌株处理铜绿微囊藻的5个实施例:
实施例1
本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液1，叶绿素a浓度为202.11 mg/m3, pH值为7.2。具体实施步骤如下:首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30°C、摇床转速130 r/min条件下培养至对数期(16 h)，然后按菌藻比1:2的投菌量，将50 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为168.42 mg/m3，置于28°C、光强2500lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，96 h时叶绿素a浓度为8.68mg/m3,去除率为94.85%，能够较好溶解藻细胞。[0037]实施例2本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液2，叶绿素a浓度220.93 mg/m3, pH值为7.2。具体实施步骤如下:首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30°C、摇床转速130r/min条件下培养至对数期(16 h)，然后按菌藻比1:5的投菌量，将20 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为189.62 mg/m3，置于28°C、光强2500 lux、 光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液,96 h时叶绿素a浓度为21.6 mg/m3,去除率达88.61%,此时的溶藻效果依然保持高水平。[0038]实施例3本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液3，叶绿素a浓度235.88 mg/m3, pH值为7.2。具体实施步骤如下:首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30°C、摇床转速130r/min条件下培养至对数期(16 h)，然后按菌藻比1:10的投菌量，将10 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为199.22mg/m3，置于28°C、光强2500 lux、 光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，96 h时叶绿素a浓度为25.28 mg/m3,去除率达87.31%，此时的溶藻效果依然较好，由此，菌藻比1:10的投加量可达到较好溶藻效果。[0039]实施例4本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液4，叶绿素a浓度为286.98 mg/m3,291.83 mg/m3,293.84 mg/m3，pH值为7.0-7.5。具体实施步骤如下:首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度 30°C、摇床转速130 r/min条件下培养至对数期(16 h)，然后按菌藻比1: 10的投菌量，将 20 mL对数期菌液分别接种到3份藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为 243.62 mg/m3,241.18 mg/m3,245.68 mg/m3，置于 28°C、光强 2500 lux 光照培养箱中静置培养，其中光周期分别为全黑暗、光循环12 h:12 h、全光照，96 h后取样测定叶绿素a 浓度。经过上述方法处理的藻液，叶绿素a去除率分别为79.38%,97.18%,78.14%，可见该赖氨酸芽孢杆菌对光照条件敏感，在光循环条件下能够有较好的溶藻效果，有利于该菌在实际工程中的应用。[0040]实施例5本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液5，叶绿素a浓度361.47 mg/m3, pH值为7.2。具体实施步骤如下:首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30°C、摇床转速130r/min条件下培养至对数期(16 h);然后按照以下4种方式处理对数期菌液:①菌源液(Tl);②将菌液① 高速离心(12000 r/min, 10 min)取上清液，经0.22 μ m滤膜过滤除菌，平板验证上清液中无菌(T2);③收集②中离心后的菌体，经无菌水洗涤3-4次，制备无菌水菌悬液(T3);④将菌液①高温(121 °C)灭活处理30 min (T4);再以菌藻比1:10的投菌量取20 mL上述4种`不同方式处理过的菌液，将其分别接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为301.58 mg/m3，置于28°C、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，96 h后取样测定叶绿素a浓度。经过上述4种方法处理的藻液，96 h后叶绿素a浓度为分别 11.22 mg/m3、410.76 mg/m3、221.08 mg/m3、42.44 mg/m3,而对照组叶绿素 a 浓度为717.28 mg/m3 ;当菌液处理方式为①时，叶绿素a的去除率为96.28% ;当处理方式为② 时，叶绿素a的去除率为O ;当处理方式为③时，叶绿素a的去除率仅为26.69 % ;当处理方式为④时，叶绿素a去除率为85.93%。由此可见，赖氨酸芽孢杆菌细菌TR3的溶藻机理在于细菌接触溶藻与释放杀藻物质溶藻相结合，其中以细菌菌体接触溶藻为主，此外，细菌所释放的杀藻物质不耐高温，灭活后溶藻特性消失，由`此可推断该类杀藻物质可能是蛋白质类易变性失活的物质。
【权利要求】
1.从太湖流域河浜底泥中分离筛选的溶藻细菌TR3，经鉴定其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 Lysinibacillus fusiformis,保藏编号为 CGMCC N0.7520。
2.利用上述溶藻细菌去除铜绿微囊藻的方法，其特征在于按照下述步骤进行: 将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis 接种于营养肉汤液体培养基中于温度30°C、摇床转速130 r/min条件下16 h培养至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培养基中，相同条件下16 h培养至对数期，备用； 将上述培养至对数期赖氨酸芽孢杆菌按照菌藻比1:2-1:20的体积比例接种到初始叶绿素a浓度为202.11 -361.47 mg/m3的新鲜铜绿微囊藻液中，在温度28°C、光强2500 1ux的光照培养箱菌藻共同培养即能够去除铜绿微囊藻，光周期分别设置全黑暗、光循环12 h:12 h、全光照。
3.根据权利要求2所述的利用上述溶藻细菌去除铜绿微囊藻的方法，其特征在于其中所述的营养肉汤液体培养基组成为牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g;蒸馏水1000 mL ；pH7.0-7.2 ； 固体培养基添加琼脂粉2.4%。
4.根据权利要求2所述的利用上述溶藻细菌去除铜绿微囊藻的方法，其特征在于以菌藻比> I:10的体积比例接种到的新鲜铜绿微囊藻液中，在温度28°C、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱菌藻共同培养96 h。
【文档编号】C02F3/34GK103497913SQ201310413085
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】张文艺, 李仁霞, 陈雪珍, 冯国勇, 陈晶 申请人:常州大学