一株球状红球菌wj4及其在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用的制作方法
【专利摘要】一株球状红球菌（Rhodococcusgloberulus）WJ4，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年7月24日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.7965。该菌能在以邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）为唯一碳源和能源的培养基上生长，培养7d时其降解率达96.4%，而接种于土壤21d后，土壤中DEHP降解率达到57.5%，该菌株在DEHP污染土壤的生物修复中具有很好的应用前景。
【专利说明】—株球状红球菌WJ4及其在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，尤其涉及一株球状红球菌WJ4及其在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用。
【背景技术】
[0002]邻苯二甲酸酯(Phthalate ester acids, PAEs)作为一类主要的增塑剂，广泛分用于塑料制品中，并随着这些物品的生产、使用和处理而分布于各类环境介质中，土壤被认为是PAEs最大的库和汇。PAEs污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选和构建。Chang等筛选出两株对邻苯二甲酸酯具有降解效果的鞘胺醇单胞菌属(Sphigomonas)和棒状杆菌(Corynebacterium), Zeng和Carrara研究发表明假单胞菌和枯草芽孢杆菌对DEHP具有较好的降解效果，另有许多学者分离出多种具有降解短链PAEs功能的红球菌属细菌菌株。但是，有关能降解DEHP的球状红球菌种质资源很少被发现。目前关于球状红球菌对DEHP污染土壤的修复效果尚无报道。鉴此，本专利从PAEs污染设施菜地土壤中分离筛选出一株对DEHP具有良好降解性能的球状红球菌WJ4，研究了该菌对DEHP污染土壤的修复效应，为进一步研发PAEs污染土壤的生物修复提供了科学依据和新思路，具有十分广泛的应用潜力。
【发明内容】
[0003]解决的技术问题:本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种能够降解邻苯二甲酸酯(如DEHP)的微生物资源,该菌株为球状红球菌(Rhodococcusgloberulus strain) WJ4CGMCC N0.7965，该菌株能够以DEHP为唯一碳源进行好氧降解，在以DEHP (200mg/L)为唯一碳源的基础盐液体培养基中培养7d后，其对DEHP的降解达到96.4%。该菌接种于土壤21d后，土壤DEHP的降解可达57.5%，该菌株在DEHP污染土壤的生物修复中具有较好的应用前景。
[0004]技术方案:一株球状红球菌(Rhodococcus globerulus)WJ4,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年7月24日，保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号:CGMCC N0.7965。
[0005]球状红球菌(Rhodococcus globerulus)WJ4在修复邻苯二甲酸酯污染土壤中的应用。
[0006]球状红球菌(Rhodococcusgloberulus) WJ4 在修复 DEHP、DnBP 和 DnOP 污染土壤
中的应用。
[0007]球状红球菌(Rhodococcus globerulus)WJ4在生物修复邻苯二甲酸酯污染土壤中的应用，将球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株接种于LB液体培养基培养中，振荡培养至对数期；将上述菌悬液按土壤10% wt的接种量接入邻苯二甲酸酯污染土壤中，30°C避光培养。
[0008]球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4的无机盐基础培养基，组成为:NH4NO3L 0g, MgSO4.7H200.5g, CaCl2.2H2010mg, (NH4)2SO40.5g, KH2PO40.5g, NaCl0.5g,K2HPO4L 5g，MnSO4.H2020mg，微量元素溶液ImL,加超纯水至1L，ρΗ7.0 ;微量元素溶液:每升添加 FeSO4.7Η202.0g, MnSO4.Η202.0g, ZnSO4.7H200.5g, Na2MoSO4.2H200.5g,CuSO4.5H200.4g, NiCl2.6H200.2g 和 H3BO40.20g。
[0009]本发明提供一种邻苯二甲酸酯类物质的降解菌，其菌株是一株革兰氏阳性菌WJ4(2013年7月24日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0.7965),经鉴定为球状红球菌(Rhodococcus globerulus sp.)。WJ4 在牛肉骨蛋白胨培养基(LB)培养基(酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g, NaCll0.0g, pH7.0)平板上培养48h后，菌落淡黄色、圆形、黏质不透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑，菌落直径一般在1.0~2.5_。经染色镜检，该菌为革兰氏阳性，菌体呈球状或短杆状(见图1)。
[0010]该菌具有较高的降解DEHP的能力。将降解DEHP的球状红球菌(Rhodococcusgloberulus)WJ4菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基(LB)摇瓶中，振荡培养至对数期。将上述培养好的菌种按5%wt的接种量接种入150mL三角瓶培养，该菌株WJ4能以DEHP为唯一碳源生长，并对其具有较高的降解效率。在200mg/L初始浓度条件下，第Id、第3d、第7d时的降解率分别达到了 11.4%,67.9%和96.4%。可见，该菌株对DEHP具有较好的降解作用(见图2)。
[0011]将球状红球菌(Rhodococcus globerulus)WJ4菌液按20% wt的接种量接入PAEs苯污染土壤中，30°C避光培养28d后结果发现，与对照相比，接种活菌WJ4显著促进了污染土壤中PAEs (包括DnBP、DE HP和DnOP)总量的降低，在第0、3、7、14、21d，土壤中PAEs残留量分别为 2847.37,2443.98,2191.83、1656.43 和 869.09mg/kg，在第 21d 降解率达到了57.5% (见图3)。该菌株在PAEs污染土壤的生物修复中具有良好的应用前景。
[0012]本发明提供的球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株能在DEHP为唯一碳源和能源的无机盐培养基中生长并降解利用DEHP。无机盐培养基121°C灭菌30min，添加DEHP，使其浓度达到200mg/L。
[0013]有益效果该降解菌具有降解邻苯二甲酸酯的能力，对PAEs污染土壤有很好的修复前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为WJ4菌落形态及菌株显微镜照片(100X );
[0015]图2为菌株WJ4的16S rDNA的系统发育树；
[0016]图3为菌株WJ4对DEHP的降解曲线；
[0017]图4为WJ4对污染土壤中DEHP的降解效果；
[0018]图5为WJ4对土壤中PAEs同系物的共代谢。
【具体实施方式】
[0019]以下结合实例对本发明作进一步的描述:
[0020]实施例1:DEHP降解菌的筛选鉴定及降解特性[0021]1.1材料与方法
[0022]1.1.1供试材料
[0023]改良基础盐培养基(降解培养基，MM,g/L) =NH4NO3L 0g, MgSO4.7Η200.5g，CaCl2.2H2010mg, (NH4)2SO40.5g, KH2PO40.5g, NaCl0.5g, K2HPO4L 5g, MnSO4.H2020mg,微量元素溶液lmL，加超纯水至1L，pH7.0。微量元素溶液:每升添加FeSO4.7H202.0g,MnSO4.Η202.0g, ZnSO4.7H200.5g, Na2MoSO4.2Η200.5g, CuSO4.5Η200.4g, NiCl2.6Η200.2g和H3BO40.20g。添加DEHP，使其浓度达到200mg/L，作为唯一碳源。
[0024]牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(LB，g/L):酵母粉5.0g，蛋白胨l0.0g，NaCll0.0g,琼脂粉18g，加超纯水至1L。用2mol/L HCl和2mol/L NaOH溶液调整培养基的pH值在7.0，121°C灭菌20min。培养基采用超纯水配制。
[0025]主要化学品:DEHP购自北京百灵威化学技术有限公司。丙酮、正己烷等有机溶剂均为分析纯，重蒸后使用。硫酸为优级纯，无水硫酸钠(分析纯)、硅胶(100~200目，分析纯)、中性氧化招(分析纯)400°C活化6h,冷却后置于全玻璃容器中密封忙存，待用。另备色谱纯正己烷，提取DNA的试剂盒采用OMEGA的E.Z.N.A细菌DNA提取试剂盒。
[0026]1.1.2DEHP降解菌的筛选、驯化
[0027]DEHP降解菌分离方法采用土壤悬液摇瓶法筛选并驯化。称取5g设施菜地土壤于150mL含有50mL无菌水的三角瓶中在30°C，150rpm好氧培养2d后，取5mL 土壤菌悬液IOOmL的以100mg/L DEHP为唯一碳源的基础盐培养基中。30°C，150rpm好氧培养5d后，，以l%wt的接种量连续富集、转接5次。富集培养液经测定有降解效果后，提高富集培养液中DEHP的浓度至200mg/L，继续富集。转接5次经测定有降解效果后，稀释IO4~IO6涂布150 μ L至LB平板上，30°C培养。待平板上出现单菌落后，挑取单菌落划线3~4次进行纯化，纯化后将菌株转接至200mg/L DEHP为唯一碳源的基础盐培养液三角瓶中，30°C、150rpm摇培，分析单菌的降解效果。
[0028]1.1.3菌株的生理生化鉴定
[0029]菌株形态及生理生化特性测定指标包括9项:甲基红实验(M.R.试验)、乙酰甲基甲醇试验(V.P.试验)、接触酶试验(过氧化氢酶试验)、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、液化明胶试验、柠檬酸利用试验和糖酵解试验(葡萄糖、乳糖)。
[0030]1.1.4菌株的16S rDNA分子鉴定
[0031]将球状红球菌(Rhodococcus globerulus)WJ4菌株转接至LB培养液扩大培养，离心收集菌体，按照OMEGA的E.Z.N.A细菌DNA提取试剂盒提供的方法提取菌体总DNA。用细菌16S rDNA扩增通用引物(生工生物工程(上海)有限公司合成)对WJ4基因组进行PCR扩增。上游引物:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (Escherichia coli 对应位置为 8 ~27);下游引物:5' -TACCTTGTTACGACTT-3' (E.coli 对应位置为 1507 ~1492)。以 WJ4 总 DNA为模板，50 μ L 体系为:模板 I μ L，Premix rTaq (包括了&9酶、81^€61"、(1见1\]\%2+)25 4 1^弓丨物(20mmol/L)各 1μ L，超纯水 22μ L。聚合酶链式反应条件:94°C, IOmin ；94°C,30s ；55°C,30s ;72°C，1.5min ;循环35次，72°C延伸IOmin0 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶，于120V电泳30分钟。PCR产物采Axygen凝胶回收试剂盒纯化后酶连至pMD_18T载体(TAKARA公司)，转化E MoliDHSa感受态细胞，挑取阳性克隆，验证插入片断后测序(由生工生物工程(上海)有限公司完成)。将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比较。[0032]1.1.5球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株的溶液降解性能分析
[0033]将灭菌的降解培养基，以每瓶15mL分装在150mL玻璃三角瓶中待用(DEHP的浓度为200mg/L)。将LB培养基中培养至对数期的菌液12000rpm离心5min收集菌体，用pH7.0的0.05mol/L磷酸缓冲液洗涤3次后重悬，并调节0D_至1.0作为降解试验的接种菌液。向降解培养基中接种ImL菌悬液，设接种灭活菌悬液处理为对照(CK)。将离心瓶放于30°C、150rpm摇床培养7天,分别在第0d、第Id、第2d、第3d、第4d、第5d、第7d时取样,测定其DEHP浓度和菌的生长情况(0D_nm)。
[0034]1.1.6转化液中DEHP的提取和测定
[0035]取样后先加入100 μ L高氯酸终止反应。萃取相用色谱级的正己烷，按照每ImL样品中加入3mL (三倍体积)的正己烷萃取，加入0.4g硫酸铵作破乳剂，涡旋振荡3min，静置Ih0待样品分层稳定后，取上层有机相转移到玻璃离心管中，并加入0.4g无水硫酸钠脱水，取ImL用正己烷定容至5mL待GC-MS分析。每批样品设3组平行数据。用已知浓度的标准品检测样品回收率，其平均回收率达到98%。表明该方法能够满足实验要求。
[0036]色谱条件:采用带有质量选择检测器和自动进样器的Agilent5975-7890C型气相色谱质谱联用仪分析。色谱柱:DB-5弹性石英毛细管柱(30mX0.25mmX0.25um)，进样温度为250°C，检测器温度为280°C。程序升温:初始温度为50°C，保留1.0min, 15°C /min梯度升温至200°C,保持Imin,然后8°C /min梯度升温至280°C,持续3min。不分流进样Iul,载气为高纯氦气，流速为1.2mL/min。
[0037]质量控制:采用七点校正进行标准物质的校正曲线和外标法进行，6种PAEs混标(1000 μ g/g)的基 质加标平均回收率是80.3~112.7%，相对标准偏差〈11.3%，仪器检测限为0.10~0.31 μ g/g,方法检出限为0.02~0.29 μ g/g。该方法满足痕量有机物定量分析要求。
[0038]数据处理方法:降解率(％)=(灭菌处理溶液浓度-活菌处理溶液浓度)/灭菌处理溶液浓度X 100%。
[0039]1.2.结果与讨论
[0040]1.2.1球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株的菌落形态特征
[0041]通过分离纯化从设施菜地土壤中筛选得到4株DEHP降解菌，将其中一株能较好降解DEHP的菌编号为WJ4。WJ4在LB培养基平板上培养48h后，菌落呈淡黄色、圆形、黏质不透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑，菌落直径一般在1.0~2.5mm0经染色镜检，该菌为革兰氏阳性，菌体呈球状或短杆状(见图1)。
[0042]1.2.2球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株的生理生化特征
[0043]球状红球菌(Rhodococcus globerulus) WJ4菌株的生理生化特性测定结果见表
I。由表1可知，菌株WJ4的甲基红和V.P.反应阳性，过氧化氢酶和接触酶测定阳性，氧化酶测定阴性，不能利用硝酸盐和柠檬酸盐，能利用淀粉，不能液化明胶，吲哚试验呈阴性，蔗糖、葡萄糖发酵产酸产气，乳糖发酵不产酸不产气。
[0044]表1菌株ZYl的生理生化特征
[0045]
试验名称_试验结果试验名称_试验结果
甲基红试验， 淀粉利用情况一
V- P.反应_—_明胶液化试验_—_
【权利要求】
1.一株球状红球菌(/PAot/ococciAs WoAe/Y/JiAs) WJ4,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年7月24日，保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.7965。
2.权利要求1所述的球状红球菌(TPAot/oCOCCiAS^706(9/7/7^/51) WJ4在修复邻苯二甲酸酯污染土壤中的应用。
3.权利要求1所述的球状红球菌iRhodococcusgloberulus) WJ4在修复DEHP、DnBP和DnOP污染土壤中的应用。
4.权利要求2所述的球状红球菌(TSotZococciAsWJ4在生物修复邻苯二甲酸酯污染土壤中的应用，其特征在于将球状红球菌(?o￡/ococcw5.globerulus )WJ4菌株接种于LB液体培养基培养中，振荡培养至对数期；将上述菌悬液按土壤10% wt的接种量接入邻苯二甲酸酯污染土壤中，30°C避光培养。
5.权利要求1所述的球状红球菌(TSotZococciAsWoAerW?5.) WJ4的无机盐基础培养基，其特征在于组成为=NH4NO3 1.0 g, MgSO4.7Η20 0.5 g, CaCl2.2H20 10mg，(NH4)2SO4·0·.5 g, KH2PO4 0.5 g, NaCl 0.5 g, K2HPO4 1.5 g, MnSO4.H2O 20mg,微量元素溶液 ImL,加超纯水至1L，ρΗ7.0 ;微量元素溶液:每升添加FeSO4.7Η20 2.0 g，MnSO4.H2O 2.0 g，ZnSO4.7H20 0.5 g, Na2MoSO4.2H20 0.5 g, CuSO4.5H20 0.4 g, NiCl2.6H20 0.2 g 和H3BO4 0.20 go·
【文档编号】B09C1/10GK103589659SQ201310431042
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】汪军, 滕应, 张满云, 陈婷, 骆永明, 马文亭, 李振高 申请人:中国科学院南京土壤研究所