嗜温漆酶基因和嗜温漆酶及其应用的制作方法

嗜温漆酶基因和嗜温漆酶及其应用的制作方法
【专利摘要】嗜温漆酶基因和嗜温漆酶及其应用，属于生物【技术领域】，具体涉及一种来源于嗜温细菌ZW2531-1的嗜温漆酶基因、由该基因表达的嗜温漆酶ZGL3以及该嗜温漆酶在纺织工业和环境保护等领域中的应用。更具体地，本发明所述的嗜温漆酶基因是来源于一种嗜温细菌，以及由该基因表达的嗜温漆酶，本发明还涉及这种嗜温漆酶在工业染料降解中的有效应用，进而涉及这种嗜温漆酶在纺织工业和环境保护等领域中的广泛应用。本发明所提供的嗜温漆酶不但能安全、有效地实现蒽醌类、偶氮类和三苯甲烷类染料的降解和脱色，有广阔的应用前景，而且易实现工程化制备，有较高的实用价值。
【专利说明】嗜温漆酶基因和嗜温漆酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种来源于嗜温细菌ZW2531-1的嗜温漆酶基因、由该基因表达的嗜温漆酶ZGL3以及该嗜温漆酶在纺织工业和环境保护等领域中的应用。
【背景技术】
[0002]漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，它可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香类化合物，同时将分子氧还原成水。由于漆酶作用底物范围十分广泛、催化效率高，在造纸工业(生物制浆和漂白)、纺织工业(人工合成染料脱色)、纺织纤维软细化、食品工业(食品风味改良)、饲料营养改善、新型药物开发、土壤的生物修复、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。[0003]漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。近年来，部分真菌漆酶已经应用于多个工业领域，如来自黑曲霉的漆酶Denilite II S等。然而真菌漆酶受环境影响较大，在碱性条件下活性迅速降低，严重影响了它在工业领域中的应用。随着全基因组测序技术的迅速发展，人们发现，漆酶在细菌中同样广泛存在。细菌漆酶可以克服真菌漆酶的缺点，细菌具有生长快、易于培养的特点，在碱性环境和高温条件下具有良好的催化活性并具有较高的稳定性。由于工业染料废水等一般温度较高，碱性较强，真菌漆酶在实际应用中表现出稳定性较差，而这种环境却不影响细菌漆酶功能的发挥，因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。虽然目前对细菌漆酶资源的发掘还很有限，但迄今已经在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)等微生物中发现了漆酶。
[0004]纺织、造纸和塑胶等行业产生的染料废水往往处理不到位，导致了大量工业染料废水的排放。随着印染工业的迅速发展，染料的品种和数量不断增加，全球每年至少有10%的染料通过废水排放到自然环境中，这些废水中的染料很多是具有毒性或致癌性的，严重危害了水生动物以及人类本身。工业使用的合成染料绝大多数是芳香族化合物，使用传统的方法无法有效去除废水中的染料，而且非常耗能，但相比之下，应用漆酶来处理工业染料废水既经济、有效、又环境友好，是目前和未来较理想的治理方法。漆酶因其具有广泛的底物范围、安全、环保，在工业染料废水处理上具有显著的应用优势和较好的应用前景而引起了人们极大的关注。真菌漆酶虽然对纺织染料的脱色及降解效果明显，但产漆酶的真菌因较细菌生长缓慢、发酵周期长、生长温度和PH范围较窄而限制了真菌漆酶的应用，而产漆酶的细菌因具有生长迅速、发酵周期短、耐温、在碱性条件下稳定等特点而在工业上具有更好的应用前景和实用价值。目前关于细菌漆酶在染料降解与脱色方面的研究报道还较少，通过研究细菌漆酶对不同合成染料的脱色效果，可以进一步推动细菌漆酶的工业应用。
[0005]偶氮类染料、蒽醌染料和三苯甲院类染料是目前工业是上用量最大的三类染料，也是较难降解的染料。目前世界各国都在致力于开发能有效降解这三类染料的细菌漆酶，以期实现有效保护和修复生态环境，但是前提是要开发出理想的细菌漆酶。
【发明内容】

[0006]本发明的目的之一是提供一种优良的嗜温漆酶基因；
[0007]本发明的另一个目的是利用上述嗜温漆酶基因制备高效、广谱的嗜温漆酶ZGL3，其中所述的制备包括应用基因工程技术，利用细菌表达系统进行漆酶的表达与制备；
[0008]本发明的再一个目的是通过对嗜温漆酶ZGL3的理化性质的分析，提供嗜温漆酶ZGL3在工业染料的氧化、降解与脱色中的用途。
[0009]本发明涉及一种嗜温漆酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0010]本发明所述的嗜温漆酶ZGL3，其氨基酸序列是SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0011]本发明所述的嗜温漆酶基因来自嗜温芽孢杆菌ZW2531-1 (参见王阳等，“一株产新型淀粉酶的嗜温菌ZW2531-1的分离与鉴定”，吉林大学学报(理学版)，2008，46(4):779-783)。在前期工作中我们发现，该菌所分泌的蛋白具有漆酶的活力，因此推断该菌的基因组中含有漆酶基因。
[0012]对于嗜温细菌ZW2531-1，通过菌体培养、目的基因钓取，得到本发明所述的嗜温漆酶基因。我们委托上海生工生物技术有限公司进行对该基因进行测序，测序结果如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]将本发明的嗜温漆酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的表达载体，优选的表达载体是原核表达载体[pET-28a、pET-41b等系列的pET表达载体(通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-或C-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)或pPZW103等表达载体(枯草杆菌表达载体,含有P43强启动子以及卡那霉 素抗性基因等，参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2): 173~177)]。
[0014]上述重组表达载体按生物学常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括真核表达细胞和原核表达细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，优选的宿主细胞是大肠杆菌或枯草杆菌，进一步优选的大肠杆菌宿主细胞为E.coli BL2KDE3)或E.coliBL21 (DE3)pLysS (通用的大肠杆菌表达宿主细胞，Novagen、Invitrogen等公司有售),进一步优选的枯草杆菌宿主细胞为WB600 (参见黄鹤等，“重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化”，中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2): 173~177)，表达载体导入宿主细胞后得到表达嗜温漆酶的工程菌。
[0015]工程菌表达的漆酶为可溶性嗜温蛋白。针对不同的宿主细胞，表达产物的纯化有不同的方法:1、针对大肠杆菌宿主细胞表达的胞内嗜温蛋白，通过表达细胞超声破碎和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可分离得到细胞可溶性嗜温蛋白，再使用Ni2+-NTA亲和柱纯化得到纯化的嗜温蛋白；2、针对枯草杆菌宿主细胞表达的胞外嗜温蛋白，通过表达体系细胞的离心分离获得枯草杆菌表达细胞的培养液，再通过加热失活培养液中的杂蛋白即可分离纯化得到表达细胞分泌的嗜温蛋白。
[0016]表达的嗜温蛋白经活性实验鉴定，具有嗜温漆酶的活性，可催化多种染料等底物的氧化、降解与脱色。该种嗜温蛋白即为本发明所述的嗜温漆酶ZGL3，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。与传统漆酶相比，它具有明显的应用稳定性优势和作用广谱性优点，主要包括:(I)本发明的耐温漆酶在pH=5~9的范围内具有较好的稳定性，(2)80°C半衰期为115分钟，(3)本发明的耐温漆酶对蒽醌类染料、偶氮类染料和三苯甲烷类染料的脱色作用均强，可用于工业染料的脱色。
[0017]以上技术方案中所有分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)进行。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1:嗜热漆酶ZGL3基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中M:DNA分子Marker ；S:嗜热漆酶ZGL3基因，在分子量约1600bp处有明亮条带；
[0019]图2:重组表达载体pET28a_ZGL3构建示意图；
[0020]图3:嗜温漆酶基因测序谱图，共测二个反应，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温漆酶基因(1542bp)；
[0021 ] 图4:纯化得到的嗜温漆酶ZGL3的SDS-PAGE电泳图谱，其中M:蛋白质分子Marker ；1:负对照；2:表达菌上清液；3:表达菌沉淀；4:纯化的嗜温漆酶ZGL3 ；
[0022]图5:嗜温漆酶ZGL3的pH-活力曲线(A)和pH稳定性曲线(B)；
[0023]图6:嗜温漆酶ZGL3的温度-活力曲线(A)和温度稳定性水平(B)；
[0024]图7:嗜温漆酶ZGL3对染料RBBR、刚果红、靛蓝胭脂红、甲基红和结晶紫的脱色效率曲线。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:嗜温漆酶ZGL3基因克隆及嗜温漆酶ZGL3的表达与制备，包括以下步骤:
[0026](I)嗜温细菌ZW2531-1的培养及其染色体DNA的提取
[0027]每100毫升嗜温细菌ZW2531-1的培养基组分如下:酵母粉0.4g，蛋白胨0.08g,NaCl0.3g，培养基的pH=7.6 ;培养条件为:50°C摇床中以200rpm转速恒温培养约8h ;ZW2531-1干细胞加入ImL上述培养基中培养8h后，再转至IOOmL新鲜的上述培养基中扩大培养8h，8000rpm离心5min收集培养的嗜温菌体，_20°C保存菌体备用。
[0028]取0.2g上述收集的嗜温菌体，用400 μ L、25mmol/L的Tris-HCI缓冲液(pH=8.0，含50mmol/L葡萄糖、lOmmol/L EDTA)洗涤菌体一次后，离心弃上清液；再用200 μ L上述缓冲液重悬菌体，加入50 μ L、50mg/mL溶菌酶，室温消化5min ;加入50 μ L的SDS溶液{终浓度为2% (g/mL) }、25 μ g蛋白酶K, 55°C恒温水浴消化3h ;加入2 μ L的lmg/mL RNase A,37°C恒温水浴再消化30min ;加入与上述溶液等体积(300 μ L)的酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)，颠倒混匀，1000Orpm离心10min(4°C)，将上清液转移至另一支离心管中，向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，_20°C静置30min后，1000Orpm离心IOmin (4°C)，收集菌体染色体DNA沉淀；用200 μ L的70%乙醇(体积比)漂洗沉淀，1000Orpm离心IOmin (4°C )，收集沉淀，吸干，室温静置IOmin以除尽乙醇；最后用100 μ L的TE溶液(ρΗ=8.0)重新溶解DNA沉淀，取5 μ L溶液用0.7% (g/mL)的琼脂糖凝胶电泳鉴定所得染色体DNA的浓度和大小，只在分子量20Kb附近有一条亮带，为所制得的染色体DNA，即本发明所述的嗜温漆酶基因的PCR扩增模板，_20°C保存备用。
[0029](2)嗜温漆酶ZGL3基因的钓取及重组克隆载体的构建[0030]本发明所述的嗜温漆酶ZGL3基因通过PCR方法从步骤(1)所制得的染色体DNA中扩增而得到。所需引物依据枯草芽孢杆菌漆酶基因中的保守序列及表达载体的多克隆位点序列而设计，并委托上海生工生物技术有限公司合成，其序列如下:
[0031]上游引物:5，CGGGATCCATGACACTTGAAAAATTTGTG3，,划线的GGATCC 序列是内切酶BamH I识别位点；
[0032]下游引物:5’CCCTCGAGTTA ITTATGGGGATCAGTTAT3’，划线的 CTCGAG 序列是内切酶XhoI识别位点。
[0033]上述两个引物所设置的酶切位点与本发明所用的表达载体pET_28a (通用的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-末端组氨酸标签以及卡那霉素抗性基因等，Novagen,Invitrogen等公司有售)的BamH I和XhoI相匹配,适合于在大肠杆菌中高效表达。
[0034]PCR 反应:100μ L 反应体系中含I μ L Εχ-Taq DNA 聚合酶、10 μ L Εχ-Taq DNA 聚合酶缓冲液、1.5 μ L dNTP混合物(每种核苷酸浓度为25mmol/L)、4 μ L染色体DNA、I μ L上游引物、I μ L下游引物、81.5μ L超纯水。每个循环中94°C变性0.5min，55°C退火Imin，72。。延伸2min,最后一次循环延至IOmin,共30个循环。用1.0% (g/mL)的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量约为1600bp，如图1中S所示。
[0035]使用DNA纯化试剂盒(Bio Basic公司生产的EZ Spin Column DNA GelExtraction Kit)纯化PCR产物，步骤如下:向PCR溶液中加入4倍体积的结合缓冲液II(Binding Buffer II),加入 EZ-1O 柱子中，静止 2min, 1000Orpm 离心 2min ;加入 500 μ L 的洗脱缓冲液(Wash Solution), 1000Orpm离心lmin,重复I次，将EZ-10柱转移到干净的1.5mL微量离心管(microfuge tube)中，加入30 μ L无菌去离子水，室温放置2min,然后1000Orpm离心2min，得到 要纯化的目的DNA片段。取3 μ L上述纯化的目的DNA片段，加入IuL pUcm-T载体、IyLlOXTADNA连接酶缓冲液，加去离子水定容至10 μ L，最后加入I单位的的T4DNA连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置16°C水浴过夜或25°C水浴4小时后，得到连接好的克隆载体pUcm-T-ZGL3。
[0036](3)嗜温漆酶基因的序列分析
[0037]重组克隆载体pUcm-T_ZGL3转化E.coli DH5 α:取10 μ I连接好的重组表达载体pUcm-T-ZGL3加入100 μ I E.coli DH5 α感受态细胞【E.coli DH5 α感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”(第二板，科学出版社)49页】中，冰浴30分钟后置入42°C水浴中保温I分钟，立即取出并置冰浴中冷却2分钟。加入200 μ 137°C预热的SOC液体培养基，37°C、150rpm振摇培养60分钟后，取出100 μ I培养液涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂培养平板上，37 °C培养16小时后，出现转化菌落。
[0038]重组克隆载体pUcm-T-ZGL3的克隆与嗜温漆酶基因序列分析:挑取单菌落加入2mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37°C，200rpm培养过夜。提取扩增的重组载体pUcm-T-ZGL3，经BamH I和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，选择切割产物与理论值一致的克隆进行核酸序列分析，结果如图2 (pUcm-T-ZGL3载体测序谱图，共测二个反应A、B)所示，进一步使用Gene-man软件组装得到全长的嗜温漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示(1542bp)，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
[0039](4)嗜温漆酶ZGL3基因的重组表达载体的构建
[0040]分别将l.0yg pUcm-T-ZGL3、pET_28a载体与适量去离子水混匀，使其总体积分别为18 μ 1，各加入2单位限制性内切酶BamH I和XhoI及2μ I相应的IOXH缓冲液，混匀，置37°C水浴保温2小时后，分别使用DNA纯化试剂盒回收约1540bp的目的DNA片段和线性化的pET28a载体，按上述pUcm-T-ZGL3相同的方法连接后转化E.coli DH5 α，经BamHI和XhoI双酶切鉴定、序列分析正确后获得阳性克隆。提取重组质粒获得重组表达载体pET28a-ZGL3，其中目的基因zgl3的5’端融合了载体上的编码6XHIS标签序列(6XHIS标签的核苷酸序列见 pET_28a 图谱，网址为 http://www.merckbiosciences.c0.uk/docs/docs/PR0T/TB074.pdf )，它是表达的该蛋白的纯化标签。重组表达载体pET28a_ZGL3的构建过程如图2所示。
[0041](5)嗜温漆酶ZGL3的表达与制备
[0042]重组表达载体pET28a_ZGL3可转化到E.coli BL21(DE3)系列细胞中，如E.coliBL21(DE3)、E.coli BL21 (DE3)pLysS、E.coli BL21 (DE3)pLysE 细胞等等，获得高表达的嗜温漆酶ZGL3。
[0043]在本实施例中使用E.coli BL21(DE3)为宿主细胞，并使用卡那霉素筛选出能高效稳定表达的单细胞株。具体操作:将l.0yg表达载体pET28a-ZGL3加入到100 μ IE.coliBL21 (DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42 °C水浴保温90秒，冰浴冷却2分钟，加入800 μ 137°C预热的LB液体培养基，37°C 150rpm振摇培养60分钟。取200 μ I培养液涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养平板上，37°C培养16小时后，获得转化的单菌落。
[0044]挑取转化的单菌落，接种于2mL LB培养基中，37°C振摇培养过夜。以1:100 (体积比)的比例接种IOmL LB培养基(30 μ g/mL Kan)，37 °C 200r/min振荡培养至OD600=0.8~1.0 (约2~3小时)，加异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.6mM, 37°C、200rpm振荡诱导4小时后，4°C、5000rpm离心5分钟收集菌体。
[0045]用1/10培养液体积的IOmM Tris -Cl (pH=8.0)重悬菌体，置冰浴中超声波处理破碎菌体。破碎菌体4°C，5000rpm离心15分钟，获得上清液。然后使用Ni2+-NTA亲和柱纯化得到本发明的嗜温漆酶ZGL3:将上清液缓慢流过Ni2+-NTA柱，然后用5倍柱体积PBST洗柱3次，最后用洗脱缓冲液(20mM GSH, 50mM Tris-HCI,pH=8.0)洗脱本发明的嗜温漆酶ZGL3。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的嗜温漆酶ZGL3的纯度和分子量，结果如图4所示，可见只在64kDa处有一蛋白带，说明纯化得到的嗜温漆酶ZGL3的分子量为62kDa，与理论值相符。
[0046]本发明从野生型产酶菌株ZW2531-1中钓取并克隆了嗜温漆酶ZGL3的基因，使用该基因表达出嗜温漆酶ZGL3。所述的嗜温漆酶ZGL3以可溶性蛋白形式表达，使用Ni2+-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的嗜温漆酶ZGL3。
[0047]实施例2:嗜温漆酶ZGL3的特性
[0048](1)最适反应pH和pH稳定性
[0049]pH值是影响酶催化活力的一个重要因素。通常酶在一定的pH值下表现出最大的催化活力，而偏离此PH值越远，酶的催化活力越低，对本发明所述嗜温漆酶ZGL3的催化活力检测的最大PH范围为2.2~10.0。
[0050]分别以ABTS、DMP为底物，测定嗜温漆酶ZGL3在不同pH值的缓冲液中(2.2.0-10.0)的活力，以最高酶活力为100%，计算其它pH条件下的相对酶活。以酶的相对活力对pH值作图(图5A)，结果表明嗜温漆酶ZGL3的催化ABTS、DMP的最适pH值分别为4.0、7.5ο
[0051]分别将嗜温漆酶ZGL3置于不同pH值(3.0~9.0)的缓冲液中孵育Ih后，以ABTS为底物在ABTS最适pH条件下测定嗜温漆酶ZGL3的活力，结果如图5B所示，表明嗜温漆酶ZGL3在pH值5.0~9.0范围内相对稳定，放置Ih后依然维持60%以上的活性，而当pH值低于或高于此范围时，活力下降明显。这说明嗜温漆酶ZGL3在pH值5.0~9.0范围内具有较好的pH稳定性。
[0052](2)最适反应温度和温度稳定性
[0053]温度是影响酶催化活力的另一个重要因素。通常酶在高温下的反应活力远高于低温。对本发明所述嗜温漆酶ZGL3的催化活力检测的温度范围为30~90°C。
[0054]以ABTS为反应底物，在30~90°C的温度范围内分别测定嗜温漆酶ZGL3的活力，以最高酶活力为100%，计算其它pH条件下的相对酶活。以酶的相对活力对温度作图，如图6A所示，表明嗜温漆酶ZGL3的活力在30~60°C范围内随温度的升高而提高，超过60°C，活力则下降，最适温度为60°C。
[0055]将嗜温漆酶ZGL3置于不同的温度(50°C~80°C)分别孵育lh、2h、4h、6h、8h后按上述方法分别测定酶嗜温漆酶ZGL3的活力，结果如图6B所示，显示在80°C半衰期为115分钟，这说明嗜温漆酶ZGL3具有非常好的温度稳定性。
[0056]实施例3:嗜温漆酶ZGL3催化染料脱色的效力分析
[0057]分别以ABTS、丁香醛为介体底物，分析嗜温漆酶ZGL3对五种染料活性蓝19(Remazol Brilliant Blue R,RBBR)、刚果红(Congo red)、親蓝胭脂红(indigo carmine)、甲基红(Methyl red)和结晶紫(Crystal violet)的不同浓度(100mg/L、10mg/L、40mg/L、50mg/L、5mg/L)的脱色效力，脱色率通过下述公式计算:脱色率％=(初始吸光值一催化后吸光值)/初始吸光值X 100%。
[0058]表1.嗜温漆酶ZGL3催化染料脱色的效力分析
[0059]
【权利要求】
1.一种嗜温漆酶基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种嗜温漆酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求2所述的嗜温漆酶，其特征在于:是由权利要求1所述的嗜温漆酶基因与表达载体重组，将重组后的表达载体导入原核表达细胞内得到表达的嗜温漆酶。
4.如权利要求3所述的嗜温漆酶，其特征在于:表达载体为pET-28a、pET-41b、pMA5或pPZW103o
5.如权利要求3所述的嗜温漆酶，其特征在于:原核表达细胞为大肠杆菌或枯草杆菌。
6.如权利要求2~5任何一项所述的嗜温漆酶，其特征在于:所产生的嗜温漆酶为胞内酶或胞外酶。
7.权利要求2~5任何一项所述的嗜温漆酶在蒽醌类、偶氮类或三苯甲烷类染料的降解和脱色中的应用。
【文档编号】C02F101/38GK103602640SQ201310498465
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】张应玖, 高键, 关可兴 申请人:吉林大学