一株多环芳烃降解菌及其降解基因的应用的制作方法
【专利摘要】一株多环芳烃降解菌及其降解基因的应用，涉及环境污染物生物处理。所述多环芳烃降解菌为印度洋速生杆菌（Celeribacter?indica）P73，保藏编号为CGMCC?No.1.12539。所述印度洋速生杆菌（Celeribacter?indica）P73可用于制备含多环芳烃废水生物处理剂，也可用于受含多环芳烃污染环境的修复。通过对印度洋速生杆菌（Celeribacter?indica）P73基因组的测序发现该菌含有很多与石油烃或多环芳烃降解相关的基因。这些基因在该菌降解石油烃或多环芳烃过程中发挥重要作用。
【专利说明】一株多环芳烃降解菌及其降解基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境污染物生物处理，尤其是涉及一株多环芳烃降解菌及其降解基因的应用。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类含有一个苯环以上的芳香化合物，化学结构十分稳定，疏水性强，不易降解，包括萘、菲、荧蒽等在内，有200多种。PAHs具有高毒性，有很强的“三致”作用，即:致癌、致畸和致突变作用。PAHs是环境致癌化学物质中最大的一类，其中，苯并[α ]芘和苯并[α ]蒽等是危害最大的，苯并[α ]芘是第一个被发现的环境化学致癌物，被国际癌症研究机构指定为一级致癌物质，已列为国内外环境监测的常规项目之一。PAHs已受到各国环境保护组织的重视，美国环境保护署将16种未带取代基的PAHs列入了优先治理的污染物黑名单。
[0003]大气中的大部分PAHs来源于煤和石油的不完全燃烧，而陆地环境中则主要来源于固体废物、工业漏渗和大气沉降。海洋环境主要PAHs来源是海底原油渗漏、海上运输、油井渗漏、油轮事故等。PAHs是石油中除烷烃以外的主要组分。全世界平均每天开采出7000万加仑石油，其中有一半需要通过海洋来运输，在石油的生产运输过程中不可避免地会发生油井自然渗漏、海上运输泄漏等。更为严重的是由于油轮事故导致的大范围污染，污染物中易挥发的成分通过蒸发进入大气中，难溶解难挥发的成分少数可以通过光氧化等途径降解，而多数则通过黏附于海洋沉积物经年累月地在海洋中积累，PAHs就属于后者。残留在海洋中的PAHs可能会在海洋生物体内富集从而毒害海洋生物。更甚的是，这种难降解的化合物可能会经过食物链累积作用直接影响到人类健康(王桂山，仲兆庆.PAH(多环芳烃)的危害及产生的途径[J].山东环境，2001，2):41-41)。
[0004]环境中的PAHs可以通过多种方式去除，包括自然挥发、光降解、化学降解、生物降解、颗粒吸附等，微生物转化与降解被认为是环境中PAHs去除最为彻底有效的方式。目前，已知的环境中PAHs降解微生物有许多，包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。PAHs的细菌降解已有广泛的研究，许多细菌被分离鉴定为PAH s降解菌，这些菌株主要包括Pseudomonas、Sphingomonas、Cyc1clastiCUs、BurkhoIderia、Rhodococcus、PoIaromonas、Neptunomonas、JanibacterΛ Nocardia、Bacillus、Mycobacterium 等属(CERNIGLIA CE.Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons[J].Current opinion inbiotechnology，1993，4(3):331-338;张志家，金袓亮，竺乃恺，et al.强致突变物二硝基苯并(a)芘的合成，结构与致突变性研究[J].化学学报，1990，1014.；GIBS0N DT，MAHADEVAN V, JERINA D M，et al.0xidation of thecarcinogens benzo[a]pyrene andbenzo[a]anthracene to dihydrodiols by a bacterium[J].Science, 1975，189(4199):295-297)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株多环芳烃降解菌及其降解基因的应用。
[0006]所述多环芳烃降解菌为印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73,该菌已于2013年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101 ;保藏中心登记入册编号为CGMCCN0.1.12539。所述印度洋速生杆菌(Celeribacter indica)P73来源于西南印度洋的深海沉积物，经人工富集培养、分离纯化得到。经生理、生化、形态鉴定和16S rRNA基因序列分析等，证实该菌为革兰氏染色阴性的速生杆菌属(Celeribacter)的新菌株P73,命名为印度洋速生杆菌(Celeribacter indica)P73。菌株16S rDNA序列的GenBank登入号为 EU440950。
[0007]所述印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73可用于制备含多环芳烃废水生物处理剂，也可用于受含多环芳烃污染环境的修复。印度洋速生杆菌(Celeribacterindica) P73为革兰氏阴性细菌，其生物学特性为触酶阳性，氧化酶阳性，非发酵型，专性需氧，菌体形态为呈卵杆状，菌体大小为1.2~1.3μηι长,0.6~0.7μηι宽,菌落呈白色不透明，边缘规则，表面光滑，有晕环，直径3~4mm。该菌的最适生长条件为:pH=6.5~8.5，温度 28 ~37°C，NaCl 浓度 2% ~7%。该菌的主要脂肪酸为 Sum In Feature8 (C18:1 ω 7c/ω 6c)(58.6%)、C19:0 ω 8ccyclo (17.4%)和 C16:0 (7.9%)，G+C 含量为 64.5mol%。
[0008]印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73对下列抗生素敏感:氨卞青霉素(10μ g)、羧卞青霉素(100μ g)、先锋霉素4 (30 μ g)、先锋霉素5 (30yg)、先锋必素(30 μ g)、先锋霉6 (30μ g)、氯霉素(30 μ g)、环丙沙星(5 μ g)、红霉素(15 μ g)、利福平(5“8)、庆大霉素(1(^8)、卡那霉素(3(^8)、米诺四环素(3(^8)、新霉素(1(^8)、氟哌酸(10 μ g)、氧氟沙星(5 μ g)、青霉素G (10呢)、氧哌嗪青霉素(10(^8)、多粘菌素8(30U)、头孢三嗪(30μ g)、链霉素(10μ g)、四环素(30μ g)、万古霉素(30μ g)和强力霉素(30yg);对氯洁霉素(2yg)、呋喃唑酮(15yg)、复方新诺明(25yg)、林可霉素(2yg)、甲硝唑(5 μ g)和苯唑青霉素(I μ g)不敏感。
[0009]印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73能很好地利用吐温80,溴丁二酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，D-丙氨酸，琥珀酸，D-阿拉伯醇，D-纤维二糖，D-果糖，a -D-葡萄糖，D-海藻糖，麦芽糖，D-甘露醇，L-鼠李糖，D-山梨醇，蔗糖，松二糖，丙酮酸甲酯，单甲基琥珀酸，顺-乌头酸(丙烯三羧酸))，羟基丁酸，α-酮戊二酸，D，L-乳酸，丙酸，奎尼酸；并可微弱地利用吐温40，乙酸，糊精，α-羟基丁酸，α-酮丁酸，琥珀酰胺酸，次黄嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，丙三醇。
[0010]上述生理生化特性和16S rDNA序列与对应模式菌株比较分析结果表明，印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73是速生杆菌属(Celeribacter)的一个新菌种。
[0011]印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73能够利用混合PAHs、联苯、萘、2_甲基萘、2，6-二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和荧蒽等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，该菌在15天能将人工海水培养基中的联苯、萘、2-甲基萘、2，6-二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和荧蒽分别降解 88.8%,27.3%,75.2%,78.9%,73.4%,76.0%、92.2%,93.7%,95.3%、42.9%,97.0%和20.0%。印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73可用于多环芳烃、柴油和原油的降解。[0012]通过对印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73基因组的测序发现该菌含有很多与石油烃或多环芳烃降解相关的基因。这些基因在该菌降解石油烃或多环芳烃过程中发挥重要作用。【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73在原油柴油(1:1)中的生长情况。在图1中，左:无菌对照；右:菌株P73降解原油柴油(I: I)。
[0014]图2为印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73对各种碳源的降解率。在图2中，横坐标为碳源，纵坐标为降解率。
【具体实施方式】
[0015]下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但并不因此将本发明限制在以下实施例范围之中。以下实施例中采用的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0016]实施例1:印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73的分离与降解原油柴油(I: I)的性能
[0017]现场采集西南印度洋的深海沉积物，采用IOOmL海水培养基加入PAHs(萘、菲、蒽、芘)作为碳源和能源进行静置富集培养。2个月后在实验室将富集物转接，并将最终的富集物梯度稀释、涂布216L平板，分离纯化单菌得到菌株P73。菌株P73经过接种至液体培养基中验证其降解多环芳烃、PAHs的能力，发现菌株P73是I株具有PAHs降解谱很广降解能力很强的菌株，该菌经16S rDNA鉴定为速生杆菌属(Celeribacter)。216L培养基成分:乙酸钠lg/L，硝酸铵0.2g/L，柠檬酸钠0.5g/L，普通肉汤培养基0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂粉15g/L，调pH7.5，121°C高压蒸汽灭菌20min。海水培养基成分:取大洋表层海水用121 °C高压蒸汽灭菌20min后，补加1%体积已灭菌的KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及
0.1% 体积 0.22 μ m 滤膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0018]将印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73接种至含原油柴油(1:1)的海水培养基中，在180r/min、28°C摇床中培养14天后(图1)，观察该菌对于原油柴油(I: I)的降解能力。结果发现，该菌能够降解原油柴油(I: I )，培养基变色为橙色，且培养基有浑浊(图1右)。
[0019]实施例2:印度洋速生杆菌(Celeribacter indica)P73对多环芳烃的降解性能测
定
[0020]将印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73接种至不同碳源(联苯、萘、2_甲基萘、2，6- 二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩、荧蒽、屈和芘)的海水培养基中，同时设置底空白对照(只加碳源不加菌)，在180r/min、28°C摇床中培养15天后观察菌株的生长状况，并测定该菌对各底物的降解率。结果表明，该菌株能够利用联苯、萘、2-甲基萘、2，6- 二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和荧蒽，降解率分别为 88.8%,27.3%,75.2%,78.9%,73.4%,76.0%、92.2%,93.7%、95.3%,42.9%,97.0% 和 20.0% (参见图 2)。
[0021]实施例3:印度洋速生杆菌(Celeribacter indica)P73的石油烃和芳香烃降解相关基因的应用[0022]表1菌株P73烃类降解关键基因
[0023]
【权利要求】
1.一株多环芳烃降解菌，其特征在于为印度洋速生杆菌(Celeribacter indica) P73,该菌已于2013年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.1.12539。
2.如权利要求1所述一株多环芳烃降解菌在制备含多环芳烃废水生物处理剂中的应用。
3.如权利要求1所 述一株多环芳烃降解菌在修复受含多环芳烃污染环境中的应用。
【文档编号】C02F3/34GK103540551SQ201310518343
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】邵宗泽, 赖其良, 曹军伟, 袁军 申请人:国家海洋局第三海洋研究所