一株产黄青霉ch03菌株及其在修复土壤重金属污染中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于土壤重金属污染的修复领域，公开了一株产黄青霉（Penicillium?chrysogenum）CH03菌株，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：M2013604。本发明还公开了产黄青霉CH03菌株在修复土壤重金属污染中的应用和一种土壤重金属污染修复方法。本发明能够提高供重金属污染农田中生长的生菜和小麦产量并降低植物组织中铜、镉含量，是一种微生物—有机物料联合进行重金属污染土壤原位修复方法，操作简单、成本低廉、无需停耕、修复效果好，是一种环境友好的重金属污染土壤修复方法。
【专利说明】一株产黄青霉CH03菌株及其在修复土壤重金属污染中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于土壤重金属污染修复领域，具体涉及一株产黄青霉CH03菌株及其在修复土壤重金属污染中的应用。
技术背景
[0002]由于采矿冶炼、污水灌溉、农药化肥的大量施用等原因，导致我国受重金属污染的耕地面积近2000万公顷，约占总耕地面积的1/5。重金属不可被降解，在土壤中不断累积后能够污染地下水，或通过食物链威胁人类和动物的健康。重金属固定修复因其操作简便、成本低廉，易于实现原位修复等优点日益受到人们的重视，特别适用于具有中低重金属污染农田的修复。原位固定技术通过添加外源物质改变土壤中重金属的存在形态，减少重金属的淋溶性和生物有效性，降低重金属的潜在生态危害性。
[0003]秸杆是一种多用途、可再生的生物资源。中国每年生产稻草秸杆达1.752亿吨，占秸杆总量的31.6%。秸杆还田能够将作物吸收的大部分营养元素补充回土壤，增加土壤有机质，对维持土壤养分平衡起着积极作用。同时，秸杆还田还能够改善土壤团粒结构和理化性状，增加土壤肥力，节约化肥用量，增加作物产量，促进农业可持续发展。除此之外，由于秸杆含有大量的木质素和纤维素，是土壤有机质，特别是腐殖物质的重要来源，而后者能够有效的对重金属离子进行吸附、络合，降低土壤中水溶性和可交换态重金属比例，降低重金属的生物有效性。
[0004]微生物能够通过胞外络合、胞外沉淀和胞内累积等作用固定重金属。产黄青霉属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目，从梗孢科青霉属。产黄青霉对多种重金属离子具有较强的耐受能力和吸附性能，利用其处理重金属污染废水，已获得很好的去除效果。此外，产黄青霉能够通过分泌胞外酶参与木质素、纤维素的降解，在秸杆、堆肥等有机材料处理方面已有应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CH03菌株及其在修复土壤重金属污染中的应用，本发明还提供一种土壤重金属污染修复方法。
[0006]本发明是这样实现的:
[0007]首先利用高浓度重金属选择培养基从鸡粪堆肥中筛选得到一株真菌CH03， 申请人:将其鉴定为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CH03,并于2013年11月27日送交湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为:CCTCC NO:M2013604o
[0008]随后 申请人:采用秸杆和产黄青霉CH03对土壤重金属污染进行联合修复，具体方法是:采用上述产黄青霉CH03菌株，扩增培养后得到孢子，将秸杆粉碎后与土壤混匀并向土壤中接种孢子。[0009]优选地，所述孢子是按0.1~5X IO6个/g 土壤的数量接种的。
[0010]最佳的，所述孢子是按IXlO6个/g 土壤的数量接种的。
[0011]再进一步优选地，所述秸杆为稻草秸杆。
[0012]最佳的，所述稻草秸杆是按10-30吨/公顷土壤的重量施加的。
[0013]采用生菜和小麦为目标植物，选取重金属污染土壤进行盆栽实验和大田实验检验修复效果。结果表明:本发明提供的菌株和方法能够显著降低重金属污染土壤中生长的植物体内重金属的积累，并显著提高植物产量，证明土壤修复效果明显。
[0014]本发明所提供的方法是一种重金属污染土壤的微生物-有机物料联合修复方法，属于原位修复，操作简单、成本低廉、无需停耕、修复效果好，并且能够提高土壤肥力，是一种环境友好型修复方法。
[0015]更详尽的技术方案见《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:是真菌CH03形态学鉴定:(A) PDA平板上的CH03菌落形态；(B) CH03菌体形态(400X)。
[0017]图2:盆栽试验中生菜的产量。
[0018]图3:盆栽试验中生采地上部铜、铺含量。
[0019]图4:是田间试验中小麦籽粒产量。
[0020]图5:是田间试验中小麦籽粒的铜、镉含量。
【具体实施方式】
[0021]以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述。需要说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0022]实施例1产黄青霉CH03菌株的分离鉴定
[0023]称取IOg武汉裕中生物工程有限公司提供的鸡粪堆肥于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，在28°C恒温摇床上150r/min振荡10分钟后，静置I分钟，取ImL上清液转至9mL的灭菌生理盐水中，混匀后依次进行10倍系列稀释至10_3。取100 μ L不同浓度的稀释液分别涂布在预先倒好的真菌选择培养基中(含有l-10mmol/L Cd2+和50 μ g/mL卡那霉素)，静置片刻后，将平板倒置于28°C恒温培养箱中培养5-7d。真菌培养基成分为:每升水含有 KH2PO40.2g、KH2PO40.6g、MgSO4.7H200.2g、CaSO40.lg、(NH4) 2S045g、酵母抽提物 lg、葡萄糖20g、pH5.5、琼脂2.0%。挑选单菌落至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上划线分离进一步获得纯培养物，将初筛获得的Cd抗性菌株均转至含有lOmmol/LCd2+的PDA平板上多次传代后，获得I株对Cd2+具有较高抗性水平的真菌，并将其命名为CH03。该菌株在无抗的PDA平板上28°C培养36h后可见菌丝，72h后逐渐产生青绿色的孢子，120h后孢子大量产生。此时，菌落表面会形成淡黄色的液珠，培养基中也会产生黄色的色素。菌株的菌落形态如图1-A所示，菌体形态特征见图1-B所示。真菌转录间隔区(ITS)基因序列的测定由北京三博远志生物技术有限公司完成，测序结果如SEQ ID NO:1所示。将该序列在美国国家生物技术信息中心核酸数据库上进行比对发现CH03的ITS序列与Penicillium chrysogenum的ITS序列最为接近。因此根据形态学特征与分子生物学的鉴定将CH03认定为产黄青霉CH03。
[0024]实施例2产黄青霉CH03在土壤重金属污染修复中的应用
[0025]1.产黄青霉CH03孢子扩增培养
[0026]将产黄青霉CH03接种至PDA琼脂斜面培养基，28°C恒温培养箱中培养5_7d，待已产生大量孢子后，取无菌水冲洗PDA斜面，孢子洗涤液转至无菌1.5ml的离心管中，于4°C下10000r/min,离心IOmin,弃上清,并用适量无菌水重悬孢子，并将孢子浓度调整至2 X IO9/ml，4°C存储备用。
[0027]2.稻草秸杆预处理
[0028]选取湖北省武汉市华中农业大学内未受重金属污染农田的稻草秸杆，将其暴晒除去水分后，采用小型养殖用粉碎机将其粉碎至长度l_2cm。稻草秸杆的化学特性经过测定如下(干重):有机质含量为79.7%，全氮和全磷含量分别为7.6g.kg—1和2.9g.kg—1，铜、镉含量分别为 0.08mg.kg-1 和 6.13mg.kg'
[0029]3.产黄青霉CH03和稻草秸杆修复重金属污染土壤的盆栽试验
[0030]盆栽试验用土取自湖北省黄石市下陆区庙宇恼村的受重金属污染农田，土样经自然风干、磨碎过2_筛。取 2.0kg的过筛土壤置于塑料钵中，将粉碎的稻草秸杆按照三个水平与土壤混匀(0，7.8和11.7g kg-1 ;分别标记为CK、Rl和R2三个处理)，其中一半接种产黄青霉CH03。取制备的产黄青霉CH03孢子浓度为2 X IO9个/ml的悬浮液1ml，用适量水稀释后将其与接种土样充分混匀，其中接种孢子浓度为1.0 X IO6个/g 土壤，处理标记为P，Rl+Ρ和R2+P。每一个处理随机设计四个重复。每个塑料钵中播15颗生菜种子(Lactucasativa)，待其出苗后每盆保留六株长势基本一致的生菜幼苗继续培养。在生菜的生长期内，用去离子水浇灌并保持土壤含水量为田间持水量的60%。在播种45天之后收获生菜，并立即测定生菜地上部鲜重。生菜在65°C下烘干约48h，经不锈钢粉碎机粉碎，过60目尼龙筛。生菜地上部镉、铜测定采用硝酸-高氯酸消煮，原子吸收分光光度法测定。
[0031]图2显示本实施例中不同处理对生菜产量的影响，图3显示本实施例中不同处理对生菜地上部分重金属铜镉含量的影响。结果显示，未修复处理中生菜地上部铜、镉含量分别为18.85和15.34mg.kg—1，秸杆和产黄青霉CH03联合修复将生菜中铜镉含量降低至
11.86-14.5Img.kg-1 和 8.94-10.29mg.kg' 降低幅度分别达到 13.6-21.9%和 32.9-41.7%,修复效果非常显著(图2)。而相对应的是产黄青霉CH03与稻草秸杆联合施用对生菜鲜重的增加幅度为73.8-111.2%，显著高于对应单施秸杆处理(图3)。上述试验证明产黄青霉CH03与秸杆同时施用能够显著促进植物产量，降低植物地上部分重金属含量。
[0032]4.产黄青霉CH03和稻草秸杆修复重金属污染土壤的田间试验
[0033]试验地点选在湖北省黄石市下陆区庙宇恼村一个受重金属污染农田，距大冶有色金属冶炼厂约lkm。每个试验小区3m2 (2mX 1.5m)。将稻草稻杆施入污染土壤的表层(0-20cm)，施用量为O、15.6,23.4吨/公顷(标记为CK、Rl和R2)，其中一半处理接种产黄青霉CH03孢子，接种浓度为1.0X 106/g 土壤(标记为P、R+P和R2+P)。每一个处理随机设计四个重复。各小区播种小麦，待小麦成熟后收获籽粒，籽粒去皮后称重，记录产量。籽粒在65°C下烘干约48h，经不锈钢粉碎机粉碎，过60目尼龙筛。小麦籽粒中镉、铜测定采用硝酸-高氯酸消煮，原子吸收分光光度法测定。
[0034]本实施例中采用各项处理后，重金属污染农田土壤中生长的小麦籽粒产量和籽粒中铜镉含量分别见图4和图5。未采用任何处理的对照小区小麦籽粒产量为0.66kg/小区，小麦籽粒中铜镉含量分别为3.99mg.kg-1和0.86mg.kg_l,而稻杆和产黄青霉CH03联合修复使得小麦产量增产达71.2-101.5% (图4)。同时，小麦籽粒中铜镉降低到
2.82-3.13mg.kg-1 和 0.54-0.72mg.kg-1,降低幅度分别达到 21.6-29.3% 和 16.3-37.2%(图5)。这表明采用本发明进行`农田重金属污染土壤原位修复效果显著。
【权利要求】
1.一株用于修复土壤重金属污染的产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CH03菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013604。
2.权利要求1所述的菌株在修复土壤重金属污染中的应用。
3.一种土壤重金属污染修复方法，其特征在于:采用权利要求1所述的菌株，扩增培养后得到孢子，将秸杆粉碎后与土壤混匀并向土壤中接种孢子。
4.根据权利要求3所述的土壤重金属污染修复方法，其特征在于:所述孢子是按0.1~5X IO6个/g 土壤的数量接种的。
5.根据权利要求4所述的土壤重金属污染修复方法，其特征在于:所述孢子是按I X IO6个/g 土壤的数量接种的。
6.根据权利要求3-5任何一项所述的土壤重金属污染修复方法，其特征在于:所述秸杆为稻草稻杆。
7.根据权利要求6所述的土壤重金属污染修复方法，其特征在于:所述稻草秸杆是按10-30吨/公顷土壤的重量施加的。`
【文档编号】B09C1/10GK103627642SQ201310688283
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】黄巧云, 陈雯莉, 李明, 徐兴健 申请人:华中农业大学