一种石油降解菌协同降解采油废水的方法
【专利摘要】一种石油降解菌协同降解采油废水的方法，步骤如下：（1）将纯化的单一的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h，得到种子菌液；（2）制备种子菌液的驯化培养液；（3）将制备的驯化培养液按单株菌液等体积比加入发酵培养基中，培养；（4）将发酵菌液投入曝气池中进行采油废水的处理。复合高效除油菌株可对采油废水中的烃类化合物降解率在94%以上；选用的菌种不仅各自高效的原油降解率，菌种之间还能起到协同作用，几种细菌共同对原油进行降解效率远大于单独作用简单叠加的效果。
【专利说明】一种石油降解菌协同降解采油废水的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及污水处理【技术领域】，尤其是涉及一种除油菌协同降解采油废水的方法。
【背景技术】
[0002]在油田开发初期，通常情况下钻出油井后，原始地层能量如天然水驱、弹性能量驱、溶解气驱及重力驱等可将地层原油通过油流通道举升至地面，这种以自喷开采石油的方式，称为一次采油。一次采油采出液的含水率很低，约5~10%左右。一次采油造成原始地层能量迅速递减，靠原始地层能量开采原油的方式难以维持，这时需要向地底油层注水或注气以补充能量，来实施二次采油。全国大部分油井都采用注水开发的方式进行二次采油。而开发稠油油田则需要将高压水蒸汽从油井注入地层，待注入的高压水蒸气将稠油减粘后，水蒸气的冷凝水为油层提供能量，油水混合的采出液被一起从油井采出。随着油田开发时期的延长，注水或注气的二次采油方式使采出原油含水率不断上升。华东地区各油田的采出液含水率已经超过了 85%。近些年来，我国大部分油田相继进入了采用聚合物驱和三元复合驱的三次采油阶段，该技术大面积应用于大庆油田和胜利油田。与一般油田采油废水相比，三次采油废水具有以下特点:三次采油废水中除了含有大量石油类有机物、悬浮固体颗粒、溶解性矿物质和微生物等常规污染物之外，还含有大量的碱、表面活性剂和高分子水解聚丙烯酰胺(HPAM)等驱油剂，因此三次采油废水COD高、黏度大、乳化程度高、有机污染物稳定性增强、可生物降解性降低。
[0003]随着油藏开采时期的延长和采油工艺技术的不断创新，淮安金南油田已进入三次采油阶段，出现了注水量大、采出液量大、采油废水量大、能量资源消耗高的“三大一高”现象。采油废水高达90%以上。废水粘度大，乳化油稳定，另含有溶解性矿物质、酚类化合物、细菌、悬浮固体杂质以及所投加的破乳剂、清蜡剂和降粘剂等采油助剂，具有有机成分复杂且难去除，悬浮物较多且粒径小的特点。采油废水处理后回注，不仅可以减少采油废水外排带来的严重的环境污染，极大地提高水资源的利用率，而且可以保护金南油田地下油层能量，维持油层压力并提高采油效率。但是回注水水质不合格，特别是回注水中的含油量、固体悬浮物及硫酸盐还原菌(SRB菌)超标，将会堵塞地层渗流孔道，腐蚀生产设施，严重危害注水开采油田。油田回注水处理技术的关键是去除采油废水中的油、细菌和悬浮物。以往处理含油废水主要采用的物理处理和化学方法均存在不足之处，物理法除油效果差且耗时长，化学法消耗大量混凝剂且产生二次污染。微生物法处理含油废水能够避免二次污染，净化效果好，且处理费用低廉，因而被越来越广泛的运用。能够筛选出高效降解石油菌对于油田废水的治理具有重大的意义并会带来巨大的社会效益，但是现有微生物法处理含油废水效率较低，废水处理时间较长。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:为了克服现有技术中微生物法处理含油废水效率较低、处理时间较长的不足，提供一种除油菌协同降解采油废水的方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0006]一种石油降解菌协同降解采油废水的方法，包括如下步骤:
[0007](I)将纯化的单一的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，pH7.5、35°C、200r/min摇床培养18h，得到种子菌液；
[0008](2)制备种子菌液的驯化培养液；
[0009](3)将步骤(2)制备的驯化培养液按单株菌液等体积比加入发酵培养基中，在pH7.5、35°C、250r/min条件下，培养24~48h，使发酵菌液细胞浓度≥109CFU/mL ；
[0010](4)将发酵菌液投入曝气池中进行采油废水的处理。
[0011]进一步地，步骤(2)所述的驯化培养液制备方法如下:
[0012]取种子菌液加入含有原油样品的培养基，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d，培养基中原油样品体积含量为1.5%，接种至新鲜的含有原油样品的培养基中；重复上述步骤4次，每一次转接的培养基内原有样品体积含量都以5%。的速度递增，8天后得到驯化培养液。
[0013]作为优选，所述的培养基为组成及重量份数为:KH2P040.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5 份、CaCl20. 1 份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1份、H3BO30.01份、去离子水1000份；
[0014]所述的原油样品为120#溶剂油与渣油以质量比为1:3的混合物。
[0015]作为优选，步骤(2)所述的驯化培养液制备方法如下:
[0016]取原油采出液，向其中加入对应无碳基础盐培养基和种子菌液，原油采出液与无碳基础盐培养基体积比为1:5，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d ;取步骤上述培养得到的培养液接种至相同的新鲜原油采出液和培养基内，于相同条件下培养2d，如此连续富集培养四次，Sd后得到驯化培养液。
[0017]进一步地，所述的无碳基础盐培养基组份及重量份数为:KH2P0448.28份、K2HP0450.10 份、MgSO4.7Η2013.41 份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22 份和去离子水 1000 份。
[0018]作为优选，步骤(3)中所述的驯化菌液体积为发酵培养基体积的2.5% ;所述的发酵培养基组分及重量份数为:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去离子水1000 份。
[0019]作为优选，步骤(4)中所述的发酵菌液体积是采油废水体积的2%0。
[0020]进一步地，步骤(4)中所述的曝气池中按每天进水量补充尿素22g/m3和钙镁磷肥64g/m3，曝气池通气量为 0.004m3/s, DO 约 3.5 ~4.5mg/L。
[0021]本发明的有益效果是，(I)复合高效除油菌株可对采油废水中的烃类化合物降解率在94%以上；
[0022](2)降解采油废水的最适温度为33~37 °C、pH为7.5~8.0、盐度为L 3%~
1.50%、溶解氧为3.5~4.5mg/L,且所述复合菌株在外环境温度会-7V的低温及盐度^ 40%、pH ^ 9.0的高盐碱条件下仍具有良好的降解能力。
[0023](3)本发明所选用的菌种不仅各自高效的原油降解率，菌种之间还能起到协同作用，几种细菌共同对原油进行降解效率远大于单独作用简单叠加的效果，而且极容易适应所述油田现场的生化池降解环境，并具有持续循环性。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步对本发明进行阐述，应理解，引用实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0025]从金南油田采集污染土样及原油采出液，将污染土样及原油采出液中原油降解菌经驯化、分离和纯化即得到本发明所使用的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌。具体步骤如下:
[0026]1、取IOg油污土壤样品，接入装有250ml培养基(含有原油样品为63 μ L)的500mL三角瓶中，PH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d，取富集液5mL接种至相同新鲜培养基内，此时原油样品增至70 μ L，于相同条件下培养2d，如此连续富集培养四次，且每一次转接原油样品都以7μ L的递增速度增加，8d后得到驯化培养液；
[0027]或者取所述原油采出液250ml装入500ml三角瓶中，加入对应无碳基础盐，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d，取富集液5ml接种至相同新鲜培养基内，于相同条件下培养2d，如此连续富集培养四次，8d后得到驯化培养液。
[0028]2、在无菌条件下，分别取Iml上述得到的驯化培养液，用无菌水按倍数稀释，取10_4、10_5、10_6三个梯度备用，吸取0.5mL菌悬液注入牛肉膏蛋白胨平板培养基内，用涂布棒均匀涂匀，每个梯度均做4只平行样，待培养基表面液体被吸收后倒置放于恒温培养箱内33°C条件下培养I~2d。
[0029]3、对所述平板每隔12小时观察一次，并对平板内菌落生长数量和形态特征情况做好记录。找出不同形态菌落，用接种环挑取单个菌落划线接种至新鲜固体牛肉膏蛋白胨平板培养基内，避免带入原来的基质，不同的菌株每株重复4个平行样，继续放于恒温培养箱内33°C培养，如此连续划线分离3次，得到单一典型菌落数株。
[0030]4、经生理生化实验、16SrDNA的序列分析以及NCBI信息数据库中的Blast比对分析鉴定出铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌即为本发明所采用几种除油囷。
[0031]实施例1
[0032](I)将纯化的单一的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，pH7.5、35°C、200r/min摇床培养18h，得到种子菌液；
[0033](2)制备富集菌液的驯化培养液，方法如下:
[0034]取种子菌液加入含有原油样品的培养基，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d，培养基中原油样品体积含量为1.5%，接种至新鲜的含有原油样品的培养基中；重复上述步骤4次，每一次转接的培养基内原油样品体积含量都以5%。的速度递增，8天后得到驯化培养液。
[0035]其中所述的培养基为组成及重量份数为:KH2P040.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5 份、CaCl20.1 份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1 份、H3BO30.01份、去离子水1000份；所述的原油样品为120#溶剂油与渣油以质量比为1:3的
混合物。
[0036](3)将步骤(2)制备的驯化培养液加入发酵培养基中，其中驯化培养液体积为发酵培养基体积的2.5%，在pH7.5、35°C、250r/min条件下，培养24~48h，使发酵菌液细胞浓度^ 109CFU/mL ;所述的发酵培养基组分及重量份数为:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去离子水1000份；
[0037](4)将发酵菌液投入曝气池中进行采油废水的处理，发酵菌液体积是采油废水体积的2%。，曝气池中按每天进水量补充尿素22g/m3和钙镁磷肥64g/m3，曝气池通气量为
0.004m3/s, DO 约 3.5mg/L。
[0038]本实施例中加入曝气池中的采油废水含油量约90.lmg/L，控制曝气池内温度为33~370C、pH为7.5~8.0、盐度为1.3%~1.50%,定期检测，结果如下:降解24h后检测浓度为11.62mg/L,降解率达到87.1%，降解48h后检测浓度为4.86mg/L,降解率达到94.6%，出水指标达到SY/T5329-94中Al级标准，满足低渗透油田注入水水质要求。
[0039]实施例2
[0040](I)将纯化的单一的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，pH7.5、35°C、200r/min摇床培养18h，得到种子菌液；
[0041](2)制备富集菌液的驯化培养液，方法如下:
[0042]取原油采出液，向其中加入对应无碳基础盐培养基和种子菌液，原油采出液与无碳基础盐培养基体积比为1:5，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d ;取上述培养得到的培养液接种至相同的新鲜原油采出液和培养基内，于相同条件下培养2d，如此连续富集培养四次，8d后得到驯化培养 液。
[0043]所述的无机基础盐培养基组份及重量份数为:KH2P0448.28份、K2HP0450.10份、MgSO4.7Η2013.41 份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22 份和去离子水 1000 份。
[0044](3)将步骤(2)制备的驯化培养液加入发酵培养基中，其中驯化培养液体积为发酵培养基体积的2.5%，在pH7.5、35°C、250r/min条件下，培养24~48h，使发酵菌液细胞浓度^ 109CFU/mL ;所述的发酵培养基组分及重量份数为:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去离子水1000份；
[0045](4)将发酵菌液投入曝气池中进行采油废水的处理，发酵菌液体积是采油废水体积的2%。，曝气池中按每天进水量补充尿素22g/m3和钙镁磷肥64g/m3，曝气池通气量为
0.004m3/s, DO 约 4.5mg/L。
[0046]本实施例中加入曝气池中的采油废水含油量为91.450mg/L，控制曝气池内温度为33~370C、pH为7.5~8.0、盐度为1.3%~1.50%,定期检测，结果如下:降解24h后检测浓度为9.209mg/L,降解率达到89.93%，降解48h后检测浓度为4.48mg/L,降解率达到95.1%，出水指标达到SY/T5329-94中Al级标准，满足低渗透油田注入水水质要求。
[0047]当外环境温度3 _7°C的低温:12月至来年一月份，淮安金湖的室外温度为O度左右，集装箱内的生化池没有加热保温措施，生化池的进水温度为20°C左右，生化池内水温在微生物的生命活动作用下约28°C，降解48h，生化池内原油降解率及COD降解率均高达85%以上。
[0048]盐度=40%、pH ^ 9.0的高盐碱条件:在实验室探究该复合菌群降解采油废水的最优无机盐配比的初期，发现在N源兰5000mg/L, P源兰4000mg/L, pH约9.0左右时，降解48h，原油降解率仍可保持在75%左右，此时测水中盐度=40%，且水中有铵盐等的结晶。[0049]对比实施例1
[0050]按照实施例2的方法，分别对铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌进行驯化，最后将驯化后的四种菌先后加入同一采油废水中，加入另一种菌前使前一种菌失活(加热等)，每种菌均分都为24h或48h。经检测:每种菌都作用24h时，最终含油量由91.450mg/L将低到41.188mg/L,降解率只有55.12% ;每种菌都作用48h时，最终含油量由91.450mg/L将低到28.8lmg/L,降解率只有68.5%。
[0051]对比实施例2
[0052]按照实施例2的方法，所使用的细菌为枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌，其他条件不变。经检测:降解24h时，最终含油量由91.450mg/L将低到36.0 lmg/L,降解率只有60.62% ；降解48h时，最终含油量由91.450mg/L将低到22.04mg/L,降解率只有75.9%。
[0053]由以上结果可以看出，本发明采用四种菌同时对采油废水进行处理效果远大于四种菌单独对采油废水进行处理的效果，而且若去掉其中任何一种细菌其降解效果都远不如本发明，说明四种菌在降解采油废水时存在协同作用。
[0054]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
【权利要求】
1.一种石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将纯化的单一的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、门多萨假单胞菌和鲍氏不动杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，pH7.5、35°C、200r/min摇床培养18h，得到种子菌液； (2)制备种子菌液的驯化培养液； (3 )将步骤(2 )制备的驯化培养液按等体积比加入发酵培养基中，在P H 7.5、3 5 °C、.250r/min条件下，培养24~48h，使发酵菌液细胞浓度≥109CFU/mL ； (4)将发酵菌液投入曝气池中进行采油废水的处理。
2.根据权利要求1所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:步骤(2)所述的驯化培养液制备方法如下: 取种子菌液加入含有原油样品的培养基，PH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d，培养基中原油样品体积含量为1.5%，接种至新鲜的含有原油样品的培养基中；重复上述步骤4次，每一次转接的培养基内原油样品体积含量都以5%。的速度递增，8天后得到驯化培养液。
3.根据权利要求2所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:所述的培养基为组成及重量份数为=KH2PO40.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5份、CaCl20.1份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1 份、H3BO30.01 份和去离子水.1000 份； 所述的原油样品为 120#溶剂油与渣油以质量比为1:3的混合物。
4.根据权利要求1所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:步骤(2)所述的驯化培养液制备方法如下: 取原油采出液，向其中加入无碳基础盐培养基和种子菌液，原油采出液与无碳基础盐培养基体积比为1:5，pH7.5、33°C、150r/min摇床培养2d ;取上述培养得到的培养液接种至相同的新鲜原油采出液和无碳基础盐配制成的培养基内，于相同条件下培养2d，如此连续富集培养四次，8d后得到驯化培养液。
5.根据权利要求4所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:所述的无碳基础盐培养基组份及重量份数为:KH2P0448.28份、K2HP0450.10份、MgSO4.7H2013.41份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22份和去离子水1000份。
6.根据权利要求1所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的驯化菌液体积为发酵培养基体积的2.5% ;所述的发酵培养基组分及重量份数为:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份和去离子水1000份。
7.根据权利要求1所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的发酵菌液体积是采油废水体积的2%0。
8.根据权利要求1所述的石油降解菌协同降解采油废水的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的曝气池中按每天进水量补充尿素22g/m3和钙镁磷肥64g/m3，曝气池通气量为.0.004m3/s, DO 约 3.5 ~4.5mg/L。
【文档编号】C02F103/10GK103803714SQ201410069428
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】冯俊生, 杨怀成, 常杰云, 刘兆跃, 秦学成, 陈皓, 程汉东 申请人:常州大学