重金属整治系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供了通过细菌螯合重金属的系统。该细菌表达ppk、mt和/或β-半乳糖苷酶(lacZ)基因且可以耐受至少25μM汞、1,000μM锌、250μM镉和3,000μM?Pb。该系统允许容易确定液体中重金属污染物的存在和容易收集已经螯合大量重金属的细菌。还提供了一种在细菌中基因表达的系统，该系统包括噬菌体和质体基因表达元件并递送特别高水平的蛋白表达和重金属抗性。
【专利说明】重金属整治系统
[0001]本申请是申请日为2010年8月20日，申请号为201080045997.2，发明名称为“重
金属整治系统”的申请的分案申请。
[0002]本发明部分地用根据由美国国家科学基金会授予的美国政府拨款NSF CBET-0755649开发的材料来进行。政府可以具有本发明的某些权益。
[0003]发明背景
[0004]本专利申请要求2009年8月20日提交的美国临时专利申请第61/235，624号的优先权。
发明领域
[0005]本发明涉及用于产生耐受包括汞、铅、锌和镉的重金属且能够螯合和累积这些重金属的基因修饰细菌以用于生物整治(bioremediation)受污染液体和固体的分子生物学领域。
[0006]背景描述
[0007]具有相对高的密度的金属化学元素常常被称为重金属。重金属甚至在低浓度下是有毒的。有毒的重金属包括汞、镉、铅、锌和银。在重金属当中，汞、铅和镉被认为是特别有
毒的。
[0008]汞已经作为工业过程和天然过程的副产物被引入环境中且可以高的浓度累积在土壤和沉积物中。Patra, M.和 Sharma A.，Bot.Rev.66:379-422 (2000)。在美国，燃煤发电厂每年放出约48吨的汞，而在亚洲和非洲，燃煤发电厂每年释放多于1500吨。2009年2月8日检索的Clean Air Mercury Rule (清洁空气萊规则).美国环境保护局(“EPA”) 2009，www.epa.gov/air/mercuryrule/basic, htm。全世界每年来自所有源的萊排放估计在4800-8300吨。2009 年 2 月 8 日检索的 Mercury Human Exposure (萊人类暴露),EPA2008, www.usepa.gov/mercury/exposure, htm。
[0009]汞化合物是神经毒素和电子在细胞中运输的强力阻断剂。所有的汞形式是有毒的并对人类健康和对环境带来风险。开发成本有效的和高效的整治系统是极其重要的。
[0010]当前从环境清洁汞的整治策略包括冲洗、化学还原/氧化、挖掘、回收和厂外处置。这些方法是成本高的、环境破坏性的和无效的。Karenlampi, S.等人，Environ.Po I lut.1007:225-231 (2000)。其他方法例如玻璃化和混凝土覆盖使得该地方不能用且对于整治大面积是不切实际的。用当前技术从环境整治一磅汞的成本是数千美元。Hussein, H.等人,Env.Sc1.Technol.41:8439-8446 (2007)。
[0011]与汞一样，其他重金属例如铅和镉带来严重的环境威胁且必须被整治。铅是可以累积在软组织和骨中的强力的神经毒素。因为其毒性，铅已经被EPA和其他机构禁止进入消费者产品中，包括油漆、汽油、水管、玩具以及其他的。EPA将饮用水中的铅含量限制为小于0.015ppm。铅在2007综合环境反应、补偿和责任法(Comprehensive EnvironmentalResponse Compensation, and Liability Act, CERCLA)危险物质的优先级表中排在第二。
[0012]当前在多个消费者应用中，尤其在电池中广泛使用镉已经增加了该重金属的环境污染。镉已经被表明是高毒性的，造成严重的中毒、骨退化、细胞酶抑制和细胞膜破坏。如在汞的情况一样，当前的整治或捕获铅和镉的方法依赖于使用物理化学方法，包括使用离子交换树脂、沉淀和提取、埋藏、原地覆盖和厂外处置。Kim，S.等人.J.Biosc1.Bioeng.99:109-114(2005)。这些方法是成本高的和/或对正被主张保护的环境是破坏性的。需要新的技术来促进被污染环境的整治。
[0013]使用有机体来整治被污染环境的生物整治可以提供潜在低的成本和环境友好的方法。例如，细菌可以将某些有毒化合物分解为它们的无毒代谢物。然而，重金属元素例如汞、镉和铅不能被解毒为无毒代谢物。
[0014]通过挥发汞的汞生物整治方法依赖于mer操纵子的表达，mer操纵子管理Hg2+的运输和还原。mer操纵子基因之一，merA，编码汞离子还原酶，该酶是催化Hg2+至Hg°的转化的酶。Hgci是低挥发性的、低反应性和低毒性形式的萊。Jackson, W.J.和Summers, A.0.，J.Bacteriol.151:962-970 (1982)。然而，在挥发过程中，元素汞释放到环境中，在环境中它可以被转化为毒性更大的形式。挥发方法的另一个缺点是其不适合于水处理，因为细菌将挥发的元素汞释放到正被整治的相同的水中。
[0015]细菌并不具有在允许汞在细胞内部累积的同时提供对汞的高抗性的内源性机制。基因工程已经用于将来自其他有机体的基因与增加汞抗性和累积的目标结合。已知为螯合剂(chelator)或螯合剂(sequestration agent)的分子已经被提出作为合适的重金属清除剂，其可以在有机体内被表达，
[0016]目标是从土壤或水回收重金属。
[0017]细菌系统中的金属硫蛋白和多磷酸盐(polyphosphate)已经被包含在一些重金属的解毒中。在大肠杆菌中被表达的这两种物质可以螯合汞、镉和铅，且因此保护细菌免于某些水平的这些重金属元素。然而，至今结果是令人气馁的。细菌不能够有效地螯合这些元素且并不经受得住高水平的这些重金属。这些结果归因于螯合剂蛋白剂的稳定性的察觉到的缺乏，产生具有对重金属弱的耐受性的细菌系统。
[0018]金属硫蛋白被哺乳动物、植物和真菌中存在的mt基因编码。Sousa，C.等人，J.Bacteriol.180:2280-2284(1998)。然而，已经表明金属硫蛋白(MT)当在细菌中被表达时是不稳定的。Berka, T.等人，J.Bacteriol.170:21-26 (1988)。因为发现MT蛋白当在细菌中被表达时是不稳定的，所以mt基因已经与稳定剂例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合，产生 GST-MT 融合。Chen, S.和 Wilson D.B.，Appl.Env.Microbiol.63:2442-2445(1997)。各种GST-MT构建体包括酿酒酵母(GST-YMT)、人类(GST-HMT)和豌豆(pea) (GST-PMT)。含有GST-HMT的细胞没有被表明为产生可溶的MT蛋白，
[0019]且该构建体并不赋予对汞的任何抗性。表达YMT和PMT构建体的细胞已经被表明耐受具有至多5μ M汞的液体，至多5μ M汞是几乎无毒的水平。更重要地，表达这两个构建体的细胞看来并不累积汞或保护细胞免于汞，除非细胞还工程化为表达mer操纵子的汞转运基因。也已经进行各种不成功的尝试来工程化靶向细菌周质的粗糙脉孢菌(N.crassa)的mt基因和其他人类mt基因的多个拷贝。然而，这些蛋白的不稳定性和不溶性已经不断阻止它们用作有效的整治剂。Valls，M.和Lorenzo, V.，FEMS Micr0.Reviews, 26:327-338 (2002)。虽然这些融合蛋白赋予对于汞的某些有限的耐受性，但该效应并不能明确地归因于MT蛋白，因为还已知GST，即融合配偶体，结合重金属例如萊。Chen, S.和 Wilson D.B., Appl.Environ.Microbiol.63: 2442-2445 (1997) ；Deng, X.和 Wi Ison D.B.，Appl.Microbiol.Biotechnol.56: 276-279 (2001) ；Custodio, Η.M.等人,Arch.Environ.0ccup.Health60:17-23 (2005)。
[0020]因此，已经推断出，用金属硫蛋白基因修饰的转基因细菌在细胞中没有提供足够的抗性。Beattie, J.H.等人，Toxicol.Lett.157:69-78 (2005) ；0dawara, F.等人，J.Biochem.118:1131-1137(1995) ；Park, J.D.等人，Toxicology.163:93-100 (2001)。对该失败给出的解释包括小的金属硫蛋白肽被细胞蛋白酶快速降解、低的蛋白收率和可能的对细胞溶质中的氧化还原路径的干扰。Sousa, C.等人，J.Bacteriol.180:2280-2284(1998)；Yang, F.等人,Protein Expr.Purif.53:186-194 (2007)。
[0021]并且，用金属硫蛋白基因工程化细菌以增强对锌的抗性的尝试已经证明是无效的。Odawara, F.等人，同上。
[0022]在细菌中表达的金属硫蛋白融合基因已经显示仅仅提供对镉毒性的临界耐受性，最多 50mg/ 升(约 150 μ Μ)。Odawara, F.等人，同前；Keasling, J.D.,和 Hupf, G.A.AppliedEnv.Microbiol.62:743-746 (1996)。这些研究并不表明细菌可以在高的镉浓度中生长良好，这是因为在50mg/L的镉之后，转基因细胞与在没有镉的培养基(media)中生长的转基因细胞相比生长显著降低。
[0023]其他人关注于工程化多磷酸盐激酶(polyphosphate kinase, “ppk”)基因以在细菌中表达。ppk酶负责已知吸收(螯合)汞的正磷酸盐的长线型聚合物的合成。与mt相似，仅ppk融 构建体已被提出和利用。例如，产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes) ppk基因已经与假单胞菌衍生的merT和merP基因融合。merT和merP基因促进汞的内在化。融合意味着提高稳定性，且选择融合组分部分是由于相信汞内在化将被限制，这还将限制表达PPk基因的细菌的生物整治效果。Pan-Hou，H.等人，Biol.Pharm.Bull.24:1423-1426(2001) ；Pan-Hou, H.等人，FEMSMicrobiol.Lett.10325:159-164(2002) ο表达这些构建体的细菌能够从溶液累积高达16 μ M汞和24μΜ的有机汞化合物。在元素汞的存在下的细菌生长在16 μ M汞时被完全破坏。当将表达构建体的工程化的细菌放在海藻酸盐珠上时，已经显示出增加的对汞的抗性。然而，汞整治失效，且细菌在40-80 μ M汞的存在下丧失生活力。Kyono，Μ.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.62:274-278(2003)。
[0024]植物整治和真菌整治(非工程化的有机体)已经成为试图通过使铅累积在根或叶中来生物整治铅的方法。Huang, L.Z.等人，Biodegradation20:651-660 (2009) ；Vimala, R.和Das, N., J., Hazard.Mat.168:376-382 (2009)。现今没有提出对于铅的有效的细菌生物整治技术。
[0025]由上述系统实现的工程化的细菌对重金属的低的抗性水平排除了它们作为有效的生物整治系统的应用。甚至在具有低的汞浓度的水中，这些系统将不是有效的，因为汞将以高于由系统耐受的浓度的浓度累积在细胞内。
[0026]发明概述
[0027]在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于表达细菌中的重金属螯合基因的载体，其包括以下功能连接的元件:
[0028]载体骨架，[0029]转录组成型启动子序列，其源自质体16Srrn基因，
[0030]翻译增强子元件序列，其源自噬菌体T7基因10，
[0031]螯合剂的编码序列，
[0032]其中载体是在细菌中。在一个优选的实施方式中，载体还包括3’UTR不依赖P因子的翻译终止子。优选地，3’ UTR是质体rpsl6转录终止子或大肠杆菌rrnB转录终止子。更优选地，3’ UTR是质体rpsl6转录终止子。
[0033]在另一个实施方式中，螯合剂由mt、ppk或β _半乳糖苷酶(IacZ)基因编码,且基因在细菌中被表达。根据一个实施方式，螯合剂是由PPk合成的多磷酸盐，且细菌抵抗高达约100 μ M汞、至少约1000 μ M锌、至少约250 μ M镉或至少约3，000 μ M铅。
[0034]在又一个实施方式中，mt基因是哺乳动物金属硫蛋白。更优选地，螯合剂由小鼠mtl基因序列编码，且细菌抵抗高达约160 μ M汞、至少250 μ M镉、1,000 μ M锌或3，000 μ M铅。
[0035]在还另一个实施方式中，螯合剂由半乳糖苷酶(IacZ)基因序列编码，且细菌抵抗高达约140 μ M汞和至少250 μ M镉、1，000 μ M锌或3，000 μ M铅。
[0036]在还另外的另一个实施方式中，载体骨架是质粒骨架。
[0037]在另一个方面，本发明提供了一种包括转基因螯合剂的细菌，其中细菌抵抗在至少约25 μ M和至少约100 μ M之间的Hg。在一个优选的实施方式中，螯合剂基因从强启动子转录，并侧翼为选定的5’UTR和任选的选定的3’UTR，例如至少在4，000和8，500拷贝之间的稳定的转录物每ng总mRNA对应于螯合剂基因，更优选地在6，000和7，500拷贝之间的稳定的转录物每ng总mRNA对应于螯合剂基因。在还更优选的实施方式中，螯合剂基因从源自质体16S rrn基因的转录组成型启动子序列转录，螯合剂基因侧翼为源自噬菌体T7基因10的5’UTR翻译增强子元件序列。仍还更优选地，螯合剂基因从源自质体16Srrn基因的转录组成型启动子序列转录，且侧翼为源自噬菌体T7基因10的5’ UTR转录增强子元件序列和质体rpsl6基因3’ UTR不依赖P因子的翻译终止子序列。
[0038]在一个优选的实施方式中，螯合剂编码序列对应于mtl基因，且细菌抵抗高达约160 μ M汞或抵抗至少约250 μ M镉、1，000 μ M锌或3，000 μ M铅。在另一个优选的实施方式中，螯合剂编码序列对应于β -gal ( β -半乳糖苷酶/lacZ)基因，且细菌抵抗高达约140 μ M汞或抵抗至少约250 μ M镉、1，000 μ M锌或3，000 μ M铅。在还另一个优选的实施方式中，螯合剂编码序列对应于β-gal基因，且细菌抵抗高达约140 μ M汞或抵抗至少约1，000 μ M锌或3，000 μ M铅。在仍还另一个优选的实施方式中，螯合剂编码序列对应于ppk基因，且其中细菌抵抗约250 μ M镉、1，000 μ M锌或3，000 μ M铅。
[0039]在另外的实施方式中，细菌包括功能上连接于转基因表达系统的mt、ppk或β -gal基因序列，所述系统还包括:
[0040] 转录组成型启动子,其源自质体16S rrn基因，
[0041]翻译增强子元件，其源自噬菌体T7基因10，和
[0042]不依赖P因子的转录终止子序列。
[0043]在还另外的实施方式中，细菌当在包含汞、镉、锌或铅的液体环境中时，累积汞、铺、锋或铅且在萊的存在下在着色上变深。
[0044]在还又一实施方式中，细菌当在包含汞、镉、锌或铅的液体环境中时，累积汞、镉、锌或铅，且细菌形成聚集体和沉淀物。在不同的还又一实施方式中，细菌当在包含汞的液体环境中时，累积汞，且细菌形成聚集体和沉淀物。
[0045]根据一个实施方式，细菌是大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、蓝细菌(Cyanobacteria)或芽抱杆菌(Bacillus)。
[0046]在不同的实施方式中，当包括mt、ppk或β -gal基因序列的细菌在生物过滤器上生长时，其可以从受污染液体除去重金属。且其被便利地处理，例如从液体除去。
[0047]在另一个不同的实施方式中，半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由于重金属的存在而与重金属的浓度按比例地降低。
[0048]在另一个方面，本发明提供了一种用于从液体清除汞污染的方法，该方法包括: [0049]将表达mt、ppk或β -半乳糖苷酶基因的细菌培养物加入所述液体中，其中所述细菌培养物中的细菌抵抗在约25 μ M Hg和至少约100 μ M Hg之间的Hg，和
[0050]在足以允许所述汞的螯合的一段时间之后从所述液体除去所述细菌。根据方法的一个实施方式，在所述细菌形成块(clump)之后除去所述细菌。根据一个优选的实施方式，细菌通过筛分、抽吸或从过滤器除去细菌来除去。
[0051]根据另一个方面，提供了一种监测汞水平的方法，该方法包括将表达半乳糖苷酶基因的细菌培养物加入液体中，其中细菌培养物中的细菌抵抗在约25 μ M Hg和至少约140 μ M Hg之间的Hg，和
[0052]将X-gal加入样品中和测试样品以确定细菌代谢5_漠_4_氣_3_ Π引噪基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)以产生蓝色着色的能力以便确定萊在样品中的浓度。
[0053]在另一个实施方式中，本发明提供了一种从液体清除汞污染的方法，该方法包括:
[0054]将所述液体放在包括固体基质的装置中，其中所述基质还包括β_半乳糖苷酶，而没有细胞载体；和
[0055]当所述液体被从所述固体基质洗脱时，收集所述液体。
[0056]在另一个方面，本发明提供了一种用于检测重金属污染的试剂盒，该试剂盒包括:
[0057]流体容器，
[0058]指示剂条上的表达β_半乳糖苷酶(β-galactosidase)或β_半乳糖苷酶(β -galactosidase enzyme)的细菌培养物，
[0059]X-gal，和
[0060]显示着色的图表，所述着色对应于与指示剂条上的表达半乳糖苷酶或半乳糖苷酶的细菌培养物接触的液体中的Hg的各种浓度。根据一个实施方式，试剂盒还包括比色增强剂(colorimetric enhancer)。
[0061]在又一个方面，本发明提供了一种用于检测重金属污染的试剂盒，该试剂盒包括:
[0062]流体容器，
[0063]表达β -半乳糖苷酶、ppk或mtl的细菌培养物,和
[0064]显示深的着色的指示剂条，所述深的着色对应于表达半乳糖苷酶、ppk或mtl的所述细菌培养物当在液体中各种浓度的所述重金属的存在下生长时的着色。
[0065]附图简述
[0066]图1阐明细菌在所指示的浓度的汞的存在下生长的能力。使培养物在汞中生长16小时，之后它们的生长作为培养物的光密度(0D_)的函数被测量。图1A表示未被转化的细菌。图1B表示工程化的细菌培养物，包括表达β-gal蛋白的所指示的质粒。图1C表示工程化的细菌培养物，包括表达mtl蛋白的所指示的质粒。图1D表示工程化的细菌培养物，包括表达ppk酶的所指示的质粒。
[0067]图2阐明细菌在所指示的浓度的汞的存在下生长的能力。使培养物在汞中生长120小时，且它们的生长作为培养物的光密度(OD6J的函数被测量。图2A表示未被转化的细菌。图2B表示表达β-gal蛋白的工程化的细菌培养物。图2C表示表达mtl蛋白的工程化的细菌培养物。图2D表示表达ppk酶的工程化的细菌培养物。
[0068]图3阐明根据本发明制备的构建体的转录功效。从螯合剂的mRNA制备cDNA。mRNA拷贝数被计算并被归一化为总的所提取的RNA。图3A比较在未被转化的细菌(“wt”)中和在用P16s-gl0-mtl-3’ UTR遗传构建体转化的细菌中从mRNA转录物体外产生的cDNA。图3B比较在wt细菌中和在用P16s-glO-ppk-3’UTR遗传构建体转化的细菌中从mRNA转录物体外产生的cDNA。
[0069]图4是根据本发明的一个方面的用于受污染液体的生物整治的设备的图示。
[0070]图5是细菌增强表达盒的示意图。图中涉及的限制性内切酶位点仅表示本发明的一个实施方式。Prrn是指转录启动子。在优选的实施方式中，启动子是质体16S rrn启动子。5’UTR(非翻译 区)表示翻译增强子元件。优选的5’UTR是来自噬菌体T7的基因
10。转基因优选地编码螯合剂。在优选的实施方式中，螯合剂由lacZ、mtl或ppk基因编码。3’UTR是指转录终止子。在优选的实施方式中，转录终止子是质体rpsl6终止子或大肠杆菌rrnB终止子。在特别优选的实施方式中，转录终止子是rpsl6终止子。
[0071]图6是表示在120 μ M汞中生长的表达IacZ和mtl基因的细菌的聚集的图。图6的图是所观察的聚集的Polaroid照片的示意图。在工程化为表达IacZ基因(图6A)和mtl基因(图6B)的细菌的培养物中观察到沉淀。
[0072]图7阐明工程化为表达螯合剂的细菌整治汞污染的培养基，即使培养基对不表达螯合剂的细菌(“wt”)无害的能力。图7A示出wt细菌在没有汞的培养基；包含120μΜ汞的培养基；和经处理的培养基中持续24小时的生长。经处理的培养基最初包含120 μ M汞并通过暴露于根据本发明工程化为表达IacZ基因的细菌120小时，随后除去细菌细胞来处理。图7Β示出wt细菌在没有汞的培养基；包含120 μ M汞的培养基；和经处理的培养基中持续24小时的生长。经处理的培养基最初包含120 μ M汞并通过暴露于根据本发明工程化为表达mtl基因的细菌120小时，随后除去细菌细胞来处理。
[0073]图8阐明根据本发明工程化为表达IacZ基因的细菌确定液体样品的重金属污染程度的用途。为了更易于目测，图被选择为呈现比色皿的Polaroid照片中捕获的数据。(着色以其强度代表比色皿的Polaroid照片中观察到的着色。)比色皿A在包含0μ M汞的培养基中生长；Β在包含5 μ M汞的培养基中生长；C在包含10 μ M汞的培养基中生长；且D在包含20 μ M汞的培养基中生长。板(panel) I示出在所指示的水平的汞的存在下生长16小时之后的0D_测量结果。板II是板I中的测量结果的图示。板III是如在板II的相应的比色皿中的细菌，但比色皿中加入100 μ g/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖苷(X-gal)底物每ml培养基。细菌与暴露于汞的水平成反比地丧失其裂解X-gal和产生典型蓝色的能力。
[0074]图9证明了根据本发明的表达β-gal的细菌中β_半乳糖苷酶活性的减小。图9Α是在所指示的量的汞和100μ g/ml X-gal的存在下生长的细菌的照片。每一个培养物小瓶下面的有色棒接近小瓶中的内容物的颜色并意图用作与检测试剂盒一起供应的颜色代码。图9B描绘了用于容纳/培养培养物的管，包括表达β -gal的细菌、X-gal和被污染流体。容器附有或伴有(attached thereto or comes accompanied by)指不细菌培养物在所指示的浓度的汞的存在下的预期的颜色强度的颜色图表。图9C是图9B的示意图。
[0075]图10 示出表明包括 pBSK-P16S-glO-lacZ_3’ UTR( “lacZ”)、pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR( “mtl”)和 pBSK-P16S-glO-ppk_3’ UTR( “ppk”)表达盒的细菌细胞系耐受包含所指示的浓度的镉、铅和锌的培养基并在该培养基中生长的能力的细菌生物测定。未被转化的大肠杆菌菌株JM109用作对照。在补充有锌、镉和铅的LB营养培养基中生长24h之后测量细菌培养物吸光度(0D600nm)。图10A示出在1，000 μ M的ZnC12中生长的细菌细胞系。图10B示出在250 μ M CdCl2中生长的细菌系。图10C示出在3，000 μ M的乙酸铅Pb (C2H3O2)2.3Η20中生长的细菌克隆。
[0076]图11示出通过表达转基因的基因的细菌螯合汞。根据本发明的被IacZ构建体转化的细菌在37°C在包含120 μ M汞的培养基中生长120h。细菌通过离心、洗涤和再悬浮在与初始培养物的体积相同的体积的培养基中来除去。处理再悬浮的细胞(“LacZ细菌”)以释放任何汞并通过原子吸收光谱法来分析。经处理的培养基的汞浓度和表达IacZ基因的细菌的汞浓度从光谱测定法结果来计算。
[0077]在这些图中所描绘的实验被执行多次。在显示棒偏差(bar deviation)的图(图1、图2、图3、图7、图10和图11)中所描绘的实验中，实验被执行至少三份，且棒示出在结果内的一个标准偏差。
[0078]除非另外指出，否则在这些图中所描绘的其中细菌生长被测量的实验中，每一种培养物的起始接种物(“种子”)是0.01OD6c?的起始培养物的相等大小的等分部分。
[0079]在测试IacZ构建体的有效性的某些实验中，细菌培养物(未被转化的和被转化的)包含200mg/ml IPTG0然而，应注意，在IacZ基因从组成型启动子转录的实验中，不需要由IPTG诱导表达。
[0080]详细描述
[0081]本发明提供了安全的、高效的和成本有效的使用螯合剂(chelation agent)/螯合剂(sequestration agent)的重金属整治方法。优选的实施方式集中在表达螯合剂的细菌细胞的使用上。
[0082]三种示例性螯合剂已经在细菌中被表达，使得细菌抵抗高水平的重金属且尤其是抵抗铅、镉、锌和汞:金属硫蛋白(mt)、多磷酸盐激酶(ppk)和β_半乳糖苷酶蛋白。惊人地，现在已经表明螯合剂基因可以产生高水平的表达和宿主细胞对重金属的抗性的方式在细菌中被表达。根据另一个优选的实施方式，采用基于非细胞的螯合剂。
[0083]在基于细菌细胞的系统中，螯合剂蛋白被表达，而不一定是融合蛋白的一部分。不需要mer基因的同时表达。对于表达这些基因的细菌，不需要海藻酸盐或相似化合物的支撑床。工程化的细胞经得起高水平的重金属。这些惊人的观察已经允许开发细胞的和基于蛋白的生物整治的有效方法，如本申请中所描述的。
[0084]在本发明的一个实施方式中，提供载体以在宿主细菌细胞中引入和表达基因。载体是能够在宿主细菌细胞中复制的核酸结构。载体骨架可以包括转化标记物的基因，以指示载体对细菌细胞的转化。转化标记物可以是用于从不含载体的正常细胞区分和选择存在载体的细胞的选择性标记物基因。这样的标记物是本领域技术人员熟知的。通常使用的选择性标记物包括赋予对特定的抗生素例如氨苄青霉素的抗性的基因。一些载体骨架还可以包括仅仅指示哪些细胞被载体转化的标记物基因。转化标记物是本领域技术人员熟知的。通常使用的指示剂标记物基因是编码β_半乳糖苷酶的IacZ基因的序列。其他通常使用的转化标记物包括各种萤光素酶基因和GFP。被转化的细菌整治其在上面生长的液体或固体表面。可选择地，固体表面通过暴露于液体而首先被浸泡/浙滤重金属，且然后根据本发明工程化的有机体从液体除去重金属。
[0085]载体的一个组分是包括多个限制性内切酶识别序列的克隆位点，其中这些标记物以及另外的所需的核酸序列可以被引入载体中，且通过转化被引入细胞中。
[0086]本发明的优选的载体是质粒。优选的质粒是工程化为允许表达转基因的遗传序列的质粒。存在大量的已知的和被表征的载体。参见，例如Stanford数据库:http://genome-www.Stanford.edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/Plasmid.html,上次访问在2009年6月30日。允许相对容易地引入表达盒的质粒的实例是本领域熟知的和商
业上可得到的。优选的载体是pBlueSeript?
[0087]在一个特定的实施方式中，提供了用于在细菌细胞中表达螯合剂的质粒。质粒包括具有整合剂基因和允许质粒在细菌细胞中表达整合剂基因至闻水平的其他兀件的表达盒。其他元件(“基因表达元件”)包括启动子序列、翻译增强子序列和转录终止序列，全部以本领域技术人员充分理解的方式在功能上连接。应注意，尽管期望由于它们强烈增强表达的能力而选择的全部三个表达元件的存在，但是螯合剂基因甚至在缺乏转录终止序列时被充分地表达至本文描述的水平。
[0088]调整特征的任何有效的组合可能产生令人满意地高的和稳定的表达系统。本发明优选地用强的转录启动子来实施。预期质粒可以包括不同类型的启动子，例如组成型启动子、诱导型启动子、细胞特异性的或组织特异性的启动子。同样地，可能的是，以特定组合的其他有效的转录增强子和终止子可以产生令人满意地高的和稳定的表达。
[0089]在一个优选的实施方式中，利用源自质体16S rrn基因序列的组成型启动子。Sriraman, P.等人，Plant Physiol.117:1495-1499 (1998)和 Yukawa, Μ.等人，PlantMolecular Biology23:359-365 (2005)。16S rrn启动子序列被集成为盒的功能元件。
[0090]本发明的一个实施方式中提供的表达盒的另一个元件是翻译增强子序列(“5’UTR”)。翻译增强子序列增强质粒中的转基因蛋白序列的翻译。根据本发明的优选的翻译增强子是噬菌体T7基因105’增强子元件。Olins, P.0.和Rangwala, S.H.，J.Biol.Chem.264:16973-16976(1989)。本发明中利用的增强子元件的序列被整合在表达盒的用于扩增mtl、ppk和IacZ基因的合成的5’基因侧翼PCR寡核苷酸(引物)内。
[0091] 可以用于适当的生物整治策略的质粒的另一个元件由编码本身是螯合剂或能够产生螯合分子的酶的蛋白的基因序列组成。螯合剂蛋白和能够产生螯合分子的酶两者/任一个在本文可互换地被称为“螯合剂(chelator agent)”或“螯合剂(sequestrationagent)”。换句话说,直接地是螯合剂或产生螯合分子(chelating molecule)或螯合分子(sequestering molecule)的任何基因产物是根据本发明的螯合剂。一些螯合剂的实例包括ppk、mtl、植物螯合肽、谷胱甘肽S转移酶和merP。
[0092]一种优选的这样的螯合剂是金属硫蛋白(MT)蛋白。金属硫蛋白(MT)是以生物学钝化形式螯合金属离子的富含半胱氨酸的低分子量金属结合肽。Hamer，D.H., Annu.Rev.Biochem.55:913-51 (1986)。一种特别优选的 mt 基因源自小鼠(“mtl 基因”)并编码mtl蛋白。包含小鼠mtlcDNA的pCMV-SPORTIO载体获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)克隆 #MGC47147。还参见 Strausberg, R.L.等人，Proc Natl Acad SciUSA99:16899-16903 (2002)。mtl基因通过聚合酶链反应(PCR)从包含mtl基因的cDNA的质粒pCMV-SPORTIO扩增。mtl编码序列的美国国家生物技术信息中心序列，gi#:BC036990，用于设计和开发通过PCR分离mtl编码序列用于随后克隆的PCR扩增引物。
[0093]另一个优选的螯合剂基因序列是编码多磷酸盐激酶的ppk序列，多磷酸盐激酶负责强烈螯合的多磷酸盐的合成。无机多磷酸盐是通过高能磷酸酐键连接的正磷酸盐的带负电荷的长线型聚合物链。Kornberg，A.，J.Bacteriol.177:491-496(1995)。这些磷酸盐聚合物可以在长度上变化且对于所有活的有机体是普遍存在的。由PPk基因编码的酶多磷酸盐激酶承担从ATP聚合Y磷酸盐以形成长的多磷酸盐链。优选的ppk基因源自细菌，尤其是源自大肠杆菌，且优选的PPk螯合剂是从该基因表达的多磷酸盐激酶和该多磷酸盐激酶的多磷酸盐产物。在一个优选的实施方式中，PPk基因通过PCR使用从NCBI序列NC000913设计的PCR扩增引物从大肠杆菌K12扩增。(ppk基因是上述NCBI序列上的2.07kb区，从碱基 2，621，066 至 2，623，132。) Akiyama, M.等人，J.Biol.Chem.267:22556-22561 (1992) 和 Blattner, F.R.等人，Science.277:1453-1474 (1997)。
[0094]又一个优选的螯合剂基因序列是源自大肠杆菌K12的半乳糖苷酶的IacZ基因序列。Κ12的3，072碱基对IacZ基因是大肠杆菌中的乳糖操纵子的一部分并表达酶β -半乳糖苷酶，该酶催化二糖例如乳糖的水解。Kalnins, Α.等人，ΕΜΒ02:593-597 (1983)。大肠杆菌β_半乳糖苷酶是可由作为辅因子的钾和镁离子活化的464kDa四聚体蛋白。该酶由于其代谢X-Gal的能力而已被广泛用于分子生物学和遗传学，X-Gal是无色改性的半乳糖，其被代谢形成亮蓝色的且可以作为指示剂或报告标记物起作用的不溶性产物(5-溴-4-氯吲哚)。IacZ基因通过PCR使用从NCBI序列NC_000913设计的PCR扩增引物从大肠杆菌K12基因组DNA扩增。(IacZ是3.08kb区，从碱基362，455至365，529。)Blattner, F.R.等人，Science.277:1453-1474 (1997)。
[0095]应注意，关于汞螯合，除非另外特别地论述，否则本发明本文通常是指并示例无机汞的螯合。然而，如果系统还包括功能性转基因裂合酶，例如诸如merB基因，那么本发明还允许有机汞螯合。Ruiz, 0.等人，Plant Physiol.132:1344-1352(2003) ；Bizily S., ProcNatl Acad Sci USA96:6808 - 6813(1999)。
[0096]本发明的一个实施方式中呈现的表达盒的另一个任选的元件由转录终止序列组成。在一个优选的实施方式中，转录终止序列是3’UTR不依赖P因子的转录终止子序列。优选的3’ -UTR序列的实例包括细菌的和质体衍生的rpsl6。对于细菌的rrnB终止子序列的描述由Abe，H.等人，Genes to Cells, 4:87-97 (1999)提供。特别优选的终止子是由Hayes, M.L.等人，Nucleic Acids Res.34:3742-3754(2006)描述的质体衍生的 rpsl6 终止子(本文其他地方还称为rpsT)，其中“T”代表“末端”。rpsl6基因转录终止子序列被整合为mtl、ppk和IacZ基因的合成的3’ PCR扩增寡核苷酸(引物)的一部分。
[0097]产生包括这些遗传元件的盒的常规方法是产生为转基因的PCR引物的合成的寡核苷酸，其中两个PCR引物分别包括5’控制元件(启动子、增强子)和3’ -UTR。虽然在上文我们描述了被采用来获得和制备以将特定的遗传元件转移到表达盒中的特定的分子方法(PCR、合成的寡核苷酸等)，但本领域技术人员应认识到，可选择的引物、可选择的设计和另外的方法学可以用来实现产生表达盒和包括这些遗传元件的转移载体的相同的目标。
[0098]构建表达盒，该表达盒包括功能连接的:用于表达的转基因和基因表达控制元件。上面列出的是优选的元件:源自质体16S rrn基因的启动子；源自噬菌体T7基因10的5’UTR ;和rrnB序列或rpsl6转录终止子(3’-UTR),优选地rpsl6。(注意,在本专利说明书中，rpsl6和rpsT是对于相同的3’ -UTR可互换使用的名称。)该盒包括细菌中使用的调整元件的想不到的组合，如下面进一步详述的，该组合现在已经被证明在细菌中提供强的表达。根据一个实施方式， 本发明的载体中的表达控制序列包括强启动子和5’ UTR,优选地16S rrn启动子序列和噬菌体T7基因105’ UTR0在更优选的实施方式中，载体还包括3’ UTR，优选地rrnB或rpsl63’ UTR，还更优选地rpsl63’ UTR0根据优选的实施方式，细菌工程化为高度表达这些螯合剂转基因序列。所得到的细菌抵抗高水平的重金属污染。
[0099]作为推论，本文所描述的优选的启动子5’ UTR和3’ UTR的组合包括用于高水平表达稳定的转录物和翻译产物的优选的表达系统，无论被表达的转基因是螯合剂还是一些其他基因产物。
[0100]用于将载体引入各种细胞和有机体的转化方法是熟知的。例如，可以经由氯化钙/热激方法(化学感受态细胞方法)、电穿孔、经由质粒接合、粒子轰击等等引入载体构建体。
[0101]载体被转化到有机体中以便表达螯合剂。在一个优选的实施方式中，载体被转化到可以用于生物整治的有机体中，例如植物、真菌、藻类或细菌。
[0102]在一个特别优选的实施方式中，有机体是细菌。优选的细菌是环境上普遍存在的、非挑剔生长的、在天然环境中易于供养(sustainable)的细菌。用本发明的编码螯合剂的表达盒和/或转基因转化的特别优选的细菌是大肠杆菌、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeuriginosa))、蓝细菌(例如，共同念珠蓝细菌(Nostoc commune)或悦目颤蓝细菌(Oscillatoriaamoena))和芽抱杆菌(例如腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus))。
[0103]在本发明的优选的实施方式中，螯合剂基因序列是lacZ、mtl或ppk。表达β -半乳糖苷酶、金属硫蛋白和多磷酸盐激酶的转基因细菌被表明能够从液体除去重金属和汞。上文所描述的细菌构建体已经在汞抗性和累积方面显著提高至先前所报告的至少8倍的水平。
[0104]β -半乳糖苷酶(“ β -gal”)是细菌中乳糖代谢所需要的四肽酶。β -gal是熟知的，这是因为其蛋白序列在1970年公诸于众。不知β-gal蛋白螯合重金属或汞。如下面的实施例中所描述的，β -gal现在已经被表明具有对汞的高亲和力并在被过表达时有效结合萊。未知β-gal可以赋予暴露于高浓度的萊的细菌抗性。并且，β-gal防止高浓度的镉、锌和铅的有害影响。[0105]当β-半乳糖苷酶表达盒(pBSK-P16S-glO-BY-rpst)被引入细菌中时，观察到高水平的转录。此外，细菌变得抵抗高浓度的汞。未被转化的细菌在暴露于5 μ g/ml Hg时显示显著的生长减弱且在较高的浓度下根本不生长，但是被表达β-gal的质粒转化的细菌抵抗0、5、10、20、40、80、100、120、140和160 μ M汞的测试浓度中的每一个。图1和图2中呈现的数据表明被转化的细菌不仅经受得住高达约140 μ M的汞浓度，而且实际上在这些汞水平下繁殖。其他数据(图1和2中未示出)显示被转化的细菌还在160 μ MHg下繁殖。包含质粒的细菌容易耐受在受污染水和土壤中见到的相似浓度的汞，在这些浓度的汞下生长和复制。
[0106]相似的实验证明了细菌当根据本发明被β-gal转化时，可以抵抗包含高达至少约250μΜ镉(参见图10)的培养基并在该培养基中复制。并且，根据本发明被β-gal转化的细菌能够抵抗包含高达至少约1，000 μ M锌的培养基并在该培养基中有效地复制。该相同的转基因细菌证明对高达至少约3，000 μ M铅的抗性。
[0107]当mtl表达盒(pBSK-P16S-glO-mtl_rpst)被引入细菌中时,观察到高水平的转录。参见图3A。此外，细菌变得抵抗高浓度的汞。被表达mtl的质粒转化的细菌抵抗20、40、60、80、100、120、140和160 μ M汞的汞浓度。图1和图2中呈现的数据表明被转化的细菌不仅经受得住高达至少约160 μ M的汞浓度，而且实际上在这些汞水平下繁殖。应注意，细菌的生长速率与汞水平成比例地稍微下降。尽管如此，实现了细菌生长的饱和水平。包含质粒的细菌容易耐受在受污染水和土壤中见到的相似浓度的汞，在这些浓度的汞下生长和复制。
[0108]相似的实验证明了根据本发明表达mtl的细菌克隆可以抵抗包含高达至少约250 μ M镉和高达至少1000 μ M锌的培养基并在该培养基中复制。表达mtl的细菌克隆还呈现对高达至少约3，0 00 μ M铅的抗性。参见图10。
[0109]同样地，当PPk表达盒被引入细菌中时，观察到高水平的转录。参见图3B。此外，细菌变得抵抗高浓度的汞。被表达mtl的上述质粒转化的细菌抵抗20、40、60、80和IOOyM汞。图1和图2中呈现的数据表明被转化的细菌不仅经受得住高达约100 μ M的汞浓度，而且实际上在这些汞水平下繁殖。包含质粒的细菌容易耐受在受污染水和土壤中存在的相似浓度的汞，在这些浓度的汞下生长和复制。
[0110]相似的实验证明了根据本发明表达ppk的细菌克隆可以抵抗包含高达约3，000 μ M铅和1，000 μ M锌的培养基并在该培养基中复制。另外，转基因细菌抵抗高达约250 μ M的镉。参见图10。
[0111]清楚地，包括质体16S rrn衍生的启动子、T7基因10衍生的5’ UTR和细菌衍生的rrnB或质体衍生的rpsl63’ UTR的载体以高的拷贝数表达这些所阐明的螯合剂基因。作为推论，组合的这些表达控制序列可以用于以高的水平表达其他基因，具有如对于螯合剂基因看到的相似的拷贝数，或至少约4，000 ;4，500 ；5,000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ；7，500 ;8，000 ;8，500 全长拷贝每 ng 总 mRNA。
[0112]细菌中包括强启动子和/或适当的5’ UTR和3’ UTR以造成在细菌中生产至少约4，000 ;4，500 ;5，000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ;7，500 ;8，000 ;8，500 全长拷贝每 ng 总
mRNA的螯合剂mRNA的任何遗传构建体，使得包括这样的构建体的细菌能够通过螯合重金属同时抵抗包括重金属的环境并在该环境中繁殖而有效地整治包含重金属的液体或固体。优选地，细菌表达约6，OOO至7，500拷贝的螯合剂每ng总mRNA。
[0113]具有包括β_半乳糖苷酶基因的质粒的转基因细菌还可以有效地用作用于检测汞与汞污染和溢出以及其他重金属的生物传感器。X-gal的裂解释放5，5’-二溴-4，4’-二氯-靛，一种不溶性蓝色化合物。在化合物X-Gal (和X-gal类似物)的存在下表达β -半乳糖苷酶的转基因细菌产生容易地可区别的深蓝色颜色反应。然而，现在观察到蓝色颜色的强度与汞的浓度成比例下降。参见图8和图9。同样地，其他重金属例如镉的存在可以具有破坏X-gal (和X-gal类似物)的裂解和蓝色化合物的产生的相同效果。这些特征使得β-gal适合作为原位或体外生物传感器。因此，半乳糖苷酶在细菌中的表达保护细菌免于汞的有害影响，但也降低了酶代谢乳糖和乳糖类似物例如X-gal的能力。
[0114]在本发明的一个方面，提供了用于检测重金属的试剂盒。根据一个实施方式，试剂盒包括流体的测试小瓶或容器、测试条上的表达半乳糖苷酶或半乳糖苷酶的细菌培养物、5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和指不剂条。指不剂条包含确定半乳糖苷酶还原X-gal的程度的颜色标记物。每一种标记物可以具有不同色调的蓝色，这样的颜色色调通过暴露于不同浓度的重金属例如汞来预先确定。
[0115]试剂盒用来实施检测汞或包括镉、铅和锌的其他重金属的方法。该方法包括将测试样品放在流体容器中的步骤。任选地，在测试样品是固体的情况下，加入液体以从固体释放汞/重金属。加入X-gal。将流体与细菌培养物或包括β-gal蛋白的测试条接触预定的时间段。接着，将培养物的颜色与指示剂条上的标记物进行比较以确定汞是否存在流体中和在流体中的浓度。在高的重金属或汞浓度的一些情况下，试剂盒可以仅提供阳性/阴性结果且并不指示全部浓度范围。
[0116]上述试剂盒的可选择的实施方式还可以包括一组标准品。标准品可以包括各种具有在溶液中的各种浓度的Hg的标准容器。作为非限制性实例，容器可以具有以下Hg浓度:Α:0μΜ ;Β:5μΜ ;C:10yM ;和 D:20yM。
[0117]试剂盒可以按以下方式利用。将指定体积的测试材料和液体(如果材料是固体)放在测试小瓶中，将一定体积的指示浓度的Hg标准品放在每一个标准小瓶中A:O μ M ;B: 5 μ M ;C: 10 μ M ;和D: 20 μ Μ。将一定体积的转基因细菌放在测试小瓶和标准小瓶中的每一个中。将X-gal加入到每一个小瓶。允许培养物温育指定的时间段。优选地，温育时间在约I分钟和20分钟之间，更优选地在5和10分钟之间。在温育时间结束之后，将测试小瓶的着色与标准小瓶的着色进行比较以便确定汞在样品中的大致浓度。
[0118]本领域技术人员应充分理解，可选择的实施方式围绕汞和其他重金属逐渐地降低β-gal的与重金属的浓度相关联的裂解X-gal的能力的概念而被容易地设计。作为实例，但不限于这些实例，细菌以非液体形式(例如，冻干的)被提供，包括β-gal的细菌是细菌的环境菌株，温育在特定的温度下例如在37°C或在室温下进行，采用纯化的β -gal而不是培养物混合物中表达β -gal基因的细菌或β -gal表达载体或β -gal酶增加着色测定可以与汞的浓度相关联的范围。测试样品是固体或固体的液体洗涤物。同样地，可选择的颜色测定和/或用于精确地测量颜色变化的光学仪器(例如，分光光度计、比色计)的使用是可能的。颜色效果增强技术的使用还是已知的和可能的。这些可选择的设计和其他的是本领域技术人员熟知的并在本发明的范围内。
[0119] 在本发明的又一个方面，半乳糖苷酶蛋白本身，即不存在细胞载体，可以用作重金属或汞的螯合剂，用作原位和体外应用的溢出清理系统的一部分。β-gal是商业上可得到的和可以通过熟知的标准分离技术容易地从表达酶的有机体纯化。大量酶的分离可以通过其过表达和针对酶的抗体的商业可用性来促进。为了制造目的，β-gal在细胞中的表达可以通过加入IPTG来操纵/增加。β-gal蛋白的商业供应商是已知的，例如Sigma-Aldrich0
[0120]同样地，金属硫蛋白和多磷酸盐激酶的多磷酸盐产物可以独立地，即不存在细胞载体下作为包括锌、镉、铅或汞的重金属的螯合剂用于整治努力。
[0121]此外，在本发明中已经表明，强启动子或特定的5’ UTR和3’ UTR或优选地强的质体启动子、噬菌体T7增强子和有效的质体衍生的转录终止子序列的特定组合允许金属硫蛋白(mtl基因)、多磷酸盐激酶(ppk基因)和β-半乳糖苷酶(IacZ基因)在细菌中表达至允许它们作为汞和其他金属的有效的生物整治系统的用途和商业化的水平。上述质粒提供能够产生这些和其他转基因的高的mRNA转录和蛋白翻译的增强的基因表达构建体。
[0122]包括本发明的螯合剂的细菌获得使得它们理想地适合于通过螯合的生物整治的性质。举例来说，它们抵抗高水平的汞，持续延长的时间段。参见图1和图2。它们不仅抵抗高水平的汞，而且它们在这些水平下繁殖。在对照实验中，未被转化的细菌在5 μ M汞的存在下显示减弱的生长，且在10 μ M汞下不生长。相反，被表达Pkk基因的构建体转化的细菌在包含10 μ M汞的培养基中显示很少或没有生长减弱且在高达约100 μ M汞的浓度下生长。重要地，细菌繁殖随着时间继续。当在汞中生长120h之后测试相同的构建体时，IacZ构建体在高达约140 μ M汞下显示随着时间的进一步生长，在总生长水平上与在没有汞下生长的未被转化的细菌不能区别。mtl构建体在高达160 μ M汞下显示进一步生长(虽然以稍微降低的生长速率)，在总生长水平上与在没有汞下生长的被转化或未被转化的细菌不能区别，且在包含高达160 μ M汞的培养基中减弱但显著生长。ppk构建体在高达80 μ M汞下显示进一步生长 ，在总生长水平上与在没有汞下生长的未被转化的细菌不能区别。PPk构建体在0-80 μ M的任何汞浓度下显示了小的生长减弱。可能的是，磷酸盐可用性对被ppk基因转化的细菌的生长具有小的影响。
[0123]在包含120 μ M汞的液体通过暴露于包括本发明的螯合剂的细菌来处理的实验中显示了流体的成功的整治。参见图7。在通过暴露于转基因细菌处理包含汞的培养基120h之后，从培养基清除掉剩余的细菌(导致“经处理的培养基”)。将未被转化的(“wt”)细菌种子加入到经处理的培养基、包括O μ M汞的新鲜培养基和包括120 μ M汞的新鲜培养基。细菌在经处理的培养基和没有汞的新鲜培养基中同样地生长良好。这表明经处理的培养基具有低于5 μ M的汞浓度。转基因细菌不仅在这些高水平的汞下生长，而且螯合和除去重金属。
[0124]通过原子吸收光谱法分析产生的定量数据显示转基因细菌的整治功效。参见图
11。原子吸收光谱法分析显示在表达IacZ基因的转基因的大肠杆菌细菌中非常高水平的汞累积。表达LacZ的大肠杆菌细胞在37°C在具有120 μ M Hg的LB培养基中生长120小时。制备用于光谱分析的细胞和培养基的方法基本上是根据环境保护局方法3010Α。将细胞离心，在新鲜培养基中洗漆，再悬浮在小体积的培养基中，用70% (v/v)硝酸、30% (v/v)过氧化氢和浓HCl在95°C消化，达到等于它们生长的初始体积的体积且然后通过原子吸收光谱法分析。在离心细菌细胞之后获得的上清液培养基也在相似的处理之后被分析。结果表明转基因细菌在从培养基除去汞和将高浓度的汞累积在细菌细胞内部上是非常有效的。如所观察的，大部分有毒的汞见于转基因细菌，而培养基中的汞被除去至低于5 μ M的无毒浓度。这些结果表明，转基因的IacZ大肠杆菌具有通过螯合作用生物整治被汞高度污染的液体同时最佳地生长的能力。
[0125]在将被转化细菌暴露于重金属且尤其是汞之后，发现了关于这些细菌的另一个非常有用的性质。细菌在充分累积包括汞的重金属之后，变成较深的色调。此外，其倾向于紧密地聚集和固定。可以从容器挖出这样的聚集的细菌，以例如吸移液体的方式抽吸，而不一定需要细菌可以在其上生长的专用过滤器，或离心。聚集的细菌易于目测，因为其将着色变为深的色调。参见图6;图8，板II ;和图9，板Α。
[0126]聚集和深色调性质可以单独地或组合地良好地用在生物整治中。因此，本发明还提供用于从液体生物整治和吸收重金属或汞的新颖的、简单的和低成本的机制。
[0127]根据本发明使用的一个方法包括将受污染液体放在储器中的第一步骤。在随后的步骤中，将包括表达本发明的螯合剂(sequestration agent)/螯合剂(chelation agent)的质粒的细菌加入到受污染液体中。允许细菌生长并从液体除去重金属。当细菌除去汞且在细胞中达到高浓度的汞时，它们从溶液沉淀并形成紧密结合的聚集体。聚集体然后用筛装置来回收。根据需要，加入另外的转基因细菌。
[0128]另外一个例子，深的着色可用于指示过程已经发展到需要除去细菌的点，或作为工艺实际上在进行中的质量控制，且特定的色调水平可以通过将用于汞监测的上述这些与IacZ系统并联的方法用于指示或监测受污染环境中存在的汞的水平。
[0129]在本发明的另一个实施方式中，表达根据本发明的螯合剂的细菌形成自持生物膜(self-sustained biofilm )以用作过滤系统的一部分以从液体和固体基质除去重金属或汞。在一个优选的实施方式中，如图4所描述的，提供了生物整治系统，其包括水储器104 ；多孔固体基质108 ;在水储器和/或在多孔固体基质中的细胞生物膜100，其中包括本发明的遗传构建体的抵抗Hg的细菌组成生物膜100 ;多孔过滤器112 ;和经处理的水出口 116。遗传工程化的细菌可以在多孔固体基质108上生长以形成生物膜100。
[0130]因为细菌高度抵抗汞和其他重金属，所以其有效地从液体除去汞，同时在细胞内部累积高浓度的汞。高的汞耐受性还允许细菌细胞分裂和生长，这延长了生物过滤器的使用寿命。细菌在过滤器上的着色可以指示它们的生物整治活性以及什么时候需要细菌替换。
[0131]在根据本发明使用的一个方法中，将受污染水装载到水储器104。允许水穿过多孔固体基质208并接触细胞生物膜100。生物膜中的细胞螯合重金属污染物，例如汞。干净的水穿过多孔过滤器112，在多孔过滤器112中除去从生物膜100移去(dislodged)的任何细胞物质以及其他杂质。干净的水然后通过经处理水出口 116释放。
[0132]本申请中所描述的序列的组合可以用作各种体外系统、细胞系统和包括细菌、藻类、植物、动物和真菌的有机体中新颖的生物整治系统。细胞或有机体可以被遗传工程化为表达螯合剂，由此变得抵抗重金属并通过螯合作用从培养基清除污染物。有机体可以被回收且重金属或汞可以被回收和循环用于工业应用。表达或包含被这些序列编码的蛋白的体外系统、细胞或有机体还可以用作生物反应器的一部分或用于土壤、水和沉积物的原位整治。[0133]在根据本发明的另一个实施方式中，提供包括上述重金属或汞螯合系统和重金属/汞运输机制的细菌细胞。在一个非限制性实例中，根据本发明的质粒还可以包括mer操纵子的merT和MerC基因的基因序列。质粒然后可以被转化到提供了将汞或其他重金属运输到细胞质空间中和然后将汞螯合在细胞内的能力两者的细菌细胞中。预期mer操纵子的其他基因还可以被利用以便增强重金属在细胞内的螯合和提供对有机汞制剂例如甲基汞、二甲基汞和醋酸苯汞的抗性。可选择地，其他重金属运输系统可以以如本发明中所描述的方式与本发明的螯合剂组合使用。
[0134]设想可以产生包括编码螯合剂的多于一个基因的细菌系统或其他有机体系统。这通过考虑到以下而更容易地制备:螯合剂的细胞代谢效应(不同于螯合)是不同的且它们作为螯合剂的活性也是不同的(例如，直接螯合或形成多磷酸盐分子)。因此，多于一种类型的螯合剂的存在预期被宿主细胞/有机体相对充分地耐受。
[0135]实施例1.本发明的螯合剂提供对高浓度的汞、镉、锌和铅的耐受性并允许细菌在高浓度的汞、镉、锌和铅的存在下生长。在本发明的一个实施方式中，将包括以商标
pBlueScriptk (Stratagene)销售的载体的质粒构建为以高水平表达转基因。该载体中的 表达盒包括:质体16S rrn基因启动子；5’ UTR翻译增强子元件来自噬菌体T7基因10 ;转基因JP3’UTR不依赖P因子的终止子，如图5所示的。在一个实施方式中，3’UTR是叶绿体rpsl6序列。来自基因10的5’UTR从合成的寡核苷酸产生。其他调节序列经由聚合酶链反应来构建。遗传元件被产生为包括在每一个元件的末端附近的方便的限制性内切酶位点。这些方法是本领域技术人员熟知的。参见,例如,Sambrook, J.和Rusell, D., Molecularcloning: A laboratory manual (分子克隆:实验室手册).Cold Spring Harbor Labpress, Cold Spring Harbor, NY (2001)。产生多个质粒构建体，其中转基因编码lacZ、mtl或
ppko
[0136]包含这些构建体的细菌克隆在包含不同浓度的HgC12的LB培养基中生长16小时，如图1所示的。在图1中，图1A表示未被转化的大肠杆菌菌株JM109，图1B表示包括PBSK-P16S-glO-lacZ-3’ UTR载体的转基因的大肠杆菌，图1C表示包括pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR载体的转基因的大肠杆菌，且图1D表示携带pBSK-P16S-glO-ppk-3’UTR载体的转基因的大肠杆菌克隆。将种子细菌接种物加入到细菌培养物烧瓶中，并将该烧瓶在37°C以用于培养细菌培养物的典型方式摇动温育。在16小时温育时间结束时，在0D600nm测量培养基(culture media)的吸光度。
[0137]几乎相同的构建体(但没有P16S启动子元件)还被工程化和被转化到大肠杆菌。在这些P16-构建体(P16minus construct)中,P16S启动子从载体中去除，IacZ启动子(thepromoter was off the vector, a IacZ promoter)。包括这些 P16S-构建体的工程化的细菌也显示出在高水平的汞下增加的抗性和生长。例如，mtl基因构建体经受得住高达约20 μ MHg，且ppk构建体经受得住高达约40 μ M Hg。然而，清楚地，通过比较，包括P16S元件的构建体能够经受得住显著更高水平的汞。
[0138]看来当两种蛋白被以较低水平表达时，例如在pBSK-glO-mtl-rpsT和pBSK-glO-ppk-rpsT载体的情况下，多磷酸盐激酶比金属硫蛋白提供了更好的对Hg的抗性。当这些蛋白被过表达时，金属硫蛋白比多磷酸盐激酶提供更高的对抗Hg的有毒影响的保护。本发明不受具体的螯合剂的任何作用机理限制。尽管如此，以相对较低或较高水平表达PPk或mtl的细菌中的对汞的抗性的差异可以由两种蛋白的作用机理来解释。在金属硫蛋白的情况下，因为其直接螯合Hg，所以较高的表达水平等于较高的抗性水平。这不同于多磷酸盐激酶，多磷酸盐激酶可以甚至在较低的酶浓度下产生较高水平的多磷酸盐，这是因为其是酶。在较高的酶浓度下，Hg抗性的增量可能低于所预期的，这是因为酶底物在细胞中的可用性可能供应不足，由此限制其活性。多磷酸盐激酶承担了从ATP聚合Y磷酸盐以形成长的多磷酸盐链。
[0139]图1中概括的实验结果显示未被螯合剂转化的大肠杆菌(“wt”)可以在包含高达约5 μ M Hg的培养基中生长，虽然生长在暴露于5 μ M汞之后减弱。用指示的质粒转化的大肠杆菌显示当以在20 μ M至高达约:40 (pkk) ；80 ( β -gal) ;80 (mtl) μ M萊范围内的萊浓度下生长时在16小时时间内生长。在相似的实验中，如图2所示的，转基因的大肠杆菌可以甚至在较高浓度的汞的存在下继续生长，且培养物在以下LB培养基中温育120小时之后实现较高的密度:包含各种指示的浓度的Hg，高达约以下的汞浓度:对于ppk构建体的100 μ M ;对于β -gal构建体的140 μ M ;和对于mtl构建体的160 μ Μ。因此，细菌抵抗这些高浓度的汞并在这些高浓度的汞下继续生长。
[0140]实施例2.本发明的构建体(pBSK-P16S_glO-螯合剂_3’ UTR)将螯合剂元件转录至非常高的水平。mRNA从未被转化的细菌和表达mtl和ppk的细菌克隆收集。总细胞RNA通过使用RNeasy微量试剂盒(RNeasy Mini Kit, Qiagen)和方案从在37°C在300rpm搅拌下在Luria Bertani (LB)肉汤中生长16小时的Iml细菌克隆和未被转化的大肠杆菌JM109培养物分离。RNA样品用100 μ g/ml的浓度的DNA酶I处理。样品通过随机引物扩增使用AccuScript cDNA试剂盒(Stratagene)来标准化和逆转录。cDNA通过定量实时PCR使用具有扩增后融化曲线分析的两步骤实时PCR扩增程序来分析。从合成的寡核苷酸产生基因特异性标准曲线用于定量。使用转基因特异性引物的实时PCR产生与mRNA模板成比例的量的cDNA。用作来自未被转化的细菌的模板mRNA的对照实验显示没有转基因的表达。转基因特异性mRNA的拷贝数被计算和归一化为存在的总mRNA。如图3中可以见到的，克隆包含约7，000拷贝的每一种转录物每ng总mRNA。用包括Β-gal元件的构建体获得了相似的数据。本领域技术人员将认识到，这些数字表示转基因被转录至非常高的水平。
[0141]实施例3.包含本发明的螯合剂的细菌当它们累积汞时形成聚集体。当细菌在足够高的浓度的汞中生长或在较低浓度下生长足够长的时间时观察到深的着色、聚集和沉淀。例如，如图 6 所示的，pBSK-P16S-glO(5’ UTR)-mtl_3，UTR( “mtl”)和 pBSK_P16S-glO(5’UTR)-lacZ-3’UTR(“lacZ”)样品在包含UOyMHg的LB培养基中温育之后形成在容器的底部累积的聚集体。用在80 μ M汞的存在下生长的包括mtl或ppk基因的转基因细菌也观察到相似的效应。在约24小时之后观察到变化且它们随时间与累积成比例增加。三个细菌克隆全部在搅拌(以约280rpm)下在15ml锥形管中生长。在搅拌期间出现聚集和沉淀，而不需要静止温育。所测试的三种螯合剂中的每一种都出现这些颜色变化和沉淀效应。
[0142]这提供细菌应何时被除去和替换的目视指示剂。该效应使得通过简单地从液体筛分细菌而容易除去已经累积大量汞的细菌。
[0143]已经在细菌克隆pBSK-P16S-glO-mtl_rpsT 和 pBSK-P16S-glO-ppk_rpsT 中观察到这些聚集和沉淀效应。因此，看来不是基因型的直接功能，而是对汞的抗性和在细胞中累积汞的功能。仅在已经在等于或高于80 μ M的汞浓度下生长至少24小时的时间段的细菌中观察到聚集和沉淀。在较低的汞浓度下，细胞将可能需要暴露于低浓度的汞较长的时间段。尽管如此，在细菌已经累积足够的汞后，在较低浓度的汞下也出现颜色变化、聚集和沉淀。
[0144]累积汞的转基因细菌获得深的颜色，这用作细胞中高的汞浓度的指示。细胞的加深可以在40 μ M Hg或更高下察觉到。聚集、沉淀和着色效应是在细菌细胞累积高的汞浓度之后识别和回收细菌细胞的非常有用的特征；它们可以是有用的标记物以确定细胞何时即将从正被清洁的环境收获，且还可以帮助降低将这些细菌系统应用于汞生物整治的成本。这是由于累积高浓度的汞而在细菌细胞中触发的形态学变化的第一报告。
[0145]实施例4.在通过暴露于包括本发明的构建体的细菌来处理培养基之后，经处理的培养基基本上不含重金属；萊被螯合。如图7所不的,将未被转化的大肠杆菌JM109在没有汞(O μ Μ)的LB培养基中、在经处理的培养基中和在具有120 μ M HgCl2浓度的LB培养基中培养。
[0146]经处理的培养基是初始包含UOyMHgCl2且细菌克隆pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR 或 pBSK-Prrn-5’UTR-mtl-3’UTR 在其中生长 120 小时的 LB培养基。通过以13，OOOrpm离心2分钟从液体培养基除去细菌细胞，且通过使液体培养基穿过0.22 μ M过滤器以除去从离心过程留下的任何转基因细菌细胞而使液体培养基灭菌。
[0147]经处理的培养基用未被转化的大肠杆菌JM109再接种。在图7Α示出的实验中，经处理的培养基是用包括pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR(“lacZ”)构建体的细菌处理的培养基。在图7B示出的实验中，经处理的培养基是用包括pBSK-Prrn-5 ’ UTR-mt 1_3 ’ UTR (“mt I ”)构建体的细菌处理的培养基。允许未被转化的细菌在相应的经处理的培养基中在37°C在标准细菌培养条件下生长16小时，且然后测量培养物的OD6tltl吸光度。结果显示未被转化的大肠杆菌在通过转基因细菌处理的培养基中的正常生长速率。作为对照，包含120 μ M Hg的新鲜培养基也被过滤灭菌并加入大肠杆菌JM109细菌。未被转化的JM109细菌不能够在包含UOyMHgCl2的培养基中生长。参见图7Α和图7Β。这表明本发明的转基因克隆可以用于整治处理包含非常高浓度的汞的液体。该处理将Hg降低至无毒水平(小于约5μΜ)并允许大肠杆菌JM109的正常生长。
[0148]实施例5.汞被螯合在细菌内；转基因细菌将汞降低至亚细菌抑制剂量。为了证实β -半乳糖苷酶可以作为螯合剂，我们对从在具有120 μ M Hg的LB培养基中的5ml培养物在120小时之后获得的pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT细菌小球(pellet)进行冷蒸汽原子吸收光谱法(CVAAS)分析。将细胞通过离心从培养物除去，洗涤并再悬浮在Iml LB培养基中。遵循 EPA 方法 30IOA (EPA 方法 3010A.Methods for Chemical Analysis of Water andWastes (用于化学分析水和废物的方法)；美国环境保护局:Washington, DC, 1992)将细胞和上清液单独地酸消化，使得达到5ml体积以维持初始的Hg比例，且然后通过CVAAS来分析。结果表明IacZ细菌克隆对于从培养基除去Hg是非常有效的，累积等于116 μ M的浓度的Hg(图11)。在120小时处理之后留在培养基中的浓度是2.7 μ M(图11)。这些结果证实了显示未被转化的大肠杆菌在用pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT细菌克隆事先处理的培养基中非常好地生长的结果。从两个研究明白的是，转基因细菌能够从液体培养物除去Hg至低于5μ M的水平。
[0149] 实施例6.半乳糖苷酶生物测定.汞降低β-gal裂解X-gal的能力.如图8所示的，包括pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsl6质粒的细菌克隆在所指示的Hg+2浓度下生长。板I示出在O至20 μΜ Hg+2范围内的Hg+2浓度下16小时之后的细菌生长测量结果(OD_J。然后对在所指示的Hg浓度下生长的每一种细菌制备双份比色皿。参见板II和板III。将100 μ g/ml X-gal加入到板III的比色皿。观察到X-Gal至蓝色颜色的转化的降低与汞浓度的增加成比例，一直到20 μ M Hg+2。如板I和板II中观察到的，转基因克隆的细菌生长不受在该浓度范围内的增加的汞浓度影响。这表明蓝色颜色的降低是β-gal酶促活性的降低的因素而不是由于缺乏细菌生长。
[0150]为了更易于目测，图8在板II和板III中呈现了包含样品的实际比色皿的照片的图。图中的明暗是根据照片的明暗，并保存包含暴露于不同浓度的Hg的细菌的比色皿的相对暗度。板II是示出在O至20 μ M Hg+2中16小时之后的细菌生长的比色皿的照片的精确图再现。板III是示出β_半乳糖苷酶对Hg+2的增加的暴露和螯合作用降低了该酶将X-gal底物转化为蓝色颜色代谢物的能力的比色皿的照片的精确图再现。Α:0 μ M ;Β:5 μ M ;C: 10 μ M ;D:20 μ Μ。板II和板III中的比色皿“D”的色调在视觉上是相同的。
[0151]图9板A示出相似实验的实际照片，其中表达β-gal的细菌克隆在37°C在100 μ g/ml x-gal和所指示的浓度的汞的存在下生长16小时。如可以见到的，在40 μ M汞下生长的培养物开始发展较深的颜色。该颜色变深是细胞中被螯合的汞累积的效应。在每一个小瓶底部的有色棒是被开发为模拟/捕获培养物当暴露于所指示的浓度的汞时的色调的颜色编码条。
[0152]图9板B示出用于检测重金属污染的原型试剂盒。提供容器，其中加入测试液体以及浓的X-gal和表达β-gal的构建体或纯化的β-gal。附接于培养管或在附近的是颜色代码图，以允许目测比较测试结果与颜色图。图A是图9B中的试剂盒的示意图。在标准化条件下温育一段时间之后，将培养物的颜色与颜色图表进行比较。
[0153]实施例7.螯 合剂提供对锌、镉和铅的抗性。未被转化的大肠杆菌JM109( “wt”)和表达lacZ、mtl和ppk基因的细菌培养物中的每一种用0.01OD600的细菌接种并在补充有1,000 μ M ZnCl2 (图 10 板 Α) ;250 μ M CdCl2 (板 B);和 3，000 μ M Pb (C2H3) 2) 2.3Η20 (板 C)的LB培养基中生长24h。如图10中可以见到的，wt细菌显示对这些毒素的某一水平的抗性。然而，转基因细菌的抗性显著更大。很可能，这些细菌克隆可以在还更高水平的锌、镉和铅的存在下继续生长良好。包含ppk的克隆对镉示出仅有限的抗性。克隆在铅补充的培养基中显示减弱的但显著的生长。所有三种被转化的细菌在锌中的生长以及mt和β-gal克隆在镉中的生长基本上不受阻碍。作为对照，wt和所有三种被转化的细菌菌株在没有补充重金属的培养基中生长同样良好(数据未示出)。
[0154]上述本发明应结合所附的权利要求和附图来阅读。实施方式和实施例的描述使得人们能够实践本发明的各种实现，且它们并不意图将本发明限制于优选的实施方式，而是作为本发明的特定的实施例。本领域技术人员将明白，他们可以容易地将所公开的概念和具体的实施方式用作用于修改或设计用于进行本发明的相同的目的的其他方法和系统的基础。
[0155]本文引用的包括出版物、专利申请、专利和网站内容的所有参考文献据此通过引用并入，达到如同每一个参考文献单独地和明确地被表明通过引用并入且在本文中以其整体提出的相同程度。
[0156]在描述本发明的上下文中的术语“一(a)”和“一(an)”以及“该(the) ”和相似的指示物的使用被解释为覆盖单数和复数两者，除非本文另外表明或明显地同上下文相矛盾。
[0157]除非本文另外表明，本文的值的范围的列举仅意图用作单独地指代落入该范围的每一个单独的值的速记方法，且每一个单独的值被并入说明书中，如同其单独地在本文被列举。词语“约”当伴随数值时应被解释为表示达到所陈述的数值的10%且包括所陈述的数值的10%的偏差。除非另外要求，本文提供的任何和所有的实例或示例性的语言(“例如”或“诸如”)的使用，仅意图更好地阐明本发明且并不造成对本发明的范围的限制。说明书中的语言不应被解释 为表示对本发明的实践必要的任何非要求保护的要素。
【权利要求】
1.一种细菌，所述细菌包括选自以下的转基因螯合剂:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述螯合剂不是融合蛋白，且 其中所述细菌抵抗20 μ M和100 μ M之间的Hg。
2.—种细菌，所述细菌包括选自以下的转基因螯合剂:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述细菌不包括用于重金属运输功能的转基因mer操纵子剂，且 其中所述细菌抵抗20 μ M和100 μ M之间的Hg。
3.如权利要求2所述的细菌，所述细菌包括选自以下的转基因螯合剂:mt、ppk和β -半乳糖苷酶(IacZ)， 其中所述螯合剂不是融合蛋白。
4.一种细菌，所述细菌包括选自以下的转基因螯合剂:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述螯合剂基因被工程化用于在所述细菌借以抵抗20 μ M和100 μ M之间的Hg的水平表达。
5.一种用于从液 体清除汞、镉、锌或铅污染的方法，所述方法包括: 将表达转基因mt、ppk或β -半乳糖苷酶螯合剂的细菌培养物加入所述液体中， 其中所述细菌培养物中的细菌抵抗20 μ M直至约100 μ M汞之间的汞浓度、约200 μ M之上直至约250 μ M的镉浓度、约500 μ M之上直至约1000 μ M的锌浓度或约250 μ M之上直至约3，000 μ M的铅浓度，和 在足以允许所述汞的螯合的一段时间之后从所述液体除去所述细菌。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细菌不包含用于重金属运输的转基因mer操纵子基因。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述螯合剂不是融合蛋白。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述螯合剂不是融合蛋白。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述螯合剂基因被工程化用于在细菌借以抵抗.20 μ M和100 μ M之间的汞、约200 μ M之上直至约250 μ M的镉浓度、约500 μ M之上直至约.1000 μ M的锌浓度或约250 μ M之上直至约3，000 μ M的铅浓度的水平表达。
【文档编号】C02F101/20GK103992980SQ201410165439
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2010年8月20日 优先权日:2009年8月20日
【发明者】奥斯卡·鲁伊斯 申请人:泛美波多黎各大学