圆褐固氮菌生物絮凝剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种圆褐固氮菌生物絮凝剂及其制备方法。微生物絮凝剂制备因培养成本高、周期长、发酵后需固液分离，使产品成本增加。本发明用甘露醇、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、CaCO3、CaSO4·2H2O加水配置发酵培养基；取已活化的圆褐固氮菌的固体斜面菌种，接种至发酵培养基培养得到发酵种子液，按10%的体积比接种至发酵培养基中培养；结束后加入无水乙醇静置沉淀，收集沉淀烘干，得到生物絮凝剂。本发明采用圆褐固氮菌作为絮凝材料，絮凝成分主要为胞外多聚物多糖、粘性荚膜多糖及发酵过程产生的有机酸、氨基酸等，絮凝效果明显，安全性高于传统絮凝剂；发酵液及菌体均为絮凝剂成分，不需要固液分离，减少分离成本；培养周期短，热稳定性好。
【专利说明】圆褐固氮菌生物絮凝剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种絮凝剂，具体涉及一种圆褐固氮菌生物絮凝剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]絮凝剂又称沉降剂，是一类可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒(粒径10— 3~10_ 7 Cm)凝聚、沉淀的物质，已广泛应用于生活污水处理、给水处理、造纸、发酵、化工、建材等行业废水处理及减少污泥膨胀等领域。目前应用于水处理中的絮凝剂主要有两大类:无机盐类(如硫酸铝、氯化铁等)及其聚合物(如聚合氯化铝、聚合硫酸铝或铁等)；有机合成的高分子化合物(如聚丙烯酰胺)。无机盐絮凝剂具有一定的腐蚀性，且摄入过量铝盐对人具有毒性；聚丙烯酰絮凝剂的单体有毒，容易致癌，且其残留物不易被生物降解，容易造成二次污染，因此使其应用受到很大限制。
[0003]微生物絮凝剂(MBF)是一类由微生物产生的具有絮凝活性的物质，主要化学成分是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素、核酸等大分子物质，因其特定的结构和组成而形成了良好的絮凝沉淀性能，主要通过菌体吸附、胞外多聚物絮凝及代谢中产生的有机酸和氨基酸中和重金属离子毒性等原理，在颗粒中间起中和电荷、吸附、桥联、网捕等作用，从而使胶体脱稳、絮凝沉淀。与传统絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有安全、无毒、可生物降解、无二次污染的优点。但一般微生物的培养需要氮源，培养成本高，且加入氮源后使发酵液颜色较深，影响在水处理的应用；此外，目前研究的微生物絮凝剂或为微生物发酵代谢产物，或为菌体本身，因此在发酵后都需要采用离心或过滤进行固液分离，增加了产品的成本；加之微生物所产絮凝剂的活性不高，以上原因使微生物絮凝剂的推广应用受到限制。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种培养周期更短、生产成本更低的圆褐固氮菌生物絮凝剂及其制备方法。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
圆褐固氮菌生物絮凝剂的制备方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:配置发酵培养基:
发酵培养基配方为:甘露醇 10.0g，KH2PO4 0.2 g, MgSCWH2O 0.2g，NaCl 0.2g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.1g,调 pH 至 6.8-7.0，加水 100mL 混合均匀，分装于 250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL，121°C灭菌30分钟；
步骤二:发酵种子液的培养:
取已经活化的圆褐固氮菌固体斜面菌种，接种至发酵培养基，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液；
步骤三:絮凝剂的发酵培养:
取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养50-60小时；
步骤四:絮凝剂的制备:
发酵结束后，在发酵液中搅拌加入3倍体积的无水乙醇，至终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000rpm离心，收集沉淀，50°C -60°C烘干，得到的淡黄色固体即为圆褐固氮菌生物絮凝剂。
[0006]所述的圆褐固氮菌生物絮凝剂的制备方法所制备的圆褐固氮菌生物絮凝剂。
[0007]本发明具有以下优点:
本发明采用圆褐固氮菌作为絮凝材料，其絮凝成分主要为胞外多聚物多糖，粘性荚膜多糖及发酵过程产生的有机酸、氨基酸等，这些成分可生物降解，使用安全、无毒，无二次污染，絮凝效果及安全性均明显高于传统无机絮凝剂及有机高分子絮凝剂。
[0008]本发明使用的圆褐固氮菌可自生固氮，培养过程不需要氮源；发酵液及菌体均为絮凝剂成分，发酵后不需要固液分离，减少分离成本，絮凝剂产率高；发酵培养只需50-60小时，培养周期短，，节约成本。
[0009]本发明制备的絮凝剂主要成分为多糖，热稳定性好，100°C加热30分钟后，絮凝剂活性不降低。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为絮凝剂热稳定性试验结果，横轴为时间，纵轴为絮凝率。
【具体实施方式】
[0011 ] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0012]本发明所涉及的圆褐固氮菌生物絮凝剂的制备方法，由以下步骤实现:
步骤一:配置发酵培养基:
发酵培养基配方采用阿须贝固氮培养基配方，具体配方为:甘露醇10.0g, KH2PO4 0.2g, MgSO4.7H20 0.2g，NaCl 0.2 g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.lg，调 pH 至 6.8-7.0，加水100mL混合均匀，分装于250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL, 121°C灭菌30分钟。
[0013]需固体培养基培养时，将上述液体培养基按1.8%的体积比加入琼脂即可。
[0014]步骤二:发酵种子液的培养:
取已经活化的圆褐固氮菌(购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))的固体斜面菌种，接种至发酵培养基，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液。
[0015]步骤三:絮凝剂的发酵培养:
取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养50-60小时。
[0016]步骤四:絮凝剂的制备:
发酵结束后，在发酵液中搅拌加入3倍体积的无水乙醇，至终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000rpm离心，收集沉淀，50°C -60°C烘干，得到的淡黄色固体即为圆褐固氮菌生物絮凝剂。
[0017]实施例1:
步骤一:配置发酵培养基:发酵培养基配方采用阿须贝固氮培养基配方，具体配方为:甘露醇10.0g, KH2PO4 0.2g, MgSO4.7H20 0.2g，NaCl 0.2 g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.lg，调 pH 至 6.8，加水100mL混合均匀，分装于250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL，121°C灭菌30分钟。
[0018]需固体培养基培养时，将上述液体培养基按1.8%的体积比加入琼脂即可。
[0019]步骤二:发酵种子液的培养:
取已经活化的圆褐固氮菌的固体斜面菌种，接种至发酵培养基，28°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液。
[0020]步骤三:絮凝剂的发酵培养:
取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，28°C摇床转速160rpm发酵培养50小时。
[0021]步骤四:絮凝剂的制备:
发酵结束后，在IL发酵液中搅拌加入3L无水乙醇，使乙醇终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000 rpm离心，收集沉淀，50°C烘干，得到圆褐固氮菌生物絮凝剂
6.5 克。
[0022]实施例2:
步骤一:配置发酵培养基:
发酵培养基配方采用阿须贝固氮培养基配方，具体配方为:甘露醇10.0g, KH2PO4 0.2g, MgSO4.7H20 0.2g，NaCl 0.2 g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.lg，调 pH 至 6.9，加水100mL混合均匀，分装于250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL，121°C灭菌30分钟。
[0023]需固体培养基培养时，将上述液体培养基按1.8%的体积比加入琼脂即可。
[0024]步骤二:发酵种子液的培养:
取已经活化的圆褐固氮菌的固体斜面菌种，接种至发酵培养基，29°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液。
[0025]步骤三:絮凝剂的发酵培养:
取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，29°C摇床转速160rpm发酵培养55小时。
[0026]步骤四:絮凝剂的制备:
发酵结束后，在IL发酵液中搅拌加入3L无水乙醇，至终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000rpm离心，收集沉淀,55°C烘干,得到圆褐固氮菌生物絮凝剂5.6克。
[0027]实施例3:
步骤一:配置发酵培养基:
发酵培养基配方采用阿须贝固氮培养基配方，具体配方为:甘露醇10.0g, KH2PO4 0.2g, MgSO4.7H20 0.2g，NaCl 0.2 g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.lg，调 pH 至 7.0，加水100mL混合均匀，分装于250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL，121°C灭菌30分钟。
[0028]需固体培养基培养时，将上述液体培养基按1.8%的体积比加入琼脂即可。
[0029]步骤二:发酵种子液的培养:
取已经活化的圆褐固氮菌的固体斜面菌种，接种至发酵培养基，30°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液。
[0030]步骤三:絮凝剂的发酵培养:
取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，30°C摇床转速160rpm发酵培养60小时。
[0031]步骤四:絮凝剂的制备:
发酵结束后，在IL发酵液中搅拌加入3L无水乙醇，至终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000rpm离心，收集沉淀，60°C烘干,得到圆褐固氮菌生物絮凝剂6.2克。
[0032]絮凝活性测定采用高岭土法。取95 mL 0.3%的高岭土悬浮液于250mL三角瓶中，加蒸馏水至95mL，再加3 mLl%CaCl2溶液和2mL 0.5%絮凝剂溶液，摇匀，调pH至7.0,轻摇Imin后静置3min，取其上清液，用752分光光度计测定上清在波长550nm时的OD值，同时以蒸馏水代替培养液作为空白对照实验。
[0033]絮凝率计算公式:絮凝率(％) = (A-B) /AX 100%
式中:A-对照上清液550nm处OD值，B-样品上清液550nm处OD值。
[0034]本发明所制备的圆褐固氮菌生物絮凝剂的絮凝活性较高，其絮凝效果明显高于传统无机絮凝剂及有机高分子絮凝剂，参见下表中本发明圆褐固氮菌生物絮凝剂与传统絮凝剂絮凝效果比较。
【权利要求】
1.圆褐固氮菌生物絮凝剂的制备方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:配置发酵培养基: 发酵培养基配方为:甘露醇 10.0g，KH2PO4 0.2 g, MgSCWH2O 0.2g，NaCl 0.2g, CaCO3 5.0g, CaSO4.2H20 0.1g,调 pH 至 6.8-7.0，加水 100mL 混合均匀，分装于 250 mL三角瓶中，每瓶装液100 mL，121°C灭菌30分钟； 步骤二:发酵种子液的培养: 取已经活化的圆褐固氮菌固体斜面菌种，接种至发酵培养基，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养30小时,得到发酵种子液； 步骤三:絮凝剂的发酵培养: 取发酵种子液按10%的体积比接种至发酵培养基中，28-30°C摇床转速160rpm发酵培养50-60小时； 步骤四:絮凝剂的制备: 发酵结束后，在发酵液中搅拌加入3倍体积的无水乙醇，至终浓度为75%，静置放置24小时，待沉淀完全析出，以4000rpm离心，收集沉淀，50°C -60°C烘干，得到的淡黄色固体即为圆褐固氮菌生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的圆褐固氮菌生物絮凝剂的制备方法所制备的圆褐固氮菌生物絮凝剂。
【文档编号】C02F1/54GK104176803SQ201410412875
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】杨明琰, 梁语燕, 陈莎莎 申请人:长安大学