假单胞菌及其用途
【专利摘要】本发明涉及微生物【技术领域】，具体公开一种假单胞菌及其用途。本发明的假单胞菌已于2014年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为：Pseudomonas sp.SY-JF-1，保藏编号：CCTCC No:M2014401。本发明的假单胞菌能够用于降解间甲酚，以及用于处理含有间甲酚的工业废水。
CCTCC No.M2014401
20140909
【专利说明】假单胞菌及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，特别涉及一种假单胞菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 间甲酚是酚类化合物中具有代表性的一种物质，是生产一些杀虫剂以及彩色胶 片、树脂、増塑剂和香料合成的中间体。间甲酚存在着两种异构体对甲酚（p-cresol)和 邻甲酚（o-cresol)。这两种异构体均具有强烈的腐蚀性和毒性，被美国EPA列入环境优 先控制污染物的黑名单，同时也是我国重点控制污染物之一。根据《污水综合排放标准》 (GB8978-1996)，一切排污单位的最高允许排放间甲酚的浓度不超过0. 5mg/L，可见间甲酚 的环境污染控制非常重要。
[0003] 在处理含甲酚的废水领域中，生物法与物化法相比较表现出经济、安全、处理阈 值低、残留少、无二次污染等方面的优点，在应用方面更显优势。这方面典型的工作有： Masahiro等在一个三相生物反应器中降解邻甲酚，初始浓度在30?600mg/L时都能完全降 解，降解反应符合Haldane模型；Christian Kennes等利用UASB反应器以对甲酷和挥发性 脂肪酸为原料产生甲烷，效果良好;Atagana等从油污污染土壤中筛选出7种非担子类真菌 及2种担子类真菌，用它们降解苯酚、间甲酚、邻甲酚及对甲酚混合物，并考察了最适环境 条件。
[0004] 但是，间甲酚的含量过高会抑制微生物的生长，使废水处理停留时间过长，降低处 理效率。目前所报道的能降解间甲酚的菌种主要有热带假丝酵母菌、麦芽糖假丝酵母菌、杂 色云芝和一些厌氧产烷微生物等。采用这些菌种进行生物法处理间甲酚的理论浓度一般都 在500mg/L以下。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服现有生物法无法处理高浓度间甲酚的技术缺陷，提供一种新型 假单胞菌，能够解决现有生物法处理含高浓度间甲酚工业废水时酚降解率低的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -方面，本发明提供一种假单胞菌，保藏名称为：Pseudomonas sp. SY-JF-1，保藏 单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年9月9 日，保藏号：CCTCC N〇:M2014401。
[0008] 另一方面，本发明提供上述假单胞菌的用途，用于降解间甲酚，以及用于处理含有 间甲酚的工业废水。
[0009] 本发明的有益效果在于：本发明的假单胞菌能够耐受浓度高达800mg/L的间甲 酷，在浓度为600mg/L的间甲酚中能够高效降解间甲酷，能够很好的应用于含间甲酚废水 的生物处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1为SY-JF-1菌株对不同初始浓度间甲酚的降解曲线图；
[0011] 图2为SY-JF-1菌株对浓度为800mg/L的间甲酚酚的降解曲线图。
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发 明，而不构成对本发明的限制。
[0013] 本发明提供一种假单胞菌，保藏名称为：假单胞菌SY-JF-1，Pseudomonas sp. SY-JF-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日 期：2014 年 9 月 9 日，保藏号：CCTCC N〇:M2014401。
[0014] 该假单胞菌属于革兰氏阴性菌类，简称SY-JF-1菌株。SY-JF-1菌株的形态特 征为：细胞呈杆状，菌落乳白色、隆起、边缘光滑齐整。SY-JF-1菌株在生长过程中能耐受 800mg/L的间甲酚，SY-JF-1菌株的最适生长条件为：pH7. 0,温度30°C。
[0015] 间甲酚无机盐分离培养基成分为（g/L) :0? 9KH2P04,6. 5Na2HP04 ? 12H20， 0. 4 (NH4) 2S04,0. 2MgS04 ? 7H20 ;每1L培养基加入lmL微量元素溶液（微量元素溶液配制： lg FeS04 ? 7H20, lg MnS04 .H20,0. 25g Na2Mo04 ? 2H20,0. lg H3B04,0. 25g CuCl2 ? 2H20,0. 25g ZnCl2,0. lg NH4 ? V03,0. 25g C〇(N03)2 ? 6H20,0. lg NiS04 ? 6H20,溶解于 900mL 蒸馏水中，加 5mL浓H2S04，补蒸馏水至lOOOmL);间甲酚过滤灭菌，待无机盐培养基高温高压灭菌后加入， 终浓度最初为l〇〇mg/L，以后间甲酚浓度每次增加100mg/L。
[0016] SY-JF-1菌株可以高效降解间甲酚，在以间甲酚为碳源（600mg/L)、（NH4) 2S04为氮 源（400mg/L)的无机盐培养液体培养基中接种SY-JF-1菌株后，30°C，pH为6. 5 - 9. 5范围 内可高效降解间甲酚，48h内间甲酚降解率达到99%以上。
[0017] SY-JF-1菌株分离自辽宁某焦化厂生化好氧池活性污泥，经人工富集驯化培养并 分离纯化得到。具体包括如下步骤：
[0018] 1、SY-JF-1菌株的分离和纯化
[0019] 用250mL三角瓶，装100mL间甲酚无机盐培养基（g/L) (0.9KH2P04， 6. 5Na2HP04 ? 12H20,0? 4 (NH4) 2S04,0? 2MgS04.7H20,每 1L 培养基加入 lmL 微量元素溶液，间甲 酚过滤灭菌，待无机盐培养基高压灭菌后加入）。微量元素溶液配方（g/L) :lg FeS04*7H20， lg MnS04.H20,0.25g Na2Mo04.2H20,0.1g H3B04,0.25g CuCl2.2H20,0.25g ZnCl2,0.1g NH4 .VC^O. 25g Co (N03)2 .61120,0. lg NiS04 .6H20,溶解于 900mL 蒸馏水中，加 5mL&H2S04， 补蒸馏水至l〇〇〇mL。向培养基中接入5mL从辽宁省某焦化厂采集的生化好氧池活性污泥， 于30°C、转速为150r/min的摇床中振荡培养3d得到菌液。取5mL菌液接种到100mL新培 养基中，重复转接7次。间甲酚起始浓度为100mg/L，以后每次转接间甲酚浓度增加100mg/ L，直到800mg/L为止。
[0020] 驯化培养好的菌液按10_3、10_4、10_5、10_ 6和10_7稀释，取0. lmL 1(T5稀释液涂在含 有800mg/L苯酚的无机盐培养基平板上，30°C倒置培养2?3d，挑取单菌落，进行3次划线 分离纯化，得到纯化的SY-JF-1菌株。
[0021] 2、SY-JF-1菌株的鉴定
[0022] 采用16S rRNA基因测序法对SY-JF-1菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：
[0023] (1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取SY-JF-1菌株的基因 组DNA，作为PCR反应的模板。
[0024] (2) 16S rRNA基因的PCR扩增：扩增引物如下：
【权利要求】
1. 一种假单胞菌，其特征在于，保藏名称为：Pseudomonas sp. SY-JF-1，保藏单位：中 国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年9月9日，保藏 号：CCTCC N〇:M2014401。
2. 如权利要求1所述的假单胞菌的用途，其特征在于，用于降解间甲酚。
3. 如权利要求1所述的假单胞菌的用途，其特征在于，用于处理含有间甲酚的工业废 水。
【文档编号】C02F101/34GK104450567SQ201410663446
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】朱希坤, 杨德玉, 李小明, 戴速航, 李旭 申请人:沈阳化工研究院有限公司