藻毒素降解酶在抑制蓝藻及降解藻毒素方面的应用的制作方法

本发明涉及农业、渔业生产及环境保护领域，具体涉及藻毒素降解酶(microcystinsdegradingenzyme，mde)在抑制或杀灭蓝藻中的应用、mde在抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素中的应用、用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，各地不断大规模爆发蓝藻水华事件，藻害直接影响了周边地区生活用水和工业用水，严重破坏了生态环境，给农业、渔业生产和旅游业发展带来了巨大的经济损失，也给公众健康带来极大隐患，造成严重的社会公共安全问题。

在藻害综合治理中需要解决两个方面的关键问题：一是要抑制或杀灭蓝藻，二是要降解由有毒藻死亡后释放到水体中的藻毒素。

抑制或杀灭蓝藻的方法有多种，目前常用的有物理法、化学法及生物法等。物理法主要有换水、人工打捞、紫外辐射、微波处理等，物理方法虽然不引入污染物，但具有成本高、费时费力，并且对大水面的水体无能为力的缺点。化学杀藻剂具有经济、高效、方便、起效快等优点，比如以硫酸铜及其络合物为代表的重金属化合物类杀藻剂；以高锰酸钾、高铁酸盐、过氧化物为代表的强氧化剂类杀藻剂；以三唑啉酮类、三嗪类等为代表的除草剂类杀藻剂等。但是，这些杀藻剂存在选择性差、药剂用量大、对鱼类毒性较大等问题，目前主要用于短期快速治理和紧急控制藻害等情况。生物法抑藻或杀藻因其不会产生生态损害，被认为是最安全的抑制或杀灭蓝藻的方法，目前的生物法主要采用人工种植一些适应性好的高等沉水植物，或者放养一些对生态安全没有威胁的水生动物(鲢、鳙、大型溞等)。但是生物法抑藻或杀藻存在起效慢的缺陷，在蓝藻爆发时就无能为力，且不能杀死蓝藻，也不能降解由于有毒藻产生的藻毒素。

上述方法不仅在抑制或杀藻上存在一定缺陷，而且没有综合考虑蓝藻死亡后释放到水体中的藻毒素对水生生物及人类的危害。

去除或降解藻毒素的方法主要有：(1)物理化学降解法：具体地，通过凝固、活性炭吸收、膜处理技术或者uv/h2o2clo2降解藻毒素。凝固、活性炭吸收、膜处理技术虽然能部分降低藻毒素在水中的含量，但这些方法均只能将藻毒素转移到其它的地方并不能有效的将藻毒素降解掉，且耗时耗材料，存在成本高的缺点。氧化降解藻毒素的方法虽然降解效率较高，价格便宜，但氧化剂的杀生能力强，专一性差，且容易与有机污染物反应产生有害人体健康的物质。(2)细菌降解法：该方法利用细沙过滤和含有具有选择性的生物降解菌的生物膜来处理水样，该法经济，但操作繁琐，需要经常更换生物膜，且生物降解菌自身代谢需要消耗养分，容易影响生态系统的稳定性，并可能产生未知次生代谢有毒物质，造成二次污染。(3)生物酶降解法：生物降解酶可以降解藻毒素，使其转变为低毒、无毒的小分子物质，具有专一性、高效性且不会产生有毒物质等特点从而备受关注。

因此，生物酶制剂无疑是目前有效、安全解除藻害对水体及其副产品污染问题的最优方法之一。

如上所述，用杀藻剂(硫酸铜、除草剂等)只杀藻，对藻毒素没有降解作用，一些如物理方法可能对藻毒素有吸附作用，但没有降解作用，只使毒素转移，没有降低或消除。藻毒素降解酶目前的报道都是在于它的降解作用，还没有杀藻作用的报道。也即，除藻和降解藻毒素通常是分开的两个独立步骤，必须分别借助一定的手段(或药剂)实现，难以同时综合治理杀藻和降解藻毒素。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的难以一步实现除藻和降解藻毒素综合治理的缺陷，提供一种mde在抑制蓝藻及降解藻毒素方面的应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了藻毒素降解酶在抑制或杀灭蓝藻中的应用。

本发明第二方面提供了藻毒素降解酶在抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素中的应用。

本发明第三方面提供了一种用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物，该组合物中含有组分a，以及含有组分b和/或组分c，所述组分a为藻毒素降解酶、所述组分b为碳酸氢钙、磷酸氢钾、磷酸氢钠、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵、壳聚糖、三氯化铁和硫酸亚铁中的至少一种，所述组分c为硫酸铝、硫酸铝钾、低聚糖、葡萄糖、淀粉和淀粉衍生物中的至少一种。

本发明第四方面提供了制备用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物的方法，该方法包括：

(1)将能够表达藻毒素降解酶的核苷酸序列转入表达菌株，得到藻毒素降解酶的表达菌；

(2)诱导所述藻毒素降解酶的表达菌表达藻毒素降解酶；

(3)将所得藻毒素降解酶与组分b和/或组分c进行混合。

本发明第五方面提供了上述组合物在抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素中的应用。

本发明通过借助藻毒素降解酶，不仅能够获得特异地抑制或杀灭蓝藻的效果，同时能够降解藻毒素，因此，本发明的藻毒素降解酶能够广泛应用于农业、渔业(包括水产养殖等)生产及水环境污染处理中。

换言之，本发明提供的含有藻毒素降解酶的组合物不仅能够高效地抑制或杀灭蓝藻，选择性保留不释放藻毒素的藻类，而且能够高效专一地降解水体中有毒藻释放的藻毒素，达到蓝藻综合治理中除藻和解毒同时进行的目的，最优化解决藻害导致的水体污染及可能的副产品污染的问题。

附图说明

图1是不同浓度的mde在杀灭铜绿微囊藻905实验中的结果图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

首先，本发明提供了藻毒素降解酶在抑制或杀灭蓝藻中的应用。所述藻毒素降解酶意指各种常见的可以降解藻毒素的酶，一般由鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和青枯菌(pseudomonassolanacearum)表达得到。其中，鞘氨醇单胞菌和铜绿假单胞菌分别以微囊藻毒素酶和碱性蛋白酶降解微囊藻毒素。

优选情况下，所述藻毒素降解酶为mlra蛋白、青枯菌酶、谷胱甘肽转移酶和细胞色素p450氧化酶中的至少一种。mlra蛋白可以为常见的各种mlra蛋白，例如，af411068.1编码的蛋白和/或ab468058.1编码的蛋白。

其次，本发明提供了藻毒素降解酶在抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素中的应用。本发明的发明人发现，藻毒素降解酶在降解藻毒素的同时，能够抑制或杀灭蓝藻。如上所述，优选所述藻毒素降解酶为mlra蛋白、青枯菌酶、谷胱甘肽转移酶和细胞色素p450氧化酶中的至少一种。

本发明中，所述蓝藻为各种引发水污染的常见蓝藻，包括微囊藻(microcystis)(如铜绿微囊藻(m.aeruginosa)、蓝球藻(chroococcus)、颤藻(oscillatoria)、念珠藻(nostoc)(如发菜n.flagelliforme)等。相应地，所述藻毒素为所述蓝藻释放的藻毒素，例如，mc-lr、mc-yr和mc-rr中一种或多种。

再者，本发明提供了一种用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物，该组合物中含有组分a，以及含有组分b和/或组分c，所述组分a为藻毒素降解酶、所述组分b为碳酸氢钙、磷酸氢钾、磷酸氢钠、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵、壳聚糖、三氯化铁和硫酸亚铁中的至少一种，所述组分c为硫酸铝、硫酸铝钾、低聚糖、葡萄糖、淀粉和淀粉衍生物中的至少一种。如上所述，优选所述藻毒素降解酶为mlra蛋白、青枯菌酶、谷胱甘肽转移酶和细胞色素p450氧化酶中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，所述组分b为碳酸氢钙、三氯化铁、硫酸镁、硫酸铵和壳聚糖中的至少一种。

根据本发明，所述淀粉衍生物可以为常见的各种改性淀粉，如羟基化淀粉、酯化淀粉、醚化淀粉、交联淀粉、氧化淀粉等。所述低聚糖可以为常见的各种含有2-10个糖苷键的化合物寡糖，例如麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖等中的至少一种。

根据本发明，对各个组分的含量没有特别的要求，优选地，相对于100重量份的以干基计的所述组分a，所述组分b的含量为0-30重量份，所述组分c的含量为0-10重量份，且所述组分b和所述组分c的含量之和大于0重量份。

根据更优选的实施方式，相对于100重量份的以干基计的所述组分a，所述组分b的含量为0.5-15重量份，所述组分c的含量为1-5重量份。

根据本发明一种特别优选的实施方式，组合物所述组分b为三氯化铁和/或硫酸铵，组分c为淀粉，相对于100重量份的以干基计的所述组分a，所述组分b的含量为5-15重量份，所述组分c的含量为4-5重量份。

本发明中使用的藻毒素降解酶可以为纯化的酶，也可以直接以粗酶液的形式使用。本发明的发明人发现，即使以粗酶液的形式使用，也能够获得较佳的除藻和降解藻毒素的效果，因此，根据本发明的优选实施方式，各处所述及的藻毒素降解酶由通过诱导表达系统表达而得到的粗酶液提供，所述表达系统含有能够表达所述藻毒素降解酶的核苷酸序列。优选地，所述表达系统为大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统和酵母菌表达系统中的至少一种表达系统。构建表达所述藻毒素降解酶的表达系统的方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。所述粗酶液可以通过将诱导表达后所得的培养物进行破壁处理后获得，也可以直接收集培养液获得。粗酶液的干基(蛋白)含量为5-350mg/l。

另外，本发明提供了一种制备上述用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物的方法，该方法包括：

(1)将能够表达藻毒素降解酶的核苷酸序列转入表达菌株，得到藻毒素降解酶的表达菌；

(2)诱导所述藻毒素降解酶的表达菌表达藻毒素降解酶；

(3)将所得藻毒素降解酶与组分b和/或组分c进行混合。

步骤(1)中的表达菌也即可以是如上所述的表达系统中的至少一种。

在步骤(2)中，所述诱导的条件优选包括：诱导前菌液od600为0.5-1.2(更优选为0.9-1.2)，诱导因子为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，诱导温度为10-35℃(更优选为10-22℃)，诱导时间为2-24h(更优选为4-16h)。优选地，所述诱导因子的用量使得诱导体系中的诱导因子的浓度为0.01-5mm，更优选为0.05-1mm。

步骤(3)中，所得的藻毒素降解酶以粗酶液的形式存在，也即经步骤(2)表达获得后直接用于步骤(3)，无需进行纯化，因此，步骤(3)中，所述藻毒素降解酶以粗酶液的形式与组分b和/或组分c进行混合。当藻毒素降解酶为表达菌的胞外产物时，固液分离表达菌的培养液所得液相即为粗酶液。当藻毒素降解酶为表达菌的胞内产物时，将诱导表达后的菌体进行破壁处理即可获得粗酶液。

所述组合物还可以进一步含有载体和/或稀释剂，以将其配制成一定的剂型，例如，粉剂、水合剂、乳剂、水溶剂和可流动剂等。

此外，本发明还提供了以上用于抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素的组合物在抑制或杀灭蓝藻同时降解藻毒素中的应用。

在使用本发明的组合物(酶制剂)时，其用量可以为20-400mg/l藻液。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，在没有特别说明的情况下，使用的各种原料均来自商购。

采用hplc分析藻毒素的量(hplc(安捷伦1200lc)，柱子为eclipsexdb-c18色谱柱(4.6mm×15mm))。其具体方法为：取190μlpbs(ph＝7.5)与10μl藻毒素mc-lr(10μg/ml)混合液来测量降解前的藻毒素的出峰面积和出峰时间，对待测样品中的藻毒素的量进行hplc分析，确定降解后产物中剩余的藻毒素的出峰面积和出峰面积，从而计算藻毒素的含量。

以下制备例和实施例中，lb培养基为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、氨苄青霉素30mg/l。

集胞藻6803、铜绿微囊藻905、铜绿微囊藻912均购自中国科学院水生生物研究生所。

制备例1

本制备例用于说明藻毒素降解酶i的制备方法。

将mlra编码序列(accessionnumber：af411068.1)构建到原核表达载体pmal-c2x上(插入bamhⅰ和hindⅲ酶切位点之间)得到表达mlra的表达载体pmal-c2x-mlra，具体构建方法参见《分子克隆实验指南》第三版(j.萨姆布鲁克等人，科学出版社，2002)第1章和第15章。

将制得的感受态dh5α从冰箱中拿出放于冰上冻融，加入10μl连接产物(表达载体pmal-c2x-mlra)，将ep管重置于冰中30min，然后放入到42℃的水浴中，放置90s，再放入冰中，静置5min。每管加入600μl的lb培养基，在摇床中37℃、180rpm培养70min；然后4000rpm离心，取600μl上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素30mg/l的lb平板上，在37℃恒温箱中培养15h。

将上步平板上长出的单菌落，于含氨苄青霉素30mg/l的lb培养基(20ml)的烧瓶中，37℃、220rpm培养16h，进行活化。将活化后的菌送去英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，测序序列结果显示载入的mlra片段长度为1008bp，在ncbi中通过blast进行比对，比对一致，表明mlra表达菌构建成功。

将通过上述方法成功构建的含有mlra表达载体的菌株活化于20mllb培养基的烧瓶中37℃、220rpm培养16h，取活化后的菌液按1体积％的接种量接种于500mllb培养基中，当菌液的od600为0.6左右时，加入0.5ml的0.5mmiptg诱导剂，在22℃下诱导8小时。然后用高速冷冻离心机(j-26xp，beckman)12000rpm、4℃离心收集诱导后的菌。

将收集的细菌沉淀放在冰上冻融，用30ml柱平衡缓冲液(50mm磷酸缓冲液)悬浮细菌，超声破碎(运行3秒，停3秒，180个循环)至溶液变为半透明状态为止，得到含有藻毒素降解酶的粗酶液(蛋白含量为300mg/l)。

然后将粗酶液用高速冷冻离心机(j-26xp，beckman)12000rpm，4℃离心40min，取上清用0.45μm的滤膜过滤。

将过滤好的上清用再生好的mbp柱树脂4℃结合2h，2h后将粗酶与树脂的混合液倒入空柱中，待其全部加入柱子中后用柱平衡缓冲液(36mmkh2po4，18mmk2hpo4，200mmkcl)冲洗树脂使杂蛋白从树脂上脱落下来，用考马斯亮蓝来检验杂蛋白的量，待考马斯亮蓝不显色后说明杂蛋白已基本洗干净。最后在树脂中加入5ml洗脱缓冲液(0.36g麦芽糖，柱平衡缓冲液100ml)，然后用一干净浓缩管收集目的蛋白同样用考马斯亮蓝检验目的蛋白的量。在4℃下4000rpm离心，浓缩直至蛋白浓度达到1mg/ml以上，得到纯化的藻毒素降解酶i。获得纯化藻毒素降解酶的经sds-page检测显示为藻毒素降解酶mlra。

将所得藻毒素降解酶粗酶液100重量份(以干基计)按照表1示出的比例与组分b和/或组分c进行混合，得到不同的液体酶制剂，见表1的酶制剂1-6。同时，以纯化酶液作为组分a制备酶制剂7，组分b和组分c与酶制剂3相同。

制备例2

本制备例用于说明藻毒素降解酶ii的制备方法。

将mlra编码序列(accessionnumber：ab468058.1)构建到原核表达载体pet22b上(插入bamhⅰ和hindⅲ酶切位点之间)得到表达mlra的表达载体pet22b-mlra，具体构建方法参见《分子克隆实验指南》第三版(j.萨姆布鲁克等人，科学出版社，2002)第1章和第15章。

将制得的感受态dh5α从冰箱中拿出放于冰上冻融，加入10μl连接产物(表达载体pet22b-mlra)，将ep管重置于冰中30min，然后放入到42℃的水浴中，放置90s，再放入冰中，静置5min。每管加入600μl的lb培养基，在摇床中37℃、180rpm培养70min；然后4000rpm离心，取600μl上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素30mg/l的lb平板上，在37℃恒温箱中培养15h。

将上步平板上长出的单菌落，于含氨苄青霉素30mg/l的lb培养基(20ml)的烧瓶中，37℃、220rpm培养16h，进行活化。将活化后的菌送去英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，测序序列结果显示载入的mlra片段长度为1008bp，在ncbi中通过blast进行比对，比对一致，表明mlra表达菌构建成功。

将通过上述方法成功构建的含有mlra表达载体的菌株活化于20mllb培养基的烧瓶中37℃、220rpm培养16-20小时，取活化后的菌液按1体积％的接种量接种于500mllb培养基中，当菌液的od600为1.0时，加入0.5ml的0.5mmiptg诱导剂，在22℃下诱导8小时。然后用高速冷冻离心机(j-26xp，beckman)12000rpm、4℃离心收集诱导后的菌。

将收集的细菌沉淀放在冰上冻融，用30ml柱平衡缓冲液(36mmkh2po4，18mmk2hpo4，200mmkcl)悬浮细菌，超声破碎(运行3秒，停3秒，180个循环)至溶液变为半透明状态为止，得到含有藻毒素降解酶ii的粗酶液(蛋白含量为300mg/l)。

将所得粗酶液100重量份(以干基计)按照表1示出的比例与组分b和/或组分c进行混合，得到不同的液体酶制剂。见表1的酶制剂8-10。

表1

实施例1

藻毒素降解酶抑制蓝藻生长及降解藻毒素的试验

(1)将酶制剂加入到100ml含有较低初始藻细胞浓度(约1.0×10⁵个藻细胞/ml)的培养液中，包括集胞藻6803、铜绿微囊藻905、铜绿微囊藻912，连续处理2，4，6天，观察及检测不同藻类被抑制的情况。其中，不同使用浓度的酶制剂3对铜绿微囊藻905的抑制情况见图1和表3，从中可以看出酶制剂在1l藻液中含有50-400mg时对蓝藻均有很好的抑制效果。此外，测定连续处理6天后的藻液(酶制剂用量为200mg)的od730值，并以“(初始od730值-处理后的od730值)/初始od730值×100％”的计算结果表示抑藻率，抑藻率结果如下表2所示。

表2

表3

从表2的结果可以看出，本发明对集胞藻基本没有抑制作用，进一步的实验显示对小球藻和螺旋藻也不存在抑制作用，而对铜绿微囊藻的抑制活性较高，说明本发明的组合物能够用于特异性地抑制有害蓝藻的生长。

(2)按照步骤(1)的方法处理铜绿微囊藻905的培养液，连续处理6天后，将细胞培养液离心，分为上清液和细胞沉淀。

上清液用于提取胞外藻毒素，具体操作如下：取10ml甲醇、10mlddh2o活化固相萃取小柱(watersoasishlb6cc)，然后将上清液按1ml/min的流速通过活化好的固相萃取小柱，然后重复上样2-3次，以保证藻毒素mc尽可能富集完全。然后用去离子水及10体积％、20体积％的甲醇水溶液依次进行淋洗，再用70体积％或80体积％的甲醇水溶液依次进行洗脱。洗脱液用氮气吹干，再加70体积％甲醇复溶至特定体积，然后通过高效液相色谱法测定藻毒素(mc-lr、mc-rr和mc-yr)的含量。

细胞沉淀用于提取胞内藻毒素，具体操作如下：取细胞冻融两次，超声破碎10分钟，然后离心，取上清液，按1ml/min的流速通过活化好的固相萃取小柱，其余步骤同前。

通过以上方法提取各组试验组的胞内和胞外的藻毒素，并用高效液相色谱法法测定其中藻毒素的含量及总的藻毒素(mcs)含量(见表4)。

表4

从表4中可以看出本发明的酶制剂可以很好地降解释放到水体中的藻毒素。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。