专利名称：一种手性配体交换色谱固定相的制备方法
技术领域：
本发明涉及氨基酸对映体的拆分，具体地说是一种手性配体交换色谱固定相的制备方法。
背景技术：
氨基酸对映体的拆分可采用气相色谱法和液相色谱法，但通常需要进行柱前样品衍生化，衍生化过程不仅费时麻烦，而且有可能使被分析物发生消旋，从而影响分析效果。由Davankov等人于七十年代早期发展起来的手性配体交换色谱法(CLEC)，是拆分手性化合物，特别是氨基酸和羟基酸对映体的一种有效方法，其选择性高，不需要进行柱前衍生化。
以光活性氨基酸或哌可酸作为手性选择子的涂渍、键合相的制备是手性配体交换色谱法发展的主流。中国专利申请(申请号为99117305.8)公开了一种手性配体交换色谱固定相及其制备方法，具体是以L-苯丙氨酸为原料，制备一类新型手性选择子2-(2-羟基-3-烷氧基)丙基-(S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，再将其涂渍于反相色谱键合固定相上；可实现对氨基酸样品的直接拆分；其不足之处在于分离所需时间较长，后流出组分脱尾较严重；相对于键合性固定相来说，涂敷型固定相易流失，限制了它的使用寿命。两种不同键合量的L-脯氨酸硅胶键合手性配体交换固定相的合成(祝馨怡，韩小茜等人《色谱》，2002，20(3)223-226)，利用配体交换色谱法分离了一系列的氨基酸，结果表明键合量不同的固定相对氨基酸的拆分能力差别较大；其仅拆分了数量有限的几种氨基酸，且所需时间较长，后组分脱尾严重。2-(2-羟基-3-烷氧基)丙基-(S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸手性选择子的合成(王群标，龙远德等人《色谱》，2000，18(2)112-114)，制备了两种新型涂渍手性配体交换色谱固定相，拆分了几种氨基酸；因组分保留较强，故需要较长的分析时间。丙基-(S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸为手性选择子(龙远德，王群标等人《高等学校化学学报》，2001，22(4)566-568)以2-(2-羟基-3-烷氧基)，合成了硅胶键合型配体交换色谱固定相，拆分了某些氨基酸，虽实现了对氨基酸的手性分离，但操作在较高温度下进行，且分析时间较长。M.Wachsmann，H.Brückner(Chromatographia，1998，47(11/12)637)使用三氯三嗪先后与甲醇、L-脯氨酸叔丁醚(或N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸叔丁醚)反应后，再与胺丙基硅胶反应，合成新型的配体交换型手性固定相，可拆分氨基酸及其衍生物，但制备过程较烦琐。另有将L-脯氨酸通过不同的间隔臂键合于硅胶(G.Gübitz，S.Mihellyes，G.Kobinger，A.WutteJChromatogr A，1994，66691-97)，在较高温度下拆分了氨基酸及其衍生物；但部分氨基酸分析时间较长。
在以上相关的研究文献中，用不同方法所制备的固定相(所用氨基酸大多为脯氨酸和羟脯氨酸)在对DL-氨基酸进行分离时，一般所需时间较长(后流出组分拖尾严重)，或者需在较高温度下进行分离，不仅使操作复杂，也在很大程度上影响了色谱柱的使用寿命。
发明内容
本发明的目的在于提供一种手性配体交换色谱固定相的制备方法，制得的手性固定相可在常温下对绝大部分天然氨基酸进行分离，分离时间短，操作简单，应用范围较广。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为以L-异亮氨酸(含有两个手性中心)为手性选择剂来制备手性配体交换色谱固定相。
制备过程可以为键合、涂敷以及聚合物类型；键合与涂敷方式中固定相基质材料可以为Al2O3，ZrO2，TiO2或碳微球；键合过程的烷基化试剂可以采用含有环氧基的硅烷化试剂；具体为将酸处理过的固定相基质(硅球)与含有环氧基的硅烷化试剂反应后，加入适量用碳酸钠水溶液处理过的L-异亮氨酸，室温下(15～30℃之间均可)震荡反应24～48小时后，洗涤，干燥；然后与铜离子络合，制得配体交换型手性固定相；所述与铜离子络合具体为将其加入硫酸铜水溶液，震荡几分钟后，放置过夜，抽滤，洗涤，干燥。
以L-异亮氨酸为手性选择剂来制备涂敷以及聚合物类型的手性配体交换色谱固定相可按常规方法操作；可参见(1)袁直，何柄林，中心金属离子及温度对手性识别能力的影响，《离子交换与吸附》，1999，15(6)567-571；在这篇文献中，作者以羟脯氨酸为手性选择剂，以大孔聚乙烯胺树脂为载体，制得手性配体树脂，拆分了一些氨基酸。(2)王群标，龙远德，黄天宝，新型手性配体交换色谱固定相的制备及应用，《色谱》，2000，18(2)112-114；在这篇文献中，作者以异喹啉羧酸为手性选择剂，制备了两种涂敷型配体交换型色谱固定相。
本发明具有如下优点1.操作简单(应用时)。本发明首次使用L-异亮氨酸为手性选择剂通过简单的方法键合于硅胶，制备手性配体交换色谱固定相，在简单的实验条件下，实现对氨基酸、羟基酸等手性物质的直接拆分。
2.分析时间短。采用本发明所制取的L-异亮氨酸手性配体交换色谱固定相，可在常温下对大部分天然α-氨基酸进行基线分离，相对于国内外的其它文献中所述技术，拆分的氨基酸数量较多，分离所需时间也较短(大部分氨基酸分离所需时间在20min以内)。
3.应用范围广。本发明手性选择剂的键合量大(手性配体在键合相的表面浓度为4-5μmol/m2)，故可采用较短的手性柱(10-15cm)，在常温下对大部分氨基酸对映体进行分离或纯度分析，更适合于不对称合成研究及日常氨基酸类药物的分析。
图1为多巴在配体柱上的拆分谱图；图2为丝氨酸在配体柱上的拆分谱图；图3为苯丙氨酸在配体柱上的拆分谱图；图4为蛋氨酸在配体柱上的拆分谱图；图5为天冬酰胺在配体柱上的拆分谱图；图6为天冬氨酸在配体柱上的拆分谱图；图7为苏氨酸在配体柱上的拆分谱图；图8为酪氨酸在配体柱上的拆分谱图；图9为组氨酸在配体柱上的拆分谱图；图10为异亮氨酸在配体柱上的拆分谱图；图11为鸟氨酸在配体柱上的拆分谱图；图12为缬氨酸在配体柱上的拆分谱图；图13为色氨酸在配体柱上的拆分谱图；图14为a-氨基苯乙酸在配体柱上的拆分谱图。
具体实施例方式
实施例1以L-异亮氨酸为手性选择剂的手性配体交换色谱固定相的制备Kromasil球形硅胶瑞典Eka Nobel公司，粒径5μm，比表面340m2/g，孔径10nm；L-异亮氨酸购自Sigma公司(USA)取经酸处理的硅球4.0g，150℃真空干燥4-6小时后，冷却，置于250mL圆底三颈烧瓶中，加入2mL3-缩水甘油丙基三甲氧基硅烷和40ml甲苯，氮气保护下于110℃下搅拌回流6-7小时，冷却，过滤，用甲苯、甲醇、丙酮依次洗涤数次，50℃真空干燥2小时，得3-缩水甘油丙基硅胶；取3.93gL-异亮氨酸，加入相当量的碳酸钠(例0.03mol异亮氨酸用0.015mol碳酸钠处理)和适量水，搅拌溶解后，蒸至近干，加入40ml甲醇，再加入上步制得的3-缩水甘油丙基硅胶，室温下震荡反应24～48h(即室温较高时，反应时间可缩短，室温较低时，反应较长时间)，过滤，依次用甲醇、水洗涤数次，室温下真空干燥；将产物加入15％硫酸铜(或醋酸铜)水溶液中，震荡5min后，放置过夜；过滤，用水洗涤2-3次，室温下真空干燥2小时后即得配体交换手性固定相。
手性固定相的合成
所制得的固定相对常见氨基酸的拆分以四氯化碳∶二氧六环(2∶1)为匀浆液，乙醇为顶替液。色谱柱尺寸为150mm×4.6mmi.d.，不锈钢柱。
以0.1 mmol/L CuSO4为流动相，在常温下考察了色谱柱对1 6种常见氨基酸的拆分。除丙氨酸和亮氨酸外无拆分效果外，大部分的氨基酸可在常温下被很好拆分。(所得结果见所附表一、说明书附图)表一14种DL-氨基酸在L-异亮氨酸手性配体交换色谱固定相上的拆分
流动相10-4mol/L CuSO4流速1mL/min柱温20℃，检测波长223nm
权利要求
1.一种手性配体交换色谱固定相的制备方法，其特征在于以L-异亮氨酸为手性选择剂来制备手性配体交换色谱固定相。
2.按权利要求1所述制备方法，其特征在于制备过程可以为键合、涂敷以及聚合物类型。
3.按权利要求2所述制备方法，其特征在于键合与涂敷方式中固定相基质材料可以为Al2O3，ZrO2，TiO2或碳微球。
4.按权利要求2或3所述制备方法，其特征在于键合过程的烷基化试剂可以采用含有环氧基的硅烷化试剂。
5.按权利要求4所述制备方法，其特征在于具体操作过程如下将酸处理过的固定相基质与含有环氧基的硅烷化试剂反应后，加入用碳酸钠水溶液处理过的L-异亮氨酸，室温下震荡反应24～48小时后，洗涤，干燥；然后与铜离子络合，制得配体交换型手性固定相。
6.按权利要求5所述制备方法，其特征在于所述与铜离子络合具体操作过程为将键合后的产物加入铜盐水溶液，震荡反应后，放置过夜，抽滤，洗涤，干燥。
全文摘要
本发明涉及氨基酸对映体的拆分，具体地说是一种手性配体交换色谱固定相的制备方法；以L－异亮氨酸为手性选择剂来制备手性配体交换色谱固定相。本发明具有如下优点1)操作简单(应用时)，在简单的实验条件下，实现对氨基酸、羟基酸等手性物质的直接拆分；2)分析时间短，相对于国内外的其它文献中所述技术，拆分的氨基酸数量较多，分离所需时间也较短；3)应用范围广，在常温下对大部分氨基酸对映体进行分离或纯度分析，更适合于不对称合成研究及日常氨基酸类药物的分析。
文档编号B01D15/08GK1538171SQ03111490
公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月18日 优先权日2003年4月18日
发明者丁国生, 黄晓佳, 刘莺, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所