一种大分子色素蛋白的吸附基质及应用的制作方法

文档序号:4902880阅读:302来源:国知局
专利名称:一种大分子色素蛋白的吸附基质及应用的制作方法
技术领域
本发明涉及吸附剂的制备,具体地说是壳聚糖一氨基酸共聚孔球作为大分子色素蛋白的吸附基质及应用。
背景技术
壳聚糖是自然界中极为丰富的天然资源,它具有良好的生物亲和性,可以生物降解,又具有良好的生物相容性及抗凝血性,因而在高分子药物缓释方面具有很大的应用潜力,但由于其降解速度过快,在酸性条件下不稳定,易于溶解,所以其应用受到一定的限制。分子链上有丰富的胺基和羟基,易于进行化学修饰。
高分子微球是性能优异的功能高分子材料,在医学免疫、生物工程、化学工业、分析化学及微电子等领域有着极其广阔的应用前景。
壳聚糖微球的制备有交联法和反相电荷沉淀法。目前对壳聚糖微球的改性多是在壳聚糖分子引入相应基团,而后进行交联制球。而这种方法往往因活性胺基减少或空间位阻等原因,成球效果不好。
藻蓝蛋白与藻红蛋白是一种大分子色素蛋白,在适宜的波长光的激发下,能产生单线态氧和其它的氧自由基,具有光敏性,用藻蓝蛋白与藻红蛋白介导光动力反应可以治疗肿瘤。藻蓝蛋白与藻红蛋白有望成为新一代的抗肿瘤药物,但由于其为多肽类化合物,易于被胃肠道的消化酶所降解,生物半衰期短。因此尚需寻找一种合适的剂型。

发明内容
本发明的目的在于提供一种对藻胆蛋白具有高吸附容量的大分子色素蛋白吸附基质。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为一种大分子色素蛋白的吸附基质壳聚糖—氨基酸共聚孔球。
所述壳聚糖—氨基酸共聚孔球的制备过程如下,按比例将壳聚糖和氨基酸配制成水相溶液,向该溶液中加入致孔剂,分散在油相分散相(如甲苯)中,搅拌下滴加交联剂(以SP80作乳化剂),升温至40-70℃固化,制成壳聚糖—氨基酸共聚孔球。
所述将壳聚糖和氨基酸配制成水相溶液是指将壳聚糖和氨基酸溶解于一价的酸溶液(如体积浓度5%的醋酸溶液)中。壳聚糖只能溶于酸性介质中,实验表明无论是在无机酸,还是在有机酸中,它只溶于一价的稀酸溶液中,不溶于二价的稀硫酸和草酸以及三价的稀磷酸等酸性介质中.用HA代表溶剂酸,Chitosan-NH2代表壳聚糖,则壳聚糖溶于酸性介质时可用下式表示
壳聚糖不溶于稀硫酸,草酸和磷酸中,可能是因为这些阴离子与分子链间有较强的静电作用,形成了胶束状结构,因而使壳聚糖不能进入水溶液中得以溶解。
所述壳聚糖与氨基酸的氨基摩尔比通常为1∶1-1∶0.5(Ncs∶Ngly=1∶1-1∶0.5cs-壳聚糖,gly-甘氨酸);水相溶液中的壳聚糖重量体积(W/V)浓度通常为3-8%;水相溶液与油相的水油比(W/O)为1∶1.5-1∶3;滴加交联剂后通常控制nNH2∶nCHO=1∶1-1∶4。
交联剂可采用戊二醛或环氧氯丙烷。前者对壳聚糖的交联发生在胺基上,后者则既可发生在胺基上,又可发生在羟基上。
分散相可采用苯、液腊、四氯化碳、甲苯等。依据微粒的密度和粒径大小的需要进行选择。选择的标准是1微粒或液滴悬浮在分散相中2要求微粒的粒径大,选用粘度小的分散相;反之,则选用粘度大的分散相。必要时,加入乳化剂和高分子表面活性剂帮助分散。本发明采用甲苯作分散相。
乳化剂乳化剂可分为亲油性和亲水性两类,以HLB值表示—100%亲油性的乳化剂HLB为0,100%亲水性,HLB为20,其间20等分。值高亲水性大,值低亲油性高。加入乳化剂目的一是可降低两相间的界面张力,使壳聚糖溶液更易于分散成小液滴,二是吸附在液珠的表面,保护液珠在彼此碰撞时不至于合并、粘结。常用的乳化剂有SPAN系列(包括SP20,SP40,SP60,SP80等),TWEEN系列(包括TW20,TW40,TW60,TW80),SPAN系列属于亲油的,而TWEEN系列是亲水的,一般地说,随着数值的增大,其亲油性基本是增大的。在本发明中,采用亲油性的SP系列要比亲水性的TWEEN系列效果好。(HLBSP20 8.6,SP40 6.7,SP60 4.7,SP80 4.3;TW20 16.7,TW40 15.6,TW60 14.9,TW80 15.6)致孔剂在聚合过程中加入致孔剂,在网络骨架固定化和链结构单元形成的过程中,致孔剂为填充其中的惰性分子,可起到预先留下孔道的作用。在骨架固定后,将致孔剂抽提出去,留下永久性孔道。
根据不同的孔径要求,可以采用溶剂致孔和线形高分子致孔。在本发明中,溶剂致孔可采用乙酸乙酯,线形高分子致孔可采用聚乙二醇等。本发明采用乙酸乙酯作为致孔剂,在致孔剂与壳聚糖溶液的体积比为0.25∶1-1∶1之间孔度随致孔剂的用量的增多而增大。
制备好的微球加入硼氢化钠的碱性溶液还原;实验中所用氨基酸可以根据被吸附大分子色素蛋白所需适宜的PH值选择合适等电点的氨基酸。
所述吸附基质作为大分子色素蛋白的吸附载体,大分子色素蛋白可为藻蓝蛋白或藻红蛋白;其中,藻蓝蛋白分子量为138KD,藻红蛋白分子量为240KD,等电点均介于4和5之间。
本发明具有如下优点1.开创了一种新的对壳聚糖改性的方法。以往对壳聚糖的改性多是利用与其活泼胺基或羟基反应直接引入,本发明提供的方法可通过共聚的方式将氨基酸中的羧基巧妙引入壳聚糖(在壳聚糖微球中引入—COOH)。
2.蛋白吸附容量高。藻胆蛋白是一种分子量高达十万道儿顿以上的高分子蛋白质,一般的凝胶球对其吸附容量很有限。本发明所提供的共聚孔球对藻红蛋白的吸附容量可达18.074mg/g,对藻蓝蛋白的吸附高达39.013mg/g。
3.吸附范围广。可根据不同蛋白的特性,选用不同的氨基酸共聚(已合成出壳聚糖-赖氨酸、壳聚糖-苯丙氨酸、壳聚糖-天冬氨酸等几种微球)。


图1为壳聚糖—氨基酸共聚孔球整体照片;图2为壳聚糖—氨基酸共聚孔球表面照片;图3为壳聚糖—氨基酸共聚孔球对藻红蛋白的吸附平衡曲线;图4为壳聚糖—氨基酸共聚孔球对藻蓝蛋白的吸附平衡曲线。
图中,系列1交联剂为戊二醛,系列2为环氧氯丙烷;由图中可以看出,共聚孔球对藻胆蛋白的吸附在两小时内就基本达到平衡。
具体实施例方式
实施例1壳聚糖—甘氨酸共聚孔球的制备称取2g壳聚糖和0.93g的甘氨酸,溶于40ml 5%的醋酸中,制得壳聚糖—甘氨酸混合液,在该混合溶液中加入10ml乙酸乙酯。将此混合液分散于120ml甲苯(含1%(v/v)SP80)中,待分散均匀后,加入25%的戊二醛(保持n-NH2∶n-CHO=1∶4),待凝胶化完成后,加入5%的NaOH溶液,调节pH在10左右,升温至40℃反应1h,再升温至70℃反应2h,使球固化,然后过滤,甲苯、乙醇洗涤后,再用蒸馏水淋洗树脂,洗掉多余的戊二醛与小分子化合物,最后以乙醇洗涤,干燥,得共聚孔球(参见图1、2)。
共聚孔球对藻红蛋白的吸附静态吸附称取壳聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克,在锥形瓶,加入一定浓度的藻红蛋白(藻胆蛋白具有光敏性,试液及取样都需避光保存)溶液20ml;将小球加入锥形瓶中,放入摇床上摇动,设定温度37℃;以缓冲液为空白对照,每隔一定时间取样,如分别在开始和0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取样,取完后用分光光度计测其OD值,根据OD值与浓度的关系确定吸附量,以吸附量对时间作图,得吸附平衡曲线。(参见图3系列1)。
动态吸附称取一定量的共聚孔球,作为吸附载体装入玻璃层析管,加入一定浓度(可以根据经验和所用仪器的灵敏度目测蛋白浓度,只要在仪器相对准确的浓度范围内就应该可以,并不需要特别指定蛋白浓度)的藻红蛋白溶液,控制柱子流速,使得每15分钟(通常5分钟以上即可,目的是使球内部空隙也有蛋白溶液经过,充分利用所有可吸附表面积)色素蛋白恰好全部流出层析管;收集流出的色素蛋白溶液,再次加入层析管,进行吸附操作。如此反复进行10次(不一定就是10次,可为多次,目的是让小球充分吸附蛋白),使孔球吸附的色素蛋白达到饱和,之后,取出少量样品,测定其OD值。根据吸附前后光吸收的变化可以得到被吸附藻红蛋白的量,测的最大吸附容量为18.074mg/g(被吸附的蛋白量/球的干重)。
实施例2称取2g壳聚糖和0.93g的甘氨酸(Ncs∶Ngly(壳聚糖—甘氨酸的氨基摩尔比)=1∶1),溶于40ml体积浓度5%的醋酸中,制得壳聚糖—甘氨酸混合液,在该混合溶液中加入20ml乙酸乙酯。将此混合液分散于120ml甲苯(含1%(v/v)SP80)中,待分散均匀后,加入10ml预交联剂甲醛,15min后,加入10ml 25%的戊二醛(保持n-NH2∶n-CHO=1∶4),待凝胶化完成后,加入5%的NaOH溶液,调节pH在10左右,分两次加入3.5ml环氧氯丙烷,升温至40℃反应1h,再升温至70℃反应2h,使球固化,然后过滤,甲苯、乙醇洗涤后,再用蒸馏水淋洗树脂,最后以乙醇洗涤,干燥,得共聚孔球。
静态吸附称取壳聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克,置于锥形瓶,加入藻红蛋白溶液1.5ml,用蒸馏水稀释至20ml。将小球加入锥形瓶中,放入摇床上摇动,设定温度37℃。以蒸馏水为空白液,分别在开始和0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取样,取完后用分光光度计测其OD值,根据OD值与浓度的关系确定吸附量,以吸附量对时间作图,得吸附平衡曲线(参见图3系列2)。
动态吸附称取一定量的共聚孔球,作为吸附载体装入玻璃层析管,加入一定浓度的藻红蛋白溶液,控制柱子流速,使得每15分钟色素蛋白恰好全部流出层析管;收集流出的色素蛋白溶液,再次加入层析管,进行吸附操作。如此反复进行10次,使孔球吸附色素蛋白达到饱和,之后,取出少量样品,测定其OD值。根据吸附前后光吸收的变化可以得到被吸附藻红蛋白的量,测得最大吸附容量为11.214mg/g。
实施例3静态吸附称取实施例1所制得的壳聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克,置于锥形瓶锥形瓶,加入藻蓝蛋白溶液1.5ml,用蒸馏水稀释至20ml。将小球加入锥形瓶中,放入摇床上摇动,设定温度37℃。以蒸馏水为空白液,分别在开始和10min,30min,1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取样,取完后用分光光度计测其OD值,根据OD值与浓度的关系确定吸附量,以吸附量对时间作图,得吸附平衡曲线(参见图4系列1)。
动态吸附称取一定量的实施例1中所制得的壳聚糖—甘氨酸共聚孔球,作为吸附载体装入玻璃层析管,加入一定浓度的藻蓝蛋白溶液,控制柱子流速,使得每15分钟色素蛋白恰好全部流出层析管;收集流出的色素蛋白溶液,再次加入层析管,进行吸附操作。如此反复进行10次,使孔球吸附色素蛋白达到饱和,之后,取出少量样品,测定其OD值。根据吸附前后光吸收的变化可以得到被吸附藻蓝蛋白的量,测得最大吸附容量为39.013mg/g。
实施例4静态吸附称取实施例2中所制得的壳聚糖—甘氨酸共聚孔球0.5克,置于锥形瓶,加入藻蓝蛋白溶液1.5ml,用蒸馏水稀释至20ml。将小球加入锥形瓶中,放入摇床上摇动,设定温度37℃。以蒸馏水为空白液,分别在开始和10min,30min,1.0h、1.5h、2.0h、2.5h取样,取完后用分光光度计测其OD值,根据OD值与浓度的关系确定吸附量,以吸附量对时间作图,得吸附平衡曲线(参见图4系列2)。
动态吸附称取一定量的实施例2中所制得的壳聚糖—甘氨酸共聚孔球,作为吸附载体装入玻璃层析管,加入一定浓度的藻蓝蛋白溶液,控制柱子流速,使得每15分钟色素蛋白恰好全部流出层析管;收集流出的色素蛋白溶液,再次加入层析管,进行吸附操作。如此反复进行10次,使孔球吸附色素蛋白达到饱和,之后,取出少量样品,测定其OD值。根据吸附前后光吸收的变化可以得到被吸附藻蓝蛋白的量,测得最大吸附容量为31.472mg/g。
权利要求
1.一种大分子色素蛋白的吸附基质,其特征在于所述吸附基质为壳聚糖—氨基酸共聚孔球。
2.按照权利要求1所述吸附基质,其特征在于所述壳聚糖-氨基酸共聚孔球的制备过程如下,将壳聚糖和氨基酸配制成水相溶液,加入致孔剂,分散在油相分散相中,搅拌下滴加交联剂,制成壳聚糖-氨基酸共聚孔球。
3.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述将壳聚糖和氨基酸配制成水相溶液是指将壳聚糖和氨基酸溶解于一价的酸溶液中。
4.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述壳聚糖与氨基酸的氨基摩尔比为1∶1-1∶0.5。
5.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述水相溶液的壳聚糖重量体积浓度为3-8%。
6.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述水相溶液与油相的水/油比为1∶1.5-1∶3。
7.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述滴加交联剂后控制nNH2∶nCHO=1∶1-1∶4。
8.按照权利要求2所述吸附基质,其特征在于所述氨基酸为甘氨酸。
9.一种权利要求1所述大分子色素蛋白吸附基质的应用,其特征在于所述吸附基质作为大分子色素蛋白的吸附载体,大分子色素蛋白为藻蓝蛋白或藻红蛋白;其中,藻蓝蛋白分子量为138KD,藻红蛋白分子量为240KD,等电点均介于4和5之间。
全文摘要
本发明涉及吸附剂的制备,具体地说是壳聚糖-氨基酸共聚孔球作为大分子色素蛋白的吸附基质。本发明的优点为开创了一种在壳聚糖微球中引入-COOH的新方法;合成了一种对大分子色素蛋白具有较高吸附容量的共聚孔球。
文档编号B01J20/26GK1739850SQ20041005032
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者王广策, 薛志欣, 牛建峰, 夏好学, 曾呈奎 申请人:中国科学院海洋研究所
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