专利名称：高亲和力金属镍结合肽及其应用的制作方法
所属领域本发明涉及一组能够特异结合金属镍的高亲和力结合肽。本发明还涉及这些高亲和力镍结合肽在环境保护、生物开矿和蛋白质纯化中的应用。
背景技术：
金属镍作为生产高科技电子产品的一种重要原料，在生产生活中起着重要的作用。但同时，镍也成为这些产品的生产使用过程所产生的污染物之一。它作为重金属，是一种持久性微量毒害污染物，在环境中日趋积累，并很容易通过食物链富集，对地球上生物的生存构成严重威胁，已成为一种全球性公害，而我国每年由此造成的经济损失达数百亿元。同时，在开采金属矿藏过程中，传统的、甚至简单粗暴的开采方法，造成资源的极大浪费，并且严重的污染环境、破坏生态平衡，与可持续发展策略相违背。
利用生物技术进行环境污染修复、矿产的开发，有可能成为一条有效、生态的途径，从而带来巨大的生态效益、社会效益和经济效益，已成为各国关注的领域。微生物吸附剂利用微生物特性，吸附溶液中的金属，从而实现金属污染物的清除或目标金属的富集。这一纯生态过程，具有速度快、效率高、成本低、反应条件温和，尤其是无二次污染等显著优点。
高亲和力的金属结合肽的获得，对微生物吸附剂的制备至关重要。人们根据金属结合蛋白或某些蛋白中结合金属的结构域组成特点，设计合成了一些金属结合肽，如小肽“HP”(GHHPHG)、“CP”(“GCGCPCGCG”)，但这些小肽的亲和力还不能满足要求。而生物文库技术，则提供了一条快捷、高效的获得高亲和力金属结合肽的方法。2003年，Teruhiko等人运用噬菌体随机十二肽库筛选出锌特异性结合肽(Matsubara T，et al.Selection of novel structural zincsites from a random peptide library.FEBS Letters，2003，555317-321)。
但是随机肽库具有自身的局限性，如由于目前技术条件所限，细菌转化效率低，实测库容量(complexity)常常比理论多样性(diversity)低几个数量级，这样肽库本身存在一定的偏性，可能导致一些展示高亲和力多肽的克隆丢失。为了克服这一不足，人们又基于完全随机(初级肽库)提出的“偏性随机肽库”这一概念。构建初级肽库时，编码外源肽的DNA片段各位置四种碱基等频率出现，理论上表达的多肽也是由各种氨基酸随机组成。对于特定的研究对象，通过筛选初级肽库，可获得具有保守序列的结合肽，或通过分析与其作用的蛋白分子氨基酸组成特点，便可能发现其中起关键作用的氨基酸残基。偏性肽库的构建就是在设计外源片段时，将这些关键氨基酸固定于特定的位置，而其它位置上的氨基酸为随机的。在初级文库基础上构建的偏性肽库，也称为二级/次级肽库，进而引伸出三级甚至更高级肽库。进一步筛选偏性肽库就可能得到更高亲和力、特异性的结合肽，从而实现亲和力成熟的目的(Urbanelli L.，et al.“Affinity maturation”of ligands for HCV-specific serum antibodies.J ImmunolMethods，2000，236167-176)。
此外，目前蛋白亲和纯化中常用的固定金属亲和层析树脂多使用镍离子，因而与镍高亲和力结合的小肽可以作为蛋白表达产物的纯化标签，如6×His标签。
发明内容
我们设计、构建了两个细菌鞭毛展示的偏性随机肽库，从中筛选出特异的镍结合肽，这些结合肽具有高亲和力。
本发明的目的是提供一类能够特异结合金属镍的高亲和和力的小分子多肽。
本发明的另一目的是提供这些高亲和力的镍结合肽在环境保护、矿藏开采、蛋白纯化领域中的用途。
本发明的高亲和力的镍结合肽，是具有以下通式结构的7肽X-R-H-B-H-R-X，其中，X代表任何天然L-型氨基酸残基或D-型异构体，R代表精氨酸残基，H代表组氨酸残基，B代表组氨酸残基或精氨酸残基。
具有上述结构模式的多肽能够与金属镍特异结合。具体表现为，具有上述结构的多肽无论以何种形式，如细菌表面展示、化学合成、或基因工程方法重组表达，都能够与金属镍特异结合，吸附溶液中的镍离子或结合固定于树脂等介质上的镍。
本发明的小分子多肽可通过本技术领域的常规方法，如化学合成、或基因工程方法重组表达的方法制得。
本发明对研制镍的微生物吸附剂具有重要意义，并具有巨大的生态效益、社会效益和经济效益。另外，高亲和力的镍结合肽在设计新的蛋白纯化标签中也具有应用前景。
本发明构建的肽库是通过使用pFliTrx N载体(Invitrogen)，外源肽插入到大肠杆菌硫氧环蛋白(thioredoxin，Trx A)一个结构致密的活性环区中，Trx A则插入鞭毛蛋白中，外源肽以相对稳定的构象展示于细菌表面。将片段退火补平形成具有平滑末端的双链，经过Cpo I与Nco I的双酶切，将其插入pFliTrx N表达载体。并通过电转化的方法将重组子导入到宿主菌内获得次级文库。
图1合成的偏性随机肽的寡核苷酸序列
斜体示保护碱基，下划线示酶切位点，阴影示linker。SGL1、SGL2分别代表两个偏性随机肽库，P代表合成的寡核苷酸正义链，N代表合成的寡核苷酸反义链。X代表随机的氨基酸残基，H代表固定的组氨酸残基，脚注数字代表氨基酸残基的个数。
图2细菌克隆固定镍结合实验结果阴性对照为C(代表初级肽库)、SGL1、SGL2(分别代表两个偏性随机肽库)，阳性对照为SGL7H(代表镍结合肽HHHHHHH)，**代表结合肽2022与克隆SGL7H对固定镍的相对结合力有显著性差异(P＜0.01)。
图3细菌克隆的游离镍离子竞争抑制实验结果阴性对照为C(代表初级肽库)、阳性对照为SGL7H(代表镍结合肽HHHHHHH)。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细地描述。
实施例1 偏性随机肽库的构建1.寡聚核苷酸的设计与合成。随机区采用NNK(T/G)的简并寡核苷酸的设计，固定的组氨酸依照大肠杆菌偏爱的密码子翻译成核酸序列，并在两端加入酶切位点及保护碱基。化学合成法获得两条寡核苷酸链(参见附图1)。
2.肽库基因的获得。分为两步(1)退火，反应体系为等摩尔两条核苷酸链，10×退火缓冲液(500mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，10mM EDTA)，加水补足50μl。水浴锅中加热至95℃，缓慢冷却至室温。(2)补平，在补平反应体系中进行，体系中包括10×klenow缓冲液，10mM dNTPs，klenow酶(NewEngland Biolab公司产品)和退火反应体系。将退火产物补平成平滑末端。
3.pFliTrx-SGL重组子的构建。分为三步(1)酶切，分别对载体与基因片段进行Cpo I和Nco I的双酶切(TaKaRa公司产品)。30℃水浴6小时，再37℃水浴10小时，终产物用超滤管纯化回收(Millpore公司产品)。(2)pFliTrx和基因片段以摩尔比1∶3混合，10×T4DNA连接缓冲液40μl，T4DNA连接酶(12u/μl)10μl，加水至总体积400μl，分装后，16℃水浴过夜。
4.转化。大肠杆菌GI826(Invitrogen公司产品)按照产品说明书的制备方法制备电转化感受态细胞。取感受态细胞50μl，加入纯化浓缩后的连接产物1μl，冰浴30分钟后，用电转仪(Bio-Rad公司产品)进行转化，迅速加入1ml SOC培养基(室温)，移入转化管中冰浴，将其余连接产物分几次转化。将含全部转化产物的2～3ml SOC培养基，37℃200r/min振摇45min，取10μl菌液适当稀释后涂布于RMG-Amp培养板，于30℃培养箱中倒置培养过夜，计数原始细菌克隆。其余菌液加入到10ml IMC培养基中，25℃振荡培养15～18h，取样铺平板计数，余者加甘油至终浓度为25％，分装成若干管，-70℃冻存。
5.肽库的鉴定。两个偏性肽库的库容量分别为5.05×105cfu，3.62×105cfu。经扩增，两肽库的细菌克隆数分别为4.0×107cfu/ml，1.8×107cfu/ml。对原始重组菌克隆进行序列测定，各位置碱基出现频率与理论值接近。因而，所构建的两个肽库随机核苷酸出现的频率均满足设计要求。分析推导出的氨基酸序列，85％以上的氨基酸出现频率与理论频率较为一致，达到建库的要求。
实施例2偏性随机肽库的筛选1.亲和筛选过程，分为步(1)扩增取肽库50μl加入到2ml IMC中，25℃225-250r/min振荡培养12-16h，测定OD600(1OD约1×109个细菌)。(2)诱导将扩增后的细菌以2×108cfu/ml的浓度接种至5ml IMC培养基中，加入终浓度100μg/ml色氨酸诱导，25℃225-250r/min振荡培养6h。(3)孵育用无菌PBS洗涤镍螯合酶联条(QIAGEN公司产品)2次；取诱导后菌液(含4×108个细菌)与1％BSA、1％α-甲基甘露糖苷充分混匀后，室温孵育30min，然后加入酶联孔中，每孔200μl；室温轻轻摇动孵育60min。(4)洗涤移去未结合的菌体，用无菌PBS洗涤4次，每次1min。(5)洗脱每孔加入150μl IMC培养基，室温剧烈振荡1min，洗脱结合的菌体。
2.涂板计数用IMC培养基适当稀释洗脱液，取适量涂布于RMG-Amp培养板，待菌液干后，于30℃培养箱中倒置培养过夜，计数细菌克隆数。
3.扩增洗脱产物洗脱产物除涂板计数部分外，其余均扩增用于下一轮筛选。扩增的具体步骤同实施例2中1。
4.结果分别通过四轮富集，从两个肽库获得的序列中共挑出37个克隆测序，分析这些序列，得到保守序列“X-R-H-B-H-R-X”(X代表任何天然氨基酸残基，R代表精氨酸残基，H代表组氨酸残基，B代表组氨酸残基或精氨酸残基。)实施例3镍结合肽与固定镍的结合能力1.结合实验，分别5步(1)清洗用无菌PBS洗涤镍螯合的酶联孔2次。(2)结合用IMC培养基稀释诱导后的菌体，每孔加入200μl稀释菌液(含2×108个细菌)，室温轻轻摇动孵育60min。(3)清洗移去未结合的菌体，用无菌0.5％PBST洗涤4次，每次1min。(4)洗脱每孔加入150μl IMC培养基，室温剧烈振荡1min，洗脱结合的菌体；重复一次，将两次洗脱液合并。(5)涂板计数。
2.实验结果以结合肽2022(LRHRHRR)为例，以公认的多聚组氨酸(7×His)为阳性对照。二者的结合固定镍的相对结合力统计学上有显著性差异(2022＞7×His)(参见附图2)。
实施例4游离镍离子竞争镍结合肽与固定镍的结合1.结合实验，分别5步(1)清洗用0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)洗涤镍螯合的酶联孔2次。(2)竞争结合将诱导后的菌体4,000r/min离心5min，用无菌0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)轻柔重悬，将菌液与不同浓度NiCl2溶液混和，每孔加入200μl二者的混和物(含2×108个细菌)，室温轻轻摇动孵育60min。(3)清洗移去未结合的菌体，用无菌0.85％NaCl(5mmol/L HEPES，pH 7.1)洗涤2次；再用无菌0.5％PBST洗涤4次，每次1min。(4)洗脱每孔加入150μl IMC培养基，室温剧烈振荡1min，洗脱结合的菌体。(5)涂板计数。
实验结果结合肽SGL7H、2022与固定镍的结合均可被溶液中的镍离子所抑制，且随着镍离子的浓度提高，竞争抑制作用明显增强，最大抑制率均在95％以上(参见附图3)。
权利要求
1.高亲和力的镍结合肽，具有以下通式结构的氨基酸组成X-R-H-B-H-R-X，其中，X代表任何天然L-型氨基酸残基或D-型异构体，R代表精氨酸残基，H代表组氨酸残基，B代表碱性氨基酸残基。
2.如权力要求1所述的高亲和力的镍结合肽，其特征在于B代表组氨酸残基。
3.如权力要求1所述的高亲和力的镍结合肽，其特征在于B代表精氨酸残基。
4.如权力要求3所述的高亲和力的镍结合肽，其特征在于氨基酸组成为L-R-H-R-H-R-R。
5.如权力要求1至4中的任意一项所述的高亲和力的镍结合肽在制备镍的微生物吸附剂中的应用。
6.如权力要求1至4中的任意一项所述的高亲和力的镍结合肽在设蛋白质纯化标签中的应用。
全文摘要
本发明涉及一组能够特异结合金属镍的高亲和力结合肽。该结合肽的氨基酸组成为X－R－H－B－H－R－X，其中，X代表任何天然L－型氨基酸残基或D－型异构体，R代表精氨酸残基，H代表组氨酸残基，B代表组氨酸残基或精氨酸残基。本发明的结合肽可应用于制备镍的微生物吸附剂和设计蛋白质纯化标签。
文档编号B01J20/22GK1911956SQ20051009028
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者董洁, 薛沿宁, 柳川, 邵宁生, 张 杰, 刘农乐, 王芳, 高波, 范明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所