利用液滴驱动、搅拌和蒸发的生物传感器检测的制作方法

专利名称：利用液滴驱动、搅拌和蒸发的生物传感器检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及微流体技术，换句话说，涉及微升体积液体样品的转运和处理。更具体 地讲，本发明致力于通过处理呈离散的流动液滴形式的样品体积，然后在将该液滴在一个传 感器或多个传感器上进行搅拌、蒸发或驱动，从而改进生物传感器检测的问题。
背景技术：
许多生物传感器的关键性能标准是它们检测低浓度的靶生物分子的能力(至于生物 分子，我们这里是指蛋白质、核酸、多糖、脂类及其它有代表性的生物机体的有机分子；有 时候该标靶包括小颗粒例如细胞的细胞器或者组分，而不是单独的生物分子)。这项任务有 许多困难，因为1)特定的耙生物分子通常随机地分布于整个样品体积中而不是集中在传感 位点；2)在样品内存在的其它非靶分子或非特定的分子可能会降低传感器响应，导致假阳性、 或者导致在内部由背景噪声屏蔽了靶生物分子检测；以及3)捕获的耙分子的实际检测可能 需要将二级标记物和/或反应底物用于传感器。
不同于只依靠无规则的扩散效应以将靶分子送至接近传感器，人们已使用多种样品 处理策略以改进生物传感器检测。这些技术包括1)在传感位点浓縮或者集中靶分子；2) 在传感位点循环或搅拌样品体积；以及3)提供反应底物或其它使检测能够进行或者放大的 材料。这些方法普遍使用于生物传感器、芯片实验室、微型全分析、微阵列和其它微流体技 术应用；然而，这些技术的每一种都有其缺点。
经过电泳技术或者其它的亲和性手段在样品体积内集中或者浓縮靶分子还可能浓縮干扰性非耙分子，该干扰性非靶分子可以被相同的本用于浓缩靶分子的效应所吸引。因此， 也必须包含典型地可通过阀门和泵完成的洗涤传感器位点的方法，以除去这些非靶分子。通 常情况下，靶分子会与传感位点相互作用，并且会阻止通过洗涤以除去非靶分子的这种去除。 当通过使用电泳而进行浓缩时若一些或全部耙分子荷电不充分，以及/或者通过使用亲和性方 法向—进行浓缩时若缺乏表征性，浓缩还可能会失败。
不同于利用电泳进行集中、或者别的方式来从样品体积里面浓縮靶分子， 一些技术 设法通过在传感位点处循环或者搅拌全部样品体积来提高检测概率。循环和搅拌效应不但使 新的耙分子与传感位点相接触，并且用来从传感位点洗涤或者除去非靶分子。然而，为循环 或者搅拌全部样品体积，典型地需要进行麻烦的封闭、装阀、和昂贵的机械的、气动的、或 表面声波方法。这种复杂性很可能会阻碍将这些技术应用于含有许多生物传感器和/或高度分 布的生物传感器的系统。
—旦靶分子被传感位点捕获，就经常需要在传感位点用标记物或反应溶液处理捕获 的耙分子，以使检测能够进行、放大检测，并且/或者对捕获的靶分子进行定量。例如，可以 将已进行荧光标记的抗体和对靶分子具有特异性的抗体导入传感位点，以产生与捕获耙分子 的数目成比例的光学标记。对于一些电子传感器，可以导入底物溶液以产生与捕获靶分子的 数目成比例的电子信号，该底物溶液可与捕获的靶分子(或联接于靶分子的酶)发生特异性 反应、从而释放出可被传感器直接检测的分子。然而对于这两种情况，当指示剂或者标志信 号随时间而变时，在供给反应溶液中需要准确定时以实现精确的对比。不幸的是，泄漏的阀、 通道中的气泡、毛细管润湿特性的变化、甚至样品和试剂手动加载中的差异经常会损害这些 反应溶液微流体传送的准确定时。


图1所示为在EWOD电极极板5/5阵列上单个的沿着按程控路径移动的毛细管液滴。
图2A-2H所示为一系列照片，显示了在传感器表面固着的液滴的形成以及它在85 秒期间内的蒸发情况。
图3A-3E是一系列显示精确平行的样品处理的图表。
图4是显示了由样品浓縮而得到的改善的信号。发明内容
本发明通过在传感位点处循环全部样品，可解决上述这些问题和有关问题，该样品以不作为连续流而是作为一系列离散、移动的液滴，其在传感器处以重复而明确的和可重复 的方式(传送和暴露的定时、搅拌频率、蒸发程度、重复通过数、周期性洗涤等)通过蒸发 而被暴露、搅拌、或者甚至浓縮。这种离散的移动液滴系列可以通过使用多种机械的、电子 的、化学的、光学的或者其它的液滴处理方法而实现。这种芯片上离散液滴控制的一个实施 例是微流体技术处理能力，其通过介质上电润湿(EWOD)效应而实现[参见关于EWOD背 景的1) J. Lee, H. Moon, J. Fowler， T. Schoellhammer and C, J. Kim，"用于微量液体处理的电 润湿和介质上电润湿"，Sensors and Actuators, Vol. 95, 2002， pp 259-268;和2) S, K. Cho, H. Moon and C,J. Kim,"通过基于电润湿的作用用于数字式微流体循环的产生、转运、切割，以 及合并液滴，，，Journal of Microelectromechanical Systems, Vol. 12, 2003， pp 70- 80.]。
图l显示了EWOD功率和灵活性单个的水滴以在电极极板5x5阵列上程控的"2" 模式移动。对于驱动样品液滴(含有靶生物分子以及颗粒)EWOD较为理想，因为低电压(10-20 伏特)是有效的，并且可逐个极板精确控制液滴移动路径和速度。与一些方法相反，EWOD 效应不要把靶分子暴露于温度极限、和/或可以损害(即，使变性)蛋白质、DNA及其它所 研究的生物分子的声能水平。进一步地，EWOD构造的灵活性可以使得连接于高度分布的网 络的生物传感器芯片可随意使用。
通过将样品体积分解为一系列离散的液滴，其中每个液滴都可以分别控制，可以局 部地在每个传感器位点上采用样品循环和搅拌，而不是全部地并且以完全连续的方式进行， 从而保证样品体积几乎全部暴露于的每个单独的传感位点。即，通过制作大小可与传感位点 进行比较的每个液滴，并且通过转运每个液滴使之与每个传感位点以可控制的方式相互作用， 可以基本上消除对靶分子的扩散途径限制。用这样的方式引导样品循环/搅拌和传感器洗涤， 也可以消除麻烦的不透水密封、装阀、或者经常需要全部样品体积作为物流移动的机械的、 气动的或者表面声学的方法。
可以通过将每个单独的液滴以高速( 250 mm/sec)从一个或多个方向驱动至传感 器上，或者采用多个循环，以及组合的动力学运动、静态放置和强化外界效应，从而实现高 度局部的和强有力的搅拌效应。例如， 一种实施例是可以将搅拌效应程控成包括使液滴在传 感器上保持静止给定时间TS，然后与之交替地以不同速度V转运至传感器上，或者组合使用 其它的周期性动态效应和静态放置效应。这些高度局部化搅拌效应将会把颗粒带入游离的悬 浮状态，或者呈溶解在液滴内的分子，并且/或者以与某些方法相比更有效地更接近传感器的 接近性而残留在液体/空气和液体/液滴界面表面上，所述某些方法依赖于全部或整体样品的搅 拌、循环、扰动效应。
在传感器位点上驱动或者搅拌一种或多种含有靶分子的样品液滴也可以用来减轻 在传感器位点处不需要的非靶分子吸附。因为对传感器位点进行典型地处理来显示或者组合 有一些耙特异性亲合特性，样品液滴的动态迁移将清理出对传感位点几乎没有亲和性的非靶 颗粒。该洗涤步骤还可以用清洁的(即，无样品)洗涤液滴来进行。这样，可以通过将洗涤 液滴分解成为一系列样品液滴，来消除单独的洗涤步骤或者实现单独洗涤效果所需的微流体 机制。除了简单的洗涤之外， 一系列"再生"液滴可以类似地移动至传感器上，进行分析之 后接着从传感器上剥离所有结合的分子，从而准备好传感器用于随后的分析。
驱动离散液滴而非连续试样体积的能力也产生了另一个独特的好处当每个传感位点被经过的液滴湿润时，固定的固着的液滴留在传感器上，如图2所示。所述"固着的"，我们这里是指薄的、残余的流体体积，其在主要的液滴已经移动后仍依附着传感表面。然后 当蒸发发生时实现样品浓縮，并且固着的液滴表面朝传感器表面向后倾斜，从而使靶分子移 动至更紧密地与传感器结合。形成新的固着的液滴，并且由每个经过样品液滴用新的靶分子更新。图2A显示了在样品液滴到达之前的传感器表面20。图2B显示了在传感器上样品液滴22的 通过(从右到左)。在图2C中，主要的样品液滴22已移动开来，传感器表面20上剩下固 着的液滴24。图2D-2H显示了在大约85秒期间内固着的液滴的蒸发情况。在图2H中，固 着的液滴22已经完全蒸发。
可以通过将耙分子放置在更接近传感器的范围内而加快固着的液滴在传感器上的 蒸发并且放大信号检测，从而达到扩散距离，该距离是传感器直径的几分之一并且/或者加强 了靶分子与传感器的直接接触。另外，每次样品液滴经过并且随后形成新的固着的液滴，传 感器位点都会用新的靶颗粒进行更新；由于其较高的表面-体积比，固着的液滴可以快速蒸发。 通过限定在下一个流动的样品液滴被驱动到传感位点处之前的时间，固定的固着的液滴可以 通过固有的或者强制的用于完全或者部分蒸发的手段(例如，高温和/或在位点处气体循环) 以高度受控方式而被蒸发。
然后在传感位点处传递或者搅拌后继的样品液滴或"洗漆"液滴(或者一系列洗涤 液滴)，可以除去在初始的固着的液滴蒸发期间已经被吸附到传感器上的非靶分子。该"洗 涤"液滴然后可以被驱离传感器，并且将其在下一个样品液滴到达之前被驱动进入废物容器， 以将更多耙分子添加至传感器位点。
液滴驱动程控的能力还可以使得能够在传感器上进行反应溶液液滴直接的、精确控 时的和高速的转运( 250 mm/sec)，从而有助于或者使成功捕获的靶的检测能够进行。这种独特的在微秒时间尺度之内控制液滴移动和混合的能力可以1)保证平行反应接近同时进 行(例如，样品相对于参照物)，该平行反应用于评价特异性靶信号对于背景或噪声的信号 水平；并且2)实现高度可重复的酶促反应或者其它基于时间的反应，所述反应可以测定生 物传感器信号输出。这样，可以实现可程控的液滴驱动，其能够高速进行，并且样品、洗液 和反应溶液的时序性精确，不用在沟通、装阀、抽吸和芯片中布局采用或者拟定特异性设计。 当然，这就大大地增加了仪器设计的简约性和灵活性。
图3显示了本发明能够进行并行处理的能力。该利用图解显示的测试是在传感器位 点上进行，该传感器位点设计成结合例如标记物抗体(当然可以使用其它的特异性结合分子 比如凝集素或酶)。在这类测试方法中，使得特异性结合分子附着于传感器位点。然后，使 试验品或被测物液滴与传感器表面起反应。如果试液含有任何耙分子(耙X)，那么这些分 子将在传感器表面上与抗体结合。最后，使得也结合于靶分子的第二检测抗体与传感器表面 相互作用。如果靶分子存在于表面上，该检测抗体将结合，使得能够进行信号的检测，该检 测信号将与靶分子的数目成比例。这类"夹心"测试方法己为本领域的技术人员所熟知。如 果能够通过发明的技术还可以进行竞争性和其它的测试形式，那将非常有益。
图3A用图解显示了具有多传感器区域的系统，其可以代表用于检测耙分子的特异 性(S)和对照(R)(非特异性)抗体包覆的传感器位点阵列。可以将液滴从许多不同的源 料池或分配通道(例如，靶溶液或被测物溶液、洗液、靶特异性酶或抗体标记物、试剂等) 驱动至路径、回路、EWOD驱动极板网络或阵列上的这些传感器位点。该传感器位点包覆有 多种抗体或者其它结合性分子。在此，用于涂敷S极板的液滴来自标记抗体贮备池50，同时 用于涂敷R极板的液滴来自含有非特异性抗体的试剂贮备池55。为简明起见，在图表中仅显 示有一种贮备池的物理学设置。在实际的设置中，可以存在多套贮备池。图中，参照物的数 量变化表明，不同的贮备池在不同的处理阶段使用。
图3B中， 一系列液滴从靶溶液贮备池60中产生，并且被驱动至多个传感位点上并 在该位点被搅拌(双箭头表示)，使得任何靶分子结合于涂敷有抗体的传感器表面的抗体。 如果贮备池60含有包含被测物的试验样品，那将很有益。在与表面发生反应后，耙液滴被驱 动至废弃位点(可以使用单独的或传感器特异性废弃位点以代替这里显示的共用废弃位点， 以防止交叉污染、沉淀、或类似的可以带来困难的反应)。
图3C中，洗液液滴被驱动至传感器表面上并且在该表面上搅拌，以除去非耙分子 和未结合的靶分子。在传感器表面上重复搅拌后，这些洗液液滴也被驱动至废弃位点。最后， 图3D中，每个传感器都接受来自贮备池65的检测标记抗体、试剂或酶的液滴，设计该贮备池65是用于与结合在传感器表面的靶分子发生反应或者与之相结合。图3E显示了进一步的 变化情况，后继系列的试剂液滴也可以从贮备池70产生出来，与任何已附着于结合的靶分子 的标记抗体或酶起反应。图3E显示的情况是，检测抗体或试剂需要第二组分以产生检测信号。
并行读取可以在如下步骤后进行1)传感器位点已经暴露于靶特异性的试剂、抗 体或酶(图3D),或者2)在已经使试剂液滴与结合的靶分子起反应之后。如果读取过程可 以采用光学方法、电化学方法或者其它本领域的技术人员已知的方法，那将很有益。通过在 歩骤l)和2)中进行并行读取，可以产生对照样或者空白试剂的读数。如果该系统很容易地 使得可以忽略多种成分，从而自动产生一系列内部对照样和试验品，那将很有益。对于许多 可供选择的系统而言，这种灵活性是不可能的。
提供的参照传感位点是用于测定非特异性结合于传感器表面，从而产生试液的背景 信号。将S传感器与R传感器进行对比，就完成了特定试剂设置(作为试剂的质量对照物) 的非特异性结合的测定、以及指示靶溶液内存在干扰物质的测定。即，S传感位点具有对靶 分子的自然亲合性，并且将会比R位点捕获更多的这些分子。该干扰物质可以引起检测抗体 反常地结合于R传感器位点。在许多捕获位点之间进行的并行读取将会提供特异性信号对于 非特异性信号的比率(SNR或信噪比)，该比率与存在的靶分子数目成正比。
在进行如图3所示处理中，液滴混合的准确定时使得如下步骤能够同时进行1) 进行多个同样的反应以提高统计学置信水平；2)进行多个特异性相互作用相对于非特异性相 —fl作用的评价，其中每个评价都含有许多重复反应，以降低统计学不确定性；以及3)使得 在每个传感器位点上发生多个均一定时的被测物暴露和洗涤，以减少统计学不确定性并提高 SNR。
通过在芯片水平上实现液滴操作自动化和精确定时，与容易产生人为误差的、手工 的、基于移液管的取样和试剂加载方法相比，可以得到多得多的可重复并且丰富的数据。此 外，这些结果可以以低得多的成本得到，并且相比于需要标准化平板空间和加载点的、机器 人方式驱动移液管的加载方法，具有更大的灵活性。
具体实施方式
通过液滴驱动和蒸发进行样品浓縮
图4比较了用普通方法而得到的结果和通过液滴驱动和蒸发进行试样浓缩法而得到 的结果。基线测定(图中左起第一栏)包括将直径1 mm的传感器暴露于直径5 mm、含有作 为样品分子的辣根过氧化物酶(HRP)的液滴10 min。在10 min暴露周期后，接着将HRP液滴驱离传感器，代之以含有底物的反应液滴。最终得到30纳安(nA)的信号水平。该方 法类似于传统方法，连续的试样体积远大于传感位点，其静止保持在传感器位点上10分钟， 以便能够经过扩散作用进行免疫性捕获，然后混合加入反应溶液，得到可检测信号。
试验了两种不同的样品浓縮方法。第一种样品浓縮方法(图中左起第二栏)包括将 HRP液滴驱动至传感器上，以产生固定的固着的液滴，在传感器上制作附加的HRP液滴通过 之前，容许该液滴部分地蒸发1分钟。在液滴总共通过十次和十个部分蒸发周期(总共10分 钟)后，驱动含有底物的反应液滴以覆盖传感位点，最终得到120nA的信号水平，信号放大 了4倍。第二种方法(图中左起第三栏)包括重复固着液滴的方法，但容许在每一个10次通 过之间液滴完全蒸发。该方法需要20 min时间，并且得到的信号水平在500 nA以上，信号 放大了16倍。S卩，时间加倍，但信号强度为平方。通过液滴驱动洗涤样品
洗涤是许多测试方法的关键部分，因为其从传感器上清理出非特异性分子比如未结 合的抗原和未杂交的核酸聚合物。我们比较了重复液滴经过的洗涤效果和普通的浸没洗涤效 果，后者使用洗瓶来喷水并洗涤无非特异性分子的传感器。两种洗涤方法的评价显示，在洗 涤之前，静止的HRP样品液滴留在传感器上五分钟产生了30nA的信号。该信号应被认为是 参照信号。该HRP分子对传感器是非特异性的，并且不会显著地与之结合。使用喷瓶洗涤， 在重复用来自洗瓶的水流清洗以后，参照信号降低到最终的11 nA信号值。即，信号降低了 大约63 %。使用新的HRP样品液滴和传感器，对传感器采用十次洗液液滴经过，从而将参 照信号降低至最终的6 nA信号值。g卩，降低了大约80%。这表明，相比于使用普通洗瓶的 方法，将洗液液滴重复驱动至传感器上是更有效的洗涤传感器的方法。
因此，应理解下述权利要求包括如上所述具体地显示和描述的内容，包括概念上等 同的方案，包括明显可以替换的内容，并且包括符合本发明基本构思的方案。在不背离本发 明范围的情况下，本领域的技术人员可以获知上述优选实施方式的多种改进和变形。本文所 示实施方式仅用于阐明本实施例的目的，不应将其视为对本发明的限制。因此，应当理解， 在附后的权利要求书限定的范围内，可以用除在此具体描述之外的形式实施本发明。
权利要求
1.一种用于在流体系统内改进样品中靶分子的传感器检测的方法，包括下述步骤使样品破裂成一系列离散的液滴，并且将每个离散液滴移动至传感器的传感位点上，从而通过从传感器提供多重信号而改进检测。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含步骤通过将至少一种洗液液滴移动 至传感位点上来洗涤传感位点。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，还包含反应步骤将至少一种底物反应溶液 或标记第二抗体溶液的液滴移动至传感位点上。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述移动步骤还包含在传感位点处搅拌所述 液滴。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，还包含步骤在传感位点处通过蒸发来浓缩 所述液滴。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述浓縮步骤包括在传感位点处产生残留的固着液滴。
7. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，移动每个液滴的步骤不需要阀门、泵或声学 效应。
8. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述靶分子在该方法中不变性。
9. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述移动歩骤包括EWOD。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含步骤将至少一种含有非特异性分 子的液滴移动至传感位点上以作为非特异性结合的参照。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，多个传感位点以平行的方式提供，同时保 证多种相同的活性，每种活性对应于每个传感位点。
12. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，位于所述多个平行传感位点的活性提高了 靶分子检测的统计学精度。
13. —种用于在流体系统内改进样品中靶分子的传感器检测的方法，包括下述步骤使 样品破裂成一系列离散的液滴；平行地提供多个传感位点；以及将每个离散液滴移动至所述 多个传感位点的每个传感位点上，从而提高检测的统计学精度。
全文摘要
公开了改进微流体技术测试的方法。通过在被测物浓缩步骤(增强信号)中使用固着的液滴蒸发、以及洗液液滴重复通过来作为降低非特异性结合(噪音降低)的手段，可以改进该测试方法(更高的信噪比)。另外，多个大量平行的分析提高了分析的统计学精度。
文档编号B01L3/00GK101252993SQ200680029567
公开日2008年8月27日 申请日期2006年6月15日 优先权日2005年6月16日
发明者义贞·布兰登·李, 彼得·帕特里克·德古茨曼, 金昌津, 韦恩·博文·刘 申请人:精华微技有限公司