专利名称：：一种测定氯代甲酸9-芴甲酯纯度的方法
技术领域：
：本发明涉及液相色谱分析方法，具体涉及氯代甲酸9-芴甲酯的液相色谱分析方法。氯代甲酸9-芴甲酯(简称Fmoc-Cl)是一种无色或浅黄色针状晶体，熔点61.563°C，分子式C15HC102，分子量258.5，结构式为氯代甲酸9-芴甲酯分子中含有活泼的氯原子，是有机合成的重要原料。它广泛地应用于提供羰基的有机合成，可以和醇、醛、胺、酰胺、羧酸、酚、羟胺等反应，还可以用作氯化剂、脱水剂、烃化剂、保护剂和活化剂。目前，氯代甲酸9-芴甲酯主要用作肽合成和抗血栓类药物的中间体，国外对其合成和应用的研究报道较多。在多肽合成中传统的BOC(叔丁氧基)固相合成法易出现肽链断裂现象，产生较多副产物，尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定氨基酸的肽类。由于Fmoc-Cl是碱敏感保护基，Fmoc基团又有大的空间位阻，在合成氨基酸过程中，可以很好地保护碳链增长，反应结束后又易于脱去。科学家发现采用新型Fmoc(芴甲氧羰基)固相合成法，具有反应条件温和、副反应少、产率高及应用面广等优点。近年来，Fmoc固相合成法在国外被广泛用于合成具有各种性能的多肽，许多生物大分子如活性酶、生长因子、人工蛋白等已被成功地合成。目前国内外没有公开资料介绍Fmoc-Cl的分析方法，与其相关的技术资料也少见报道。上海应用技术学院的周祖新、顾建生在"双光气法合成氯甲酸9-芴甲酯"的文章中提到产物的纯度采用液相色谱分析，但没有披露具体方法，更没有披露釆用何种类型的高效液相色谱柱及其具体操作条件。因此，本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱法测定氯代甲酸9-芴甲酯
背景技术：
的方法纯度的方法。发明概述一种用高效液相色谱法测定氯代甲酸9-芴甲酯的方法，其特征在于固定相为反相键合固定相；流动相为水和/或有机溶剂，为便于分离在所述流动相中加入一定量的缓冲溶液；检测器采用多波长可变紫外-可见检测器。所述反相键合固定相选自十八烷基键合相硅胶、辛垸基键合相硅胶和氰基键合相硅胶。优选反相C18键合柱，色谱柱的尺寸为长1050cm，内径3.56mm，优选内径为4.6mm。流动相为水和/或有机溶剂，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、环己烷、正己烷、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。当选择有机溶剂为流动相时，为改善其极性以获得最好的分离度，可在其中配入一定比例的水。流动相较佳为乙腈和四氢呋喃。本发明方法中用于流动相的缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠、醋酸、磷酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、邻苯二甲酸-盐酸、甘氨酸-盐酸，其浓度为0.1-5%。本发明方法使用的固定相其柱温为20-60°C，流动相的流速为0.8-1.5ml/min;进样量4-20nl;检测波长为220-370nm。分析时间以1至40分钟为宜，最优的分析时间控制在IO分钟之内。发明详述1.分离模式的确定色谱法是测定物质纯度常用的分析方法，其中以气相色谱法和高效液相色谱法为主。本发明采用高效液相色谱法而不用气相色谱法的构思是考虑氯代甲酸9-芴甲酯不稳定易分解不能用气相色谱法分析。高效液相色谱法采用液体做流动相，无需高温，它不仅可以分析氯代甲酸9-芴甲酯产品的纯度，还可以分析其中间产物，扩大了它的使用范围，提高了通用性。高效液相色谱法中常用的有液固色谱法、液液色谱法、键合相色谱法、亲和色谱法和体积排阻色谱法。在分离模式的选择上，本发明者考虑到氯代甲酸9-芴甲酯属于有一定极性的多环芳烃，具有比较大的容量因子(k')值，还考虑了各种方法中柱效、分离选择性、固定液稳定性及检测器灵敏度的优劣，从而选用键合相色谱法。化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。它的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都有良好的选择性。根据镡合固定相与流动相相对极性的强弱，键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。一般地，极性较小的化合物在正相中流出较快，而极性较大的化合物在反相中流出较快。考虑到氯代甲酸9-芴甲酯的极性较大，因此选用反相键合液相色谱法检测氯代甲酸9-芴甲酯纯度是适宜的。2.解决氯代甲酸9-芴甲酯遇水分解的问题对于这类不稳定易水解的样品常用的方法是采用衍生法。即柱前衍生或柱后衍生，但衍生法手续繁琐、衍生剂价格昂贵，不是理想的测定方法。通过大量试验探索，采用在液相色谱法的流动相中加入缓冲剂，既能防止氯代甲酸9-荷甲酯在水中分解，又不影响其在液相色谱柱内的分离效果。试验证明在水相中加入一定量的柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠、醋酸、磷酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、邻苯二甲酸-盐酸、甘氨酸-盐酸等是可行的，最优浓度为0.1-5%。3.优化分离条件优化的目的是使样品中的组分以最满意的分离度、最短的分析时间、最低的流动相消耗、最大的检测灵敏度获得完全的分离。选用的流动相要求粘度低、紫外吸收弱、不与样品发生作用，使用方便。反相色谱法一般使用的流动相有甲醇、乙腈、四氢呋喃等。因氯代甲酸9-芴甲酯与甲醇发生反应，本发明使用的流动相可以选自水、乙腈、四氢呋喃、环己垸、正己垸、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。为改善流动相的极性以获得最好的分离度，可在有机相中再配入一定比例的tK。通过调节流速和进样量使样品达到了很好的分离度，分析时间以1至40分钟为佳，最优的分析时间控制在10分钟之内。整个分析过程快速、准确，易操作。4.检测器及相关条件的选择液相色谱检测器很多，常用的有紫外-可.见检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、示差检测器、电化学检测器、电导检测器、多级质谱检测器等。本发明的构思是选用多波长可变紫外-可见检测器。它具有可变波长，可对同一物质搜索最大吸收波长，特别适合未知样品分析方法开发。另外，它的噪音小，基线稳定(±0.75xl0'5AU)，有利于检测结果的准确性。5.色谱柱的选择选择色谱柱时主要考虑了以下几个问题通用性好，适合分离各种化合物；分离酸性物质和碱性物质不拖尾；柱压低，柱效高；良好的重现性；经久耐用，性能稳定；价格合理。本发明者通过筛选，发现十八垸基键合相硅胶或辛烷基键合相硅胶或氰基键合相硅胶比较适合用于本发明的测定方法中。较好的为采用反相C18键合柱。尺寸为长1050cm，内径45mm，最优内径为4.6mm。选用的这种键合柱具有以下特点固定相不易被流动相洗脱、无需饱和色谱柱、易进行梯度洗脱、柱平衡快、使用极性范围宽、选择性唯一、柱容量大、溶质不易污染柱子等。6.定量方法的确定本发明采用外标法进行定量，即按如下式(1)进行计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，X1:氯代甲酸9-芴甲酯的纯度，％X标标样的纯度，％;A1:试样中Fmoc-Cl组分的峰面积；A2:标样中Fmoc-dl组分的峰面积；m1:试样的质量，g;m2:标样的质量，g。外标法的最大优点是无需样品中所有组分都被检测到，只需对欲分析的组分做校正。采用这种定量方法可以解决待测样品中某些组分不出峰和各组分在某一波长下响应因子不一样带来的误差。因此该定量方法不仅可以分析高纯度样品，还可以分析中间纯度的样品，其应用领域比其他定量方法要广得多。试剂，其特征在于第三步测定过程；通过将本^r测试剂lml与含有金属离子的水溶液4ml进行混合，振荡均匀作为样品l,采用分子荧光光谱法进行测定，测定值a;取本制剂与lml与4ml纯净水混和，振荡均匀作为样品2，采用分子荧光光谱法进行测定，测定值为b;计算a/b，然后用a/b值与各响应金属离子标准响应曲线值进行对照，获得其中水溶液中金属离子的信息。二钠-柠檬酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸(分析纯)购自上海国药集团。实验中流动相和溶液用水均为二次蒸馏水。操作步骤1、配制标样溶液称取Fmoc-Cl标样25mg(称准至O.lmg)于洁净干燥的100mL容量瓶中，用有机相流动相做溶剂(色谱纯)稀释至刻度，用超声波脱气溶解10分钟，混合摇匀后作为分析标样。2、配制待测样品溶液称取Fmoc-Cl试样25mg(称准至O.lmg)于洁净干燥的100mL容量瓶中，用有机相流动相做溶剂(色谱纯)稀释至刻度，用超声波脱气溶解10分钟，混合摇匀后作为分析用试样。3、进样分析待色谱条件稳定后，用50wL微量注射器，依次注入标样、试样进行分析。待完全分离后，经化学工作站分别得到标样、试样的色谱谱图和相应的积分面积。4、定量采用高效液相色谱紫外检测器测定氯代甲酸9-芴甲酯的峰面积，由外标法定量或面积百分比定量。外标法定量是待测样品中氯代甲酸9-芴甲酯纯度(X》，以质量分数表示，按式(1)计算。实施例198.6%纯度氯代甲酸9-芴甲酯标准样品的测定色谱条件流动相为乙腈:水(0.1%醋酸-醋酸钠)=卯:10;色谱柱选用ZorbaxC18，填料粒度5pm，柱长15cm，内径4.6mm;流速1.0ml/min;柱温30。C;检测波长262nm;进样量5pl。按上面的操作步骤，准确称取25.13mgFmoc-Cl标样，置于100ml洁净干燥的容量瓶中，用色谱级乙腈稀释至刻度，用超声波脱气10分钟，充分摇匀后进样。待仪器条件稳定后连续进样3次，取3次面积的平均值作为标样计算的面积(A2)。标样积分面积数据见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>平均峰面积(A2)12544.2氯代甲酸9-芴甲酯标准样品图见图1。实施例2高纯度试样的测定色谱条件同实施例l。按上面的操作步骤，准确称取27.44mgFmoc-Cl试样，置于100ml洁净干燥的容量瓶中，用色谱纯乙腈稀释至刻度，用超声波脱气10分钟，充分摇匀，进样。得到试样中氯代甲酸9-芴甲酯的面积A产13757.2，根据式(1)计算1375722513X,=98.6X1J/J/.Zx99.0312544.227.44该氯代甲酸9-芴甲酯试样的纯度是99.03%。高纯度氯代甲酸9-芴甲酯样品图见图2。实施例3中间样品纯度测定除了流动相采用乙腈:水(0.1%醋酸-醋酸钠)=80:20(v/v)之外，其它色谱条件同实施例2。按上面的操作步骤，准确称取25.50mgFmoc-Cl试样，置于100ml洁净干燥的容量瓶中，用色谱纯乙腈稀释至刻度，用超声波脱气10分钟，充分摇匀，进样。得到试样中氯代甲酸9-芴甲酯的面积A产11560.8，根据公式(1)计算Xl=98.6xii^X翌=89.55,12544.225.50分析结果是该Fmoc-Cl试样纯度为89.55%(w%)。氯代甲酸9-芴甲酯中间样品图见图3。.实施例4色谱条件流动相为四氢呋喃:水(0.1%柠檬酸-氢氧化钠-盐酸)=70:30;色谱柱选用IntersilODS-3C18，填料粒度5nm，柱长15cm，内径4.6mm;流速1.0ml/min;柱温30°C;检测波长278nm;进样量5pl。取一定量Fmoc-Cl试样，置于100ml洁净干燥的容量瓶中，用色谱级四氢呋喃稀释至刻度，用超声波脱气10分钟，充分摇匀。仪器条件稳定后进样。待所有物质都出峰后终止检测器，得出所有物质相应的面积。通过面积百分比方法知试样中Fmoc-Cl含量是76.28%。该Fmoc-Cl试样的谱图见图4。实施例5色谱条件流动相为四氢呋喃:水(0.1%磷酸氢二钠-柠檬酸)=90:10;色谱柱选用IntersilODS-3C18，填料粒度5pm，柱长15cm，内径4.6mm;流速l.Oml/min;柱温30。C;检测波长278nm;进样量5^1。取一定量Fmoc-Cl合成粗试样，置于100ml洁净干燥的容量瓶中，用色谱级四氢呋喃稀释至刻度，用超声波脱气10分钟，充分摇匀。仪器条件稳定后进样。待所有物质都出峰后终止检测器，得出所有物质相应的面积。通过面积百分比方法知试样中Fmoc-Cl含量是53.84。/。。该Fmoc-Cl试样的谱图见图5。实施例6精密度和回收率试验色谱条件同实施例l。将样品配制成浓度为0.1451mg/ml，标准样品配制成浓度为0.1522mg/ml，进样量5^1，连续测样10次，得到此方法的加标回收率为98.0-103.5%，对实施例3中样品进行了6次连续测定，统计误差得到相对标准偏差是0.6%。权利要求1.一种用高效液相色谱法测定氯代甲酸9-芴甲酯的方法，其特征在于固定相为反相键合固定相；流动相为含缓冲剂的水和/或有机溶剂；检测器采用多波长可变紫外-可见检测器。2.如权利要求l所述的方法，其中所述反相键合固定相选自十八烷基键合相硅胶、辛烷基键合相硅胶和氰基键合相硅胶。3.如权利要求1所述的方法，其中所述反相键合固定相为反相C18键合柱，柱长1050cm，内径45mm。4.如权利要求l所述的方法，其中所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、环己烷、正己垸、乙醚、二氯甲垸、三氯甲垸和甲苯。5.如权利要求4所述的方法，其中所述有机溶剂选自乙腈和四氢呋喃。6.如权利要求l所述的方法，其中所述抑制剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钠、醋酸、磷酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、邻苯二甲酸-盐酸、甘氨酸-盐酸，其浓度为0.1-5%。7.如权利要求l所述的方法，其中所述固定相的柱温为20-60°C，流动相的流速为0.8-1.5ml/min。8.如权利要求1所述的方法，所述方法的进样量为4-20pl;检测波长为220-370nm。全文摘要本发明提供一种用高效液相色谱法分析氯代甲酸9-芴甲酯纯度的方法。本方法采用的固定相为反相键合固定相；流动相为含缓冲剂的水和/或有机溶剂；检测器采用多波长可变紫外-可见检测器。该方法操作简便、成本低廉且准确性高，可作为氯代甲酸9-芴甲酯合成及提纯过程中的纯度检测，并适用于各种纯度的氯代甲酸9-芴甲酯样品。文档编号B01J20/287GK101231271SQ20071003671公开日2008年7月30日申请日期2007年1月22日优先权日2007年1月22日发明者烨夏,张秀云,陈叶飞申请人:宝山钢铁股份有限公司