专利名称：无孔两性离子交换生物分离介质及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种无孔两性离子交换生物分离介质及其制备方法和用途。
背景技术：
无孔高聚物类型的高效液相色谱(HPLC)固定相，自八十年代后期出现 以来已得到迅速发展，与多孔填料相比，其最主要的特点是，消除了停滞流 动相传质带来的峰加宽，提高了柱效及分离效果，同时由于被分离的生物大 分子不会进入颗粒内部，只在表面进行传质交换，故可用于蛋白质和多肽等 生物大分子的快速分离分析。两性离子交换材料是一类在同一树脂颗粒内同时存在着阴阳两种交换基 团的材料。这类树脂中的两种基团彼此接近，可以互相结合，遇到溶液中的 离子又可以同时与阴、阳两种离子进行离子交换。两性离子交换材料作为离 子色谱固定相的研究开始于1981年，Knox等选用长链co-氨基羧酸对反相柱 填料进行动态涂敷，表现出一定的阴阳离子保留特性。Yu, L.W.等首次通过 化学键合的方法，制备下硅胶基质的弱碱-弱酸和强碱-强酸两种类型两性离 子交换固定相，应用于无机阴阳离子的同时分离，1999年，Irgum等以商品 化的Spheron 300树脂为基质和硅胶表面涂敷制备了聚合物强碱-强酸两性离 子分fe介质，用于无机阴阳离子的同时和单独分离，但未见对生物大分子分 离的报道。申请日为2005年11月9日、公告号为CN U32213A、发明名称为无孔单分散聚合物弱阳离子交换树脂及其制备方法和用途是采用"一步种子溶胀 聚合法"制备了 3.0-7.(Him无孔单分散交联聚聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂，并 以无孔树脂为基质制备了弱阳离子交换分离介质，用于碱性标准蛋白质和基 因工程产品的快速分离纯化。但基因工程产品多数属于酸性重组蛋白，用单纯用阳离子或阴离子交换 分离介质很难达到良好的分离。 发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，以3.0|_im无孔单分散交联聚甲 基丙烯酸环氧丙酯树脂为基质，采用了新的化学改性方法制备了一种新型 的可同时分离酸和碱性蛋白质、易再生、耐强酸强碱、机械强度高、分离 速度快，蛋白质量和活性回收率高，可广泛用基因工程产品及蛋白质的快 速分离纯化的无孔两性离子交换分离介质及其制备方法和用途。
为了实现发明目的，本发明通过如下方式实现一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为 o oh h3 —och26h-ch2 二fji-ch2 —ch2 —ch2 —so3-其中P的结构为"j"Oi-c—Qi-c-c-00"tQiOJp卞ai十 to % n—h hf …d所述的无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法，其特征是该制 备方法为在4.0-6.0g无孔单分散P (GMA/EDMA)树脂中加入 40-60mL1. 0mol/L稀HCl*,超声分散10_15min后于30-40。C恒温反应2-3 h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，产物再加入30-50mL 二甲胺的水溶 液，恒温60-70。C反应20-24h，产物用大量水及丙酮反复洗涤，真空干燥 即得氨化的微球，氨化后的微球于120-150mL的乙睛中，并加入3-5gl， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于80-9(TC回流搅拌20-24h，产物用大量丙酮 和乙醇洗涤，真空干燥，即可；所述的无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法，其特征是该制 备方法为将4. 0-6. 0g干燥无孔单分散的PGMA/EDMA树脂分散于40_60mL 二甲胺溶液中，恒温60-7CTC回流搅拌反应20-24h，产物用玻璃砂漏斗抽 滤，再用大量水、丙酮和乙醇反复洗涤，真空干燥，即得氨化的微球，将 氨化的微球加加入到120-150ml的乙腈中，并加入3.0-5.0克1， 3-丙 磺酸内酯，超声分散后于80-9(TC回流搅拌20-24h，产物用大量丙酮和乙 醇洗涤，真空干燥，即对；所述的无孔两性离子交换生物分离介质作为蛋白质、酶和生物工程产 品的分离纯化中的应用。本发明合成无孔两性离子交换分离介质所用的原料及分离所用的标 准蛋白质为3.0pm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂 (PGMA/EDMA)， 1,3—丙磺酸内脂，33%二甲胺水溶液，色谱纯乙腈， 卵清蛋白(OVA，鸡蛋清)，牛血清白蛋白(BSA)， a-淀粉酶(a-Amy)，肌 红蛋白(Myo,马心)，细胞色素-C(Cyt-C,来源于马心)，P-乳球蛋白((3-Lact， 来源于牛奶)，胰岛素(Ins,来源于牛胰脏)，(x-糜蛋白酶原-A(a-Chy-A，牛 胰脏)，核糖核酸酶(RNase-A,牛红细胞)和溶菌酶(Lys，鸡蛋清)均购 自美国Sigma公司。本发明有如下效果.1) 工艺过程独特本发明提供了两种制备无孔两性离子交换生物分 离介质的方法，第一种改性方法使用盐酸与环氧基反应，这步改性可以 使环氧基反应比较完全，对蛋白质的不可逆吸附小，但第二步反应即氯化 的微球与二甲胺的水溶液反应的产率比较低，蛋白质的分离性能相对差 些，只能分离4种标准蛋白质；第二种改性方法直接使用二甲胺的水溶 液与环氧基反应，这步改性方法有反应不完全的残余环氧基对蛋白质会产 生一定的不可逆吸附，但制备的分离介质对蛋白质的分离性能好可以实现 基线分离5种标准蛋白质。2) 本发明所介绍的制备方法步骤简单、操作方便、容易控制、容易 放大设备，制备不需要特殊复杂的设备就可以获得所需要的产品。3) 性能好、用途广泛本发明机械性能好，耐压〉80Mpa，可用于高效液相色谱和毛细管电色谱，大大提高了分离和分析速度，蛋白质活性回收率高，在室温下，溶菌酶的活性回收率〉98%。卵清蛋白、(3-乳球蛋白，a-糜蛋白酶原-A和溶菌酶的质量回收率>97%。分离重现性好、速度快，可 广泛应用于蛋白、酶和生物工程产品的分离纯化。4) 该分离介质使用寿命长，在pH=l-12情况下使用1000小时，经清 洗后，分离性能未见改变。5) 耐强酸强碱.该分离介质分别用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化 钠浸泡一天一夜后，用大量蒸馏水洗涤中性后，用于分离标准蛋白，其分 离性能未见改变。 .6) 该分离介质很容易再生，只要用1 0倍体积的lmol/L氯化钠洗涤 剂可再生使用，不象一些商品柱要在每次进样后用氢氧化钠再生。7) 生物工程产品的脲提取液可以直接上样， 一步分离达到了较高纯度。
图1为标准蛋白质和酶在本发明实施例一、二和三制备的无孔两性离 子交换生物分离介质的分离图；图2为标准蛋白质和酶在本发明实施例四、五和六的制备的无孔两性 离子交换生物分离介质的快速分离图；图3为基因工程产品重组人粒细胞-巨嗤细胞集落刺激因子的8mol/L 脲提取液分离图。
具体实施方式
实施例一 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为<formula>formula see original document page 5</formula> 其中P的结构为<formula>formula see original document page 6</formula>该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法在4. 0 g无孔单分散P(GMA/EDMA)树脂中加入40mLl. 0mol/L稀HC1 ，超声分散lOmin后于 30-4(TC恒温反应2h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，产物再加入30mL 二甲胺的水溶液，恒温6(TC反应20h,产物用大量水及丙酮反复洗涤，真 空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于120mL的乙睛中，并加入3gl， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于80。C回流搅拌20h，产物用大量丙酮和乙醇 洗涤，真空干燥，即可，合成路线如下<formula>formula see original document page 6</formula>如图l所示分离条件1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡 液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5,0);流动相B(洗脱液)20mmol/L磷酸盐缓 冲液+ 1.0mol/LNaCl(pH5.0); 3、流动相流速l.OmL/min; 4、线性梯度lOmin, lOCBA-100o/。B, 100呢B延迟5min, 5、标准蛋白1:0VA,2:p-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。实施例二 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为>—s-och2&h-ch2」+-ch2 6h3<formula>formula see original document page 6</formula>;其中P的结构为:<formula>formula see original document page 6</formula>该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法在5. 0g无孔单分散 P(GMA/EDMA)树脂中加入50mLl. 0mol/L稀HC1 ，超声分散12min后于 30-4(TC恒温反应2.5 h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，产物再加入 40mL 二甲胺的水溶液，恒温65"C反应22h，产物用大量水及丙酮反复洗涤， 真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于135mL的乙睛中，并加入4gl， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于85。C回流搅拌22h，产物用大量丙酮和乙醇 洗涤，真空干燥，即可，合成路线如下。 。 h h/H3參s糊2"2 。 1喊HCI.必j-oc;，、.0oh|—c-och2ch-ch2 —N;,0ch3 一、、0 ■ch3 ~^0 oh ch3》—s-oc—-ch2 二—-ch2 —ch2 —ch2 —so; 6h3如图l所示分离条件1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平 衡液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.0);流动相B(洗脱液)20mmol/L磷酸盐 缓冲液+ l. 0mol/LNaCl (pH 5. 0); 3、流动相流速1. 0 mL/min; 4、线性梯度lOmin， 100%A-100%B， 100。/。B延迟5min. 5、标准蛋白1:0VA，2:卩-Lact，3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。实施例三 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为o oh h3och26h-ch2 2——ch2 —ch2 —ch2 —so;其中P的结构为"j"CH-c—CH-c-c-oaiaioc卞ai十 to H& 11—H P h该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法在6.0g无孔单分散P (GMA/EDMA)树脂中加入60mLl. 0mol/L稀HCI ，超声分散15min后于40°C 恒温反应3h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，产物再加入50mL二甲胺 的水溶液，恒温7(TC反应24h，产物用大量水及丙酮反复洗涤，真空干燥 即得氨化的微球，氨化后的微球于150mL的乙睛中，并加入5gl， 3-丙磺 酸内酯，超声分散后于9(TC回流搅拌24h,产物用大量丙酮和乙醇洗涤， 真空干燥，即可，合成路线如下:<formula>formula see original document page 8</formula>d;H3如图l所示分离条件1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平 衡液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5. 0);流动相B(洗脱液)20mmol/L磷酸盐 缓冲液+ 1.0mol/LNaCl(pH5.0); 3、流动相流速1.0mL/min; 4、线性梯度10min， 100%A-100%B， 100呢B延迟5min. 5、标准蛋白1:0VA，2:p-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C。实施例四 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为 —6-OCH26h-CH2 2|jl_CH2 —CH2 —CH2 —S03_ 其中P的结构为.<formula>formula see original document page 8</formula>该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法为将4.0-6.0g干燥 无孔单分散的PGMA/EDM树脂分散于40-60mL 二甲胺溶液中，恒温60_70°C 回流搅拌反应20-24h，产物用玻璃砂漏斗抽滤，再用大量水、丙酮和乙醇 反复洗涤，真空干燥，即得氨化的微球，将氨化的微球加加入到120-150ml 的乙腈中，并加入3.0-5.0克l， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于80-9(TC 回流搅拌20-24h,产物用大量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可，合成路 线如下 <formula>formula see original document page 9</formula>-6-och2(!;h-ch2」—ch2 —ch2 —ch2 —so孓 6h3如图2所示为蛋白质和酶在3. 0 |am无孔单分散弱阳离子交换填料上 的分离图，其中1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡 液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5. 0);流动相B(洗脱液)20mmol/L磷 酸盐缓冲液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流动相流速3.0 mL/min; 4、 线性梯度3min, 100%A-100%B， 100%B延迟2min. 5、标准蛋白l:OVA， 2:p—Lact， 3:a—Chy—A，4:Cyt—C， 5: Lys。实施例五 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为<formula>formula see original document page 9</formula>其中P的结构为:<formula>formula see original document page 9</formula>该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法为将5.0g干燥无孔单分散的PGMA/EDM树脂分散于50mL 二甲胺溶液中，恒温65。C回流搅拌反 应22h，产物用玻璃砂漏斗抽滤，再用大量水、丙酮和乙醇反复洗涤，真 空干燥，即得氨化的微球，将氨化的微球加加入到130ml的乙腈中，并加 入4.0克1， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于85"C回流搅拌22h，产物用 大量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可,合成路线如下<formula>formula see original document page 9</formula>如图2所示为蛋白质和酶在3.0 pm无孔单分散弱阳离子交换填料上
的分离图，其中1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.0):流动相B(洗脱液)20咖ol/L磷酸盐缓冲液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流动相流速3.0mL/min; 4、线性i度3min， 100%A-100%B， 100%B延迟2min. 5、标准蛋白1:0VA，2:p-Uct， 3:a-Chy-A，4:Cyt-C， 5: Lys。实施例六 一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为9 9h3 ⑩—6_OCH26h_CH2」fJj_CH2 —CH2 —CH2 —S03—6h3其中P的结构为 <formula>formula see original document page 10</formula>该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法为将6.0g干燥无孔单分散的PGMA/EDM树脂分散于60mL 二甲胺溶液中，恒温7(TC回流搅拌反 应24h，产物用玻璃砂漏斗抽滤，再用大量水、丙酮和乙醇反复洗涤，真 空干燥，即得氨化的微球，将氨化的微球加加入到150ml的乙腈中，并加 入5.0克1， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于9(TC回流搅拌24h，产物用 大量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可，合成路线如下<formula>formula see original document page 10</formula>如图2所示为蛋白质和酶在3. 0 无孔单分散弱阳离子交换填料上 的分离图，其中1、色谱柱5.0X4.6 cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡 液)20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.0);流动相B(洗脱液)20咖ol/L磷 酸盐缓冲液+ 1.0mol/LNaCl(pH 5.0); 3、流动相流速3.0 mL/min; 4、 线性梯度3min， 100%A-100°/。B， 100°/必延迟2min. 5、标准蛋白l:OVA， 2:卩-Lact， 3:a-Chy-A， 4:Cyt-C， 5: Lys。如图3所示为本发明在基因工程产品重组人干扰素-Y的8mol/L脲提取液分 离图，1、、色谱柱:5.0X4.6cm不锈钢柱，2、流动相A(平衡液):20咖ol/L PBS (pH 5. 0);流动相B(洗脱液)A + 1. 0mol/l NaCl (pH 5. 0) ， 3、流动相流速2ml/min，
线性梯度6min, 10%A- 60%B， 60%B延长2min， 5、 *为纯化后重组人粒细胞-巨嗤 细胞集落刺激因子，纯化后重组人粒细胞-巨嗤细胞集落刺激因子的纯度为93%。
权利要求
1.一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为其中P的结构为
2.如权利要求1所述的无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法，其特征是该制备方法为在4.0-6.0g无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂(PGMA/EDMA)树脂中加入40-60mLL 0mol/L稀HC1 ，超声分 散10-15min后于30-4(TC恒温反应2-3 h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中 性，产物再加入30-50mL二甲胺的水溶液，恒温60-70'C反应20-24h，产 物用大量水及丙酮反复洗涤，真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于 120-150mL的乙睛中，并加入3-5gl， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于80-90°C 回流搅拌20-24h，产物用大量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可。
3.如权利要求1所述的无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法， 其特征是该制备方法为将4.0-6.0g干燥无孔单分散的PGMA/EDM树脂 分散于40-60mL二甲胺溶液中，恒温60-70。C回流搅拌反应20-24h，产物 用玻璃砂漏斗抽滤，再用大量水、丙酮和乙醇反复洗涤，真空干燥，即得 氨化的微球，将氨化的微球加加入到120-150ml的乙腈中，并加入3.0-5.0 克l， 3-丙磺酸内酯，超声分散后于80-90。C回流搅拌20-24h，产物用大 量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可。
4.如权利要求1所述的无孔两性离子交换生物分离介质作为蛋白质、 酶和生物工程产品的分离纯化中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种无孔两性离子交换生物分离介质其结构式为(见图)该无孔两性离子交换生物分离介质的制备方法为在4.0-6.0g无孔单分散P(GMA/EDMA)树脂中加入40-60mL1.0mol/L稀HCl，超声分散10-15min后于30-40℃恒温反应2-3h，抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，产物再加入30-50mL二甲胺的水溶液，恒温60-70℃反应20-24h，产物用大量水及丙酮反复洗涤，真空干燥即得氨化的微球，氨化后的微球于120-150mL的乙睛中，并加入3-5g1，3-丙磺酸内酯，超声分散后于80-90℃回流搅拌20-24h，产物用大量丙酮和乙醇洗涤，真空干燥，即可；本发明以3.0μm无孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂为基质，采用了新的化学改性方法制备了一种新型的可同时分离酸和碱性蛋白质、易再生、耐强酸强碱、机械强度高、分离速度快，蛋白质量和活性回收率高，可广泛用基因工程产品及蛋白质的快速分离纯化。
文档编号B01J43/00GK101157059SQ20071014144
公开日2008年4月9日 申请日期2007年8月15日 优先权日2007年8月15日
发明者龚波林 申请人:宁夏大学