专利名称：用于从食品中提取组分的分子印迹聚合物的制作方法
用于从食品中提取组分的分子印迹聚合物
本申请是申请日为2004年1月29日、申请号为200480003094. 2 的中国专利申请的分案申请。 发明领域
本发明涉及能在水或含水介质中选择性地结合靶分子，如核黄素 或其类似物的一类新型的与水相容的分子印迹聚合物(AquaMIP),并涉 及其合成和其在食品加工和提取或分离工艺中的用途。
背景技术：
在医疗、饮食、环境和化学科学中，对于从相关物质的复杂混合 物中选择性地分离特定的物质存在日益增长的需求。目标是变化的； 它可以是一种或多种特定化合物的制备性分离，或者其浓度的测量， 或者从多组分混合物中选择性地除去目标化合物。
核黄素(维生素B2), —种水相容维生素，对人类膳食来说是重要 的，它是决定氧化还原反应的辅酶-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素 单核苷酸(FMN)的主要组分。在肝脏(3. 5mg/100g)、奶酪 (0. 5mg/100g)、牛奶(0. 15mg/100g)和哗酒(约200 pg/L)中可发现它。 尽管核黄素对热和酸性pH相对稳定，但它在碱和光存在下分解成光黄 素， 一种有助于维生素C分解的较强的氧化剂。在硫源存在下，核黄 素的光还原造成苦异oc-酸(bitter iso-alpha acid)分解，这导致暴 露于阳光下的白酒、香槟、牛奶和啤酒公知的"晒过(sun-struck)" 的味道。为了防止形成这种非所需的味道，在啤酒和白酒的情况下， 这些产品优选储存在暗色且不透光的瓶子内，或者在牛奶的情况下， 优选储存在塑料/纸包装内。对于缺少核黄素的产品来说，这些措施是 不需要的。
因此，在不影响其组成的情况下，从复杂的基体内选择性地除去 核黄素的方法是令人感兴趣的。M. G. Duyvis 等在 "J. Agric. Food.Chem. " (2002， Vol. 50，笫1548-1552页)和C. Laane等在"J. Inst. Brew." (1999， Vol. 105，第392页)中提出以亲合分离 模式使用核黄素结合蛋白质。然而，所提出的工序极强地受到与稳定 性和成本相关的问题的局限，这严重地降低了这些工序的可行性。
代替地，在这一点上，在不影响其组成的情况下，使用能从复杂 的基体中除去核黄素的稳定聚合物材料可能更加有用。能显示出这种 性能的材料从而在提高相关食品和饮料产品的稳定性和质量方面具有 重要的应用。此外，可使用这种材料在定量分析之前从复杂的基体中 富集并分离黄素，或者作为化学传感器内的识别元件。
一类这样的材料是已知称为"分子印迹聚合物(MIP)"的一类，它 可使用分子印迹技术来制备。
制备分子印迹聚合物(MIP)最广泛使用的方案(下称"常规技术或 工序")需要下述关键步骤
(i) 在低极性的非质子溶剂中，使靶或模板分子，或者其结构类似 物("T"),与所选择的功能性单体("M")接触并相互作用，形成非 共价締合的模板-单体组件，
(ii) 使模板-单体组件与交联剂或单体("M-M")共聚，从而形成 交联的多孔网络聚合物(也称为聚合物基体)，
(iii) 从聚合物基体中提取靶或模板("T")，从而使所制得的MIP 具有相应的结合位点。
在MIP上的这些结合位点能以高的亲合性和选择性选择性地再结 合相应的靼或模板分子，或近似结构的类似物。这些位点的结合选择 性常常与抗体-抗原的互补性相当。
在以上所述的常规技术中，典型地在步骤(iii)(提取模板)之前粉 碎并筛分MIP,以获得粒状材料的所需尺寸部分。然后它们可填充在 色镨柱内，并用于从具有类似结构或官能度的混合物的其它组分中色 谱分离模板。分析以及制备应用是可能的。在制备应用中，其目的可 以是分离或除去特定的化合物。可例如通过亲合色谱的工序进行制备 应用，其中可使用或者PH、离子强度或者溶剂梯度或所述参数的结合 来控制与固定相相互作用的强度。典型地使粗混合物流经MIP的填充床，借此待除去或分离的化合物选择性地保留在MIP上。随后，在再 生步骤中从MIP中释放该化合物。在调节步骤之后，MIP准备再次利 用。
以膜形式(membrane formatH吏用MIP是另 一种可选择的方案，该 方案通过允许较快速的分离和连续生产纯化合物的可能性而提供优 点。
或者，可以所谓的"间歇形式(batch format)"进行分离，其中 MIP在粗混合物内悬浮被认为足以发生化合物的选择性吸附的一段时 间。之后可如上所述进行再生。
MIP在例如氨基酸衍生物、肽、膦酸酯、包括p-阻断(blocking) 化合物的氨基醇和许多手性药物的手性分离方面显示出前景。
此外，在亲合色镨(参见，例如Y.Yu等，"Biotechnology and Bioengineering" ， 2002， Vol. 79，第23-28页)、化学传感(参见，例 如K. Haupt等，"Chem. Rev. ，， ， 2000， Vol.100,第2495-2504页) 和在小的靼分析物的免疫测定中用作抗体的替代品方面(参见，例如 L.Ye等，"J.Am.Chem. Soc. " ， 2001， Vol. 123，第2901-2902页)， 可看到涉及MIP的有前景的开发。专利文献揭示出在所有这些提及的 应用中该材料可找到商业用途。
在常规工序中，在称为生孔剂的成孔溶剂存在下进行聚合工艺。 为了稳定功能性单体和模板之间的静电相互作用，所选的生孔剂通常 是具有低到中度极性的非质子溶剂。目前所使用的大多数模板在这种 溶剂中显示出中到高的溶解度(下称"常规溶剂")，因此可以使用常 规工序对这些模板或其结构类似物进行印迹。
另一方面，以上所述的常规工序对于亲水性靶或模板来说是不可 能的，所述亲水性靶或模板包括大多数生物学上令人感兴趣的分子。 对于这类靶或模板分子来说，现有的印迹技术与两个主要的问题相关。
第 一个问题涉及这种靶在常规溶剂内的有限的溶解度。
核黄素或其类似物(例如FAD、 FMN)属于一类水溶性维生素，并在 分子印迹技术典型使用的低极性到非极性的有机溶剂中显示出最小到零的溶解度。因此不可能使用核黄素自身作为常规MIP合成技术中的 模板。
第二个问题涉及当使用常规技术生产的MIP在水中用作吸附剂时， 出现非特异性的疏水性结合。由于基体单体的疏水特性，因此当在纯
的含水介质中使用该材料时，大多数靶非特异性地吸附到聚合物表面 上。
因此必须寻找抑制这种非特异性结合的措施。为了获得能从富水 介质中强烈且特异性地吸附或结合亲水性生物分子，例如核黄素或其 类似物的MIP吸附剂，必须寻找可导致(1)在水中能结合靶或模板分子 的印迹位点和(2)抑制非特异性结合的方法。
为了获得能在水中结合模板的印迹位点，满足下述标准的核黄素 类似物可用作模板，即(a)在常规溶剂中可溶，(b)在聚合反应条件下 稳定，(c)具有与核黄素接近的结构和形状的相似，从而导致能在含水 介质中容纳核黄素的印迹位点。
发明概述
本发明因此涉及能在水或含水介质中选择性地结合靶分子的新型 的与水相容的分子印迹聚合物("AquaMIP")。
本发明进一步涉及能在水或含水介质中选择性地结合靶的新型 AquaMIP，它可通过包括下述步骤的方法获得
(a) 提供选择的靶或模板的结构类似物，
(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供 一种或多种选择的功能性单体和一种或多种选择的交联剂，
(c) 在所述靶或模板的类似物存在下，使所述一种或多种功能性单 体和所述一种或多种交联剂在所述聚合介质中共聚，
(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述模板类似物，
(e) 获得分子印迹聚合物(AquaMIP)，
(f) 任选地对所述AquaMIP进行后改性("亲水化")，以减少非特 异性的疏水性结合。在具体的方案中，本发明提供用于分子识别和结合二酰亚胺或含
二酰亚胺的化合物，如节基尿嘧啶、核黄素或其类似物的AquaMIP。 为结合核黄素而设计的这种AquaMIP因此能在含水条件下，如在液体 食品和饮料(如啤酒)中占主导的那些条件下，选择性地结合核黄素。
此外，在这样具体的方案中，本发明提供新型的分子印迹聚合物， 它能在水或含水介质中结合二酰亚胺(imide)或含二酰亚胺的化合物， 如节基尿嘧啶、核黄素或其类似物，它可通过包括下述步骤的方法获 得
(a) 提供选择的二酰亚胺或含二酰亚胺的靶或模板的结构类似物，
(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供 一种或多种选择的功能性单体和一种或多种选择的交联剂，
(c) 在所述二酰亚胺或含二酰亚胺的模板类似物存在下，使所述一 种或多种功能性单体和所述一种或多种交联剂在所述聚合介质中共 聚，
(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述二酰亚胺或含二酰 亚胺的模板类似物，
(e) 获得分子印迹聚合物(AquaMIP)，
(f) 任选地对所述AquaMIP进行后改性("亲水化，，)，以减少非特 异性的疏水性结合。
在进一步的方面中，本发明提供使用核黄素的结构类似物获得的 AquaMIP，它能在水或含水介质中结合核黄素及其衍生物。这些包括例 如核黄素四羧酸酯，它可藉助糖羟基与链烷酸酸肝的简单的一步酯化 反应来合成。
本发明还提供使用功能性单体的AquaMIP，所述功能性单体含有给 体 一 受体—给体(DAD)氢键特征，在此处将其定义为包括吡啶-和嘧啶-基的单体。 一些实例是对二酰亚胺显示出强结合性的2，6-双(丙烯酰 氨基)吡啶(BAAPy)，或一类嘧啶基单体如2， 4-双(丙烯酰氨基)嘧啶。 这些单体基于图2C(A)所示通式结构的6-取代的2，4-双(酰氨基)嘧啶 (其中R!可以是任何基团，但优选"-NC^。" ； R2和113可以是任何基团，但优选"-CH-CH2")。 一个实例是图2C(B)所示的2，4-双(丙烯酰氨 基)-6-哌啶子基-嘧啶。另 一实例是2， 4-双(曱基丙烯酰氨基)-6-哌啶 子基-嘧啶(其中R!可以是任何基团，但优选--NC晶。；R2和R3可以是任 何基团，但优选"-C(CH3)=CH2")。
在又一方面中，本发明涉及抑制非特异性结合所使用的两种不同 方法。
第一种方法是基于添加亲水性共聚单体如甲基丙烯酸2-羟基乙酯 (HEMA)、 N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯 酸酯或甘油-l-甲基丙烯酸酯到单体混合物内的工序。或者，该工序也 可利用同样在聚合/共聚反应开始时，添加可水解的交联单体如季戊四 醇三丙烯酸酯(PETRA)、亚甲基二丙烯酰胺或亚乙基二曱基丙烯酰胺到 单体混合物中。这些亲水性单体在水解之后产生极性官能团并赋予聚 合物基体更多的亲水性特征，从而导致降低了非特异性的疏水性驱动 的结合。
第二种方法是后改性并从而在合成之后对MIP表面进行"亲水化" 的工序。该方法基于使用含有可水解官能团的交联或功能性单体，如 环氧基或酯基。在使用常规工序聚合这些部分之后，可通过水解这些 基团对聚合物的表面进行后处理，从而提供亲水性表面。在使用庞大 的水解试剂的情况下，该方法尤其允许对超过给定尺寸的孔隙进行选 择性的亲水化，即，只有位于尺寸足够大的孔隙内的可水解官能团被 水解。图4图示说明了这种方法。该方法使得结合位点保持一定的疏 水性特征，这类似于在生物受体内发现的情况。
本发明还涉及使用所述AquaMIP从食品中提取核黄素或核黄素扔^ 生物的用途，和本发明在食品加工中的用途。
本发明进一步涉及所述AquaMIP在色谱法中用于制备性分离，在 化学传感器中用于分析样品的预处理和作为合成生物活性化合物的反 应器的用途。
附图简述
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图1图示说明了分子印迹的原理。
图2a列出了用于比较的l-(节基)尿嗜啶和核黄素的结构。 图2b列出了 2，6-双(丙烯酰氨基)吡咬(BAAPy)的结构。 图2c列出了(a)6-取代的2，4-双(酰氨基)嘧啶的通式结构，和 (b)2，4-双(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶的结构。
图2d列出了功能性单体(BAAPy)和核黄素之间的1:1络合物的结构。
图3列出了使用核黄素四乙酸酯作为模板和BAAPy作为功能性单 体合成AquaMIP。
图4列出了与水相容的MIP(AquaMIP)的合成和孔隙尺寸选择的表 面亲水化策略。
图5列出了基于PETRA的可能的可水解交联单体的结构。
发明详述 定义
此处所使用的术语"靶"可与"模板"互换使用。 此处所使用的术语"常规工序"是指制备MIP所最广泛使用的方 案且与术语"非共价方法，，可互换使用。
术语"常规溶剂"是指在常规工序包括的聚合或共聚工艺中使用 的溶剂，它包括成孔溶剂(生孔剂)和具有低到中等极性的非质子溶剂。 此处所使用的术语"常规的MIP"是指使用常规工序生产的MIP。 此处所使用的术语"后改性"或"使…亲水"或"亲水化"可互 换使用，且是指为抑制非特异性结合所描述的第二种方法。该方法使 得超过给定尺寸的孔隙选择性亲水化，且使得结合位点保持一定的疏 水性特征，这类似于在生物受体内发现的情况。图4图示说明了该方 法。
此处所使用的术语"二酰亚胺"是指其中基团"=NH"的两个自由 价连接到酰基上的化合物[如同在"0-C-NH-C-0"中一样]，和如在邻 苯二甲酰亚胺中发现的一样(来自H. Benett编辑的"Concise Chemicaland Technical Dictionary" ，Edward Arnold出版，U丄，1986)。
此处所使用的术语"含有给体-受体-给体(DAD)氢键特征的功能 性单体，，旨在作为含有吡啶和嘧啶基单体的通用术语，正如说明书中所述。
此处所使用的术语"亲水性单体"与术语"亲水性共聚单体"可 互换使用，且旨在包括诸如甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)、 N-乙烯基 吡咯烷酮、丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯酸酯或甘油-l-甲 基丙晞酸酯之类的单体。
此处所使用的术语"亲水性交联单体"是指具有3个或更多个官 能团、可以发生交联反应的单体。实例包括可水解的交联单体如季戊 四醇三丙烯酸酯(PETRA)、亚甲基二丙烯酰胺或亚乙基二曱基丙烯酰 胺。
术语"交联剂"在此处与术语"交联单体"可互换使用。交联剂 的典型实例是EDMA (二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
新型的AQUAMIP
本发明因此涉及新型的与水相容的分子印迹聚合物(AquaMIP),它
能在水或含水介质中选择性地结合靶分子。
本发明进一步涉及新型AquaMIP，它能在水或含水介质中选择性地 结合靶，它可通过包括下述步骤的方法获得
(a) 提供选择的靶或模板的结构类似物，
(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供
一种或多种选择的功能性单体和一种或多种选择的交联剂，
(c) 在所述乾或才莫板的类似物存在下，使所述一种或多种功能性单 体和所述一种或多种交联剂在所述聚合介质中共聚，
(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述模板类似物，
(e) 获得分子印迹聚合物(AquaMIP),
(f) 任选地对所述AquaMIP进行后改性("亲水化")，以减少非特 异性的疏水性结合。在实施例4-8和10-12中例举该方法。
在一个具体的方案中，本发明提供用于分子识别和结合二酰亚胺 或含二酰亚胺的化合物，如千基尿嘧啶、核黄素或其类似物的 AquaMIP。
为结合例如核黄素而设计的AquaMIP因此能在含水条件下，如在 液体食品和饮料(例如啤酒)中占主导的那些条件下，选择性地结合核 黄素。在水和含水介质中，这些AquaMIP显示出对核黄素强的亲合性 和选择性。
此外，在这样特定的方案中，本发明提供新型的分子印迹聚合物， 它能在水或含水介质中结合二酰亚胺或含二酰亚胺的化合物，如苄基 尿嘧啶、核黄素或其类似物，它可通过包括以上对模板或靶所述的步 骤而获得，所不同的是二酰亚胺或含二酰亚胺的化合物用作步骤(a)、 (c)和(d)的模板。因此，该方法的这些步骤是
(a) 提供选择的所选二酰亚胺或含二酰亚胺的靶或模板的结构类 似物，
(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供
一种或多种选择的功能性单体和一种或多种选择的交联剂，
(c) 在所述二酰亚胺或含二酰亚胺的模板类似物存在下，使所述一
种或多种功能性单体和所述一种或多种交联剂在所述聚合介质中共 聚，
(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述二酰亚胺或含二酰 亚胺的靶类似物，
(e) 获得分子印迹聚合物(AquaMIP),
(f) 任选地对所述AquaMIP进行后改性("亲水化")，以减少非特 异性的疏水性结合。
对于核黄素作为二酰亚胺或含二酰亚胺的靶的情况来说，实施例4 和5详细地列举并描述了该方法。
为了获得能在水中结合模板的印迹位点，满足下述标准的核黄素 类似物可用作模板，即(a)在常规聚合介质或溶剂中可溶，(b)在聚合反应条件下稳定，(C)具有与核黄素接近的结构和形状的相似，从而导 致能在含水介质中容纳核黄素的印迹位点。
在本发明中，所使用的核黄素的结构类似物可包括例如具有核黄 素四羧酸酯形式的那些，它们可藉助糖羟基与链烷酸酸酐的简单的一 步酯化反应而合成。
一些实例是核黄素乙酸四酯、核黄素丙酸四酯和
核黄素甲酸四酯。实施例1和2中分别详细地描述了核黄素乙酸四酯 和核黄素丙酸四酯的合成。
本发明还提供使用功能性单体的AquaMIP，所述功能性单体含有给 体 - 受体-给体(DAD)氢键特征，在此处将其定义为包括吡啶-和嘧啶-基的单体。 一些实例是对二酰亚胺显示出强结合性的2，6-双(丙烯酰 氨基)吡啶(BAAPy)，或一类嘧啶基单体如2， 4-双(丙烯酰氨基)嘧啶。 这些单体基于图2C(A)所示通式结构的6-取代的2，4-双(酰氨基)嘧啶 (其中l可以是任何基团，但优选"-NC^。" ； l和R3可以是任何基团， 但优选"-CH=CH2")。 一个实例是图2C(B)所示的2，4-双(丙烯酰氨 基)-6-哌啶子基-嘧啶。另 一 实例是2， 4-双(甲基丙烯酰氨基)-6-哌啶 子基-嘧啶(其中R!可以是任何基团，但优选》NCsH。；R2和R3可以是任 何基团，但优选"-C (CH3) =CH2，，)。实施例3中描述了功能性单体2,4-双(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶和2，4-双(丙烯酰氨基)-4-乙氧基 嘧咬的合成。
在共聚反应中使用的典型的自由基引发剂是偶氮二异丁腈 (AIBN)，但可使用其它合适的引发剂。
共聚反应中使用的典型的交联剂或单体是(二曱基丙烯酸乙二醇 酯)(EDMA)。
因此，使用以上所述的选择的核黄素类似物和功能性单体，根据 所述的方法可合成新型的AquaMIP。
抑制非特异性结合的方法
在又一方面中，本发明涉及抑制非特异性结合所使用的两种不同 方法。本发明因此提供能抑制非特异性结合到印迹聚合物上的AquaMIP。
第一种方法是基于添加亲水单体，如甲基丙烯酸2-幾基乙酯 (HEMA)、 N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、甘油-l-丙烯 酸酯或甘油-l-甲基丙烯酸酯到单体混合物内的工序。或者，该工序也 可利用同样在聚合/共聚反应开始时，添加可水解的交联单体如季戊四 醇三丙烯酸酯(PETRA)、亚甲基二丙烯酰胺或亚乙基二甲基丙烯酰胺到 单体混合物中。这些亲水性单体在水解之后产生极性官能团并赋予聚 合物基体更多的亲水性特征，从而导致降低了非特异性的疏水性驱动 的结合。
在实施例10-12中详细地列举并描述了显示出低的非特异性结合 的这些"特殊"的AquaMIP的合成。
第二种方法是后改性并从而在合成之后对MIP表面进行"亲水化" 的工序。该方法基于使用含有可水解官能团的交联或功能性单体，如 环氧基或酯基。在使用常规工序聚合这些部分之后，可通过水解这些 基团对聚合物的表面进行后处理，从而提供亲水性表面。在使用庞大 的水解试剂的情况下，该方法尤其允许对超过给定尺寸的孔隙进行选 择性的亲水化，即，只有位于尺寸足够大的孔隙内的可水解官能团被 水解。图4图示说明了这种方法。该方法使得结合位点保持一定的疏 水性特征，这类似于在生物受体内发现的情况。
为了进一步阐述该方法，首先合成一 系列的新型可水解的交联单 体，这些交联单体在酰基部分的离去基团的能力方面是不同的。这些 可以是如图5所示的PETRA的单-、二-或三-氯乙酸酯。使用这种交联 剂，通过常规工序制备MIP,之后使MIP进行孔径选择性的水解步骤。 使用氢氧化四烷基铵(QOH)进行所述水解步骤，其中选择烷基的尺寸， 以使得Q0H从对其渗透而言太小的较小孔隙中被排除。按照这一方 式，只有与较大孔隙相关联的酯基将解离和相应的表面被亲水化。这 一通用的工序可应用于对使用常规工序或类似工序制备的任何MIP的 表面进行亲水化。
本发明的AquaMIP可用于从食品中提取亲水性靶或模板分子，和在食品加工应用中使用。
一个具体的方案是将其应用于从食品中提取
核黄素或核黄素衍生物。实施例9表明，本发明的AquaMIP可用于从 啤酒中成功地提取核黄素。通过实施例8中所述的色谱提取方法证明 并举例说明了 MIP的另一成功的应用，其中使用本发明的方法，核黄 素类似物，l-(节基)尿嘧啶在所合成的MIP上保持了显著较长的一段 时间。
本发明进一步涉及将所述AquaMIP用于分析样品的预处理、在色 谱技术中用于制备性分离、在化学传感器中用于基于膜的分离、基于 间歇形式的分离，和作为合成生物活性化合物的反应器的用途。
实施例
现参考许多非限制性实施例，更详细地描述本发明。 A.核黄素类似物的合成(实施例1 - 2)
实施例1:核黄素乙酸四酯的合成
称取2. 65g(7mmol)核黄素，2. 9g(35mrao1)乙酸钠和50ml乙酸酐到 100ml圆底烧瓶内。混合物看起来呈亮橙色的悬浮液。在80 - 90'C的 油浴内加热烧瓶，直到获得深橙红色溶液。然后将该透明溶液倾倒在 含有约200ml冰的Erlenmayer烧瓶内。然后使用固体碳酸氢钠(NaHC03) 中和该混合物，然后用3xl00ml氯仿(CHCl3)提取。合并有机部分并 用硫酸镁(MgSOJ干燥。然后真空蒸发溶剂并获得亮橙色固体。在最小 量的曱醇(MeOH)内重组(recons t i tute)粗产物，然后通过添加水沉淀。
实施例2:核黄素丙酸四酯的合成
称取2. 65g(7mmol)核黄素，3. 4g (35mmo1)丙酸钠和50ml丙酸酐到 100ml圆底烧瓶内。混合物看起来呈亮橙色的悬浮液。在80 - 90'C的 油浴内加热烧瓶，直到获得深橙红色溶液。然后将该透明溶液倾倒在 含有约200ml冰的Erlenmayer烧瓶内。然后使用固体碳酸氢钠(NaHCO》 中和该混合物，然后用3xl00ml氯仿(CHCh)提取。合并有机部分并 用MgSO,干燥。然后真空蒸发溶剂并在所有情况下获得亮橙色固体。 在最小量的MeOH内重组粗产物，然后通过添加水沉淀。B.功能性单体的合成(实施例3)
实施例3: 2，4-双(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶和2，4-双(丙烯 酰氨基)-4-乙氧基嘧啶的合成 以2步进行合成
(la) 2， 4- (二氨基)-6-哌啶子基嘧啶的合成
根据Roth等(参见JACS， 72, 1924 (1950))中公开的工序合成 2，4-(二氨基)-6-哌啶子基嘧啶。在圆底烧瓶内混合14. 48g的4-氯 -(2，6-二氨基)嘧啶和50ml哌啶并搅拌。緩慢升高温度到IO(TC。该 温度下2.5小时之后，将20ml乙醇加入到烧瓶中，并过滤所得混合物。 用50ml乙醇洗涤沉淀。真空蒸发滤液，并在约200ml水中重组固体残 渣。加热该混合物到80。C，然后在剧烈搅拌下使之冷却。以灰白色固 体形式获得2， 4- (二氨基)-6-哌啶子基嘧啶。
(lb) 2， 4-二氨基-6-乙氧基嘧啶的合成
在250ml圆底烧瓶内，将1.8g钠溶解在200ml乙醇中，形成乙醇 钠。然后称取7. 2g的4-氯-(2，6-二氨基)嘧啶加入到该圆底烧瓶内。 回流混合物7天。在这段时间之后，真空蒸发溶剂，和以灰白色固体 的形式获得2，4-二氨基-6-乙氧基嘧啶。不需要进一步的纯化。 (2a)2， 4-双(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶的合成 在100ml氯仿内的4. 2ml三乙胺存在下，使2. 05g (lO咖ol)通过(la) 中所述的工序获得的产物与1.8ml(2当量)丙烯酰氯反应。在冰浴中， 在冷却下逐滴进行添加。在加完之后，在室温下搅拌反应混合物数小 时。真空蒸发溶剂，然后将100ml水加入到固体残渣中，使三乙胺的 盐酸盐(TEA . HC1)溶解。然后用3xlO(hnl CHCl3提取该混合物，合并 有机相，用MgS04干燥，最后真空蒸发溶剂。用乙醇重结晶所得的固 体化合物。
(2b) 2， 4-双(丙烯酰氨基)-6-乙氧基嗜咬的合成 在100ml四氢吹喃内的4. 2ml三乙胺存在下，使1. 54g (1 Ommol) 通过(lb)中所述的工序获得的产物与1.8ml丙烯酰氯反应。在冰浴中，
17在冷却下逐滴进行添加。在加完之后，在室温下搅拌反应混合物数小
时。真空蒸发溶剂，然后将100ml水加入到固体残渣中，使TEA.HC1 溶解。然后用3xl00ml CHCl3提取该混合物，合并有机相，用MgS04 干燥，最后真空蒸发溶剂。最后获得白色固体，且不需要进一步纯化。
C. AquaMIP的合成(实施例4 - 7)
实施例4:使用核黄素四乙酸酯作为核黄素类似物和BAAPY作为功 育巨 性单体制备AquaMIP
在5.6ml CHCl3内混合0. 22g(lmmol)BAAPy与0. 55g (lmmol)核黄 素四乙酸酯。然后将3. 8ml (20mmol)EDMA加入到该溶液中，最后添加 40mg(lwt。/。单体)偶氮引发剂，偶氮二异丁腈(AIBN)。将该混合物转移 到聚合管内，用氮气吹扫10分钟，最后使用火焰燃烧器密封该管。热 引发该聚合反应并使之在恒温水浴内在60'C下聚合24小时。
实施例5:使用核黄素四乙酸酯作为核黄素类似物和2，4-双(丙烯 酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶作为功能性单体制备AquaMIP
在5. 6ml CHC13内混合0. 3g (lmmol) 2， 6-双丙烯酰氨基-4-(哌咬子 基)嘧啶与0. 55g(lmmol)核黄素四乙酸酯，然后将3. 8ml (20mmol)EDMA 加入到该溶液中，最后添加40mg(lwt。/。单体)的偶氮引发剂AIBN。将该 混合物转移到聚合管内，用氮气吹扫IO分钟，最后使用火焰燃烧器密 封该管。热引发该聚合反应并使之在恒温水浴内在60C下聚合24小 时。
实施例6:使用l-(爷基)尿嘧啶作为靶和BAAPy作为功能性单体 制备AquaMIP
在5.6ml CHCh内混合0. 22g(lmmol)BAAPy与0. 2g (lmmol) 1-(节 基)尿嘧咬。然后将3. 8fnl(20mmol)EDMA加入到该溶液中，最后添加 40mg(lwt。/。单体)的偶氮引发剂AIBN。将该混合物转移到聚合管内，用 氮气吹扫IO分钟，最后使用火焰燃烧器密封该管。热引发该聚合反应 并使之在恒温水浴内在60C下聚合24小时。
实施例7:使用l-(爷基)尿嗜啶作为乾和2，4-双(丙烯酰氨基)-6-哌啶子基嘧啶作为功能性单体制备AquaMIP
在5. 6ml CHCl3内混合0. 3g(lmmo1)2， 6-双丙烯酰氨基-4-(哌咬子 基)嘧啶与0. 2g(lmmol)l-(爷基)尿嘧啶。然后将3. 8ml (20mmo1) E賜A 加入到该溶液中，最后添加40rag(lwt。/。单体)的偶氮引发剂AIBN。将该 混合物转移到聚合管内，使用火焰燃烧器密封该管。热引发该聚合反 应并使之在恒温水浴内在6(TC下聚合24小时。
实施例8:将实施例4-7中所述的MIP用作选择性吸附剂的色谱 评价
在恒温浴内24小时之后，在聚合管内获得整料(monolUh)。击破 该管并将该整料粉碎成较小的颗粒。然后将这些较小的颗粒转移到纸 制套管中并放置在索氏提取器装置内。使用Me0H作为提取溶剂进行提 取并持续48小时。然后使用实验室研钵和杵子粉碎该材料，并将所得 的不规则形状颗粒篩分为25微米至50微米。为了除去包含在25-50 微米部分内的细颗粒(<25微米)，使用MeOH(80。/。)和水(2(^)的混合物 沉降该材料，直到上层清液变得透明。然后将颗粒填充在HPLC柱 (U5imnx4mm内径)内。实施例4所述的聚合物在90 %水(含有5 %乙 醇)和10%乙腈中显示出54分钟的核黄素的保留时间，而非印迹聚合 物显示出6.4分钟的保留时间。
实施例6所述的聚合物在100%乙腈中显示出34分钟的l-(节基) 尿嘧啶的保留时间，而非印迹聚合物保留1-(节基)尿嘧啶2. 7分钟。 另外，实施例7中所述的聚合物在相同条件下保留l-(千基)尿嘧梵54 分钟，而非印迹聚合物保留1-(千基)尿嘧啶3. 2分钟。
实施例9: AquaMIP从哞酒中提取核黄素的用途
实施例4所述的AquaMIP可以从啤酒中选择性地结合核黄素。于 是通过用50mg聚合物平衡10ml啤酒样品，约40%的核黄素被AquaMIP 吸附，而非印迹对照聚合物吸附约20% 。
C.显示出降低的非特异性结合的分子印迹聚合物的合成(实施例 10-12)
实施例10:根据实施例、4-7但通过添加亲水性共聚单体制备的MIPs
在5.6ml CHCl3内混合0. 22g(lmmol)BAAPy与0. 55g (lmmol)核黄 素四乙酸酯。然后将3.8ml (20mmol)EDMA和2ml甲基丙烯酸2-羟基乙 酯(HEMA)加入到该溶液中。最后在上述混合物内溶解40mg(lwt。/。单体) 的偶氮引发剂AIBN。将该溶液转移到聚合管内，用氮气吹扫IO分钟， 最后使用火焰燃烧器密封该管。热引发该聚合反应并使之在恒温水浴 内在60。C下聚合24小时。
实施例11:使用核黄素四乙酸酯作为核黄素类似物和BAAPY作为 功能性单体与亲水性交联单体一起制备MIP
在5.6ml CHCh内混合0. 22g(lmmol)BAAPy与0. 55g (lmmol)核黄 素四乙酸酯。然后将20mmo1季戊四醇三丙烯酸酯加入到该溶液中，最 后添加40mg (lwty。单体)的偶氮引发剂AIBN。将该混合物转移到聚合管 内，用氮气吹扫10分钟，最后使用火焰燃烧器密封该管。热引发该聚 合反应并使之在恒温水浴内在60'C下聚合24小时。在聚合之后，如 实施例8所迷加工聚合物，所得聚合物与实施例4和5所述的聚合物 相比，显示出显著降低的非特异性结合。
实施例12:使用核黄素四乙酸酯作为核黄素类似物和BAAPY作为 功能性单体与可水解的交联单体一起制备印迹聚合物并通过碱水解进
行后改性
在5. 6ml CHCl3内混合0. 22g(lmmol)BAAPy与0. 55g (lmmol)核黄 素四乙酸酯。然后将20mmo1季戊四醇三丙烯酸酯单(2-氯乙酸酯)加入 到该溶液中，最后添加40mg(lwt。/。单体)的偶氮引发剂AIBN。将该混合 物转移到聚合管内，用氮气吹扫io分钟，最后使用火焰燃烧器密封该 管。热引发该聚合反应并使之在恒温水浴内在60X:下聚合"小时。 在聚合和如实施例8所述加工之后，在升高的温度下，在氢氧化四丁 基铵(或更长链的氢氧化季铵)的曱醇溶液内悬浮并搅拌聚合物颗粒 24小时。所得聚合物与实施例4和5所述的聚合物相比，显示出显著
降低的非特异性结合。
权利要求
1. 分子印迹聚合物，其特征在于与水相容且具有在水或含水介质 显示出亲水性靶或模板的选择性结合的印迹位点。
2. 根据权利要求1的水相容分子印迹聚合物，其可通过包括下述 步骤的方法获得(a) 提供靶或模板、或其结构类似物，(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供 一种或多种选择的功能性单体、任选的亲水性共聚单体、以及一种或 多种选择的交联剂，该一种或多种选择的交联剂是任选亲水的；(c) 在所述模板类似物存在下，使所述功能性单体和所述交联剂在 所述聚合介质中共聚，(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述模板类似物，(e) 获得水相容分子印迹聚合物，(f) 任选地对所述水相容分子印迹聚合物进行后改性("亲水化")，以减少非特异性的疏水性结合，其中存在所述亲水性单体或所述亲水性交联剂中的至少一种；或 进行步骤(f );或存在所述亲水性单体或所述亲水性交联剂中的至少 一种并进行步骤(f );导致非特异性的疏水性结合的抑制。
3. 根据权利要求2的水相容分子印迹聚合物，其中所述模板是含 酰亚胺的模板或其结构类似物。
4. 根据权利要求3的水相容分子印迹聚合物，其中所述含酰亚胺的模板或其结构类似物选自苄基尿嘧啶、核黄素或其类似物。
5. 根据权利要求4的水相容分子印迹聚合物，其中所述核黄素的 结构类似物选自核黄素四羧酸酯。
6. 根据权利要求5的水相容分子印迹聚合物，其中所述核黄素四 羧酸酯选自核黄素乙酸四酯、核黄素丙酸四酯和核黄素甲酸四酯。
7. 根据权利要求2的水相容分子印迹聚合物，其中所述亲水性共聚 单体当存在时选自甲基丙烯酸2-羟基乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甘油-l-甲基丙烯酸酯和甘油-l-丙烯酸酯。
8. 根据权利要求2的水相容分子印迹聚合物，其中所述亲水性交 联单体当存在时选自季戊四醇三丙烯酸酯、亚甲基二丙烯酰胺或亚乙基二曱基丙烯酰胺。
9. 根据权利要求2的水相容分子印迹聚合物，其中所述功能性单 体为吡啶-基单体或嘧啶-基单体。
10. 根据权利要求9的水相容分子印迹聚合物，其中所述吡咬-基 单体为2，6-双(丙烯酰氨基)吡咬。
11. 根据权利要求9的水相容分子印迹聚合物，其中所述嘧啶-基 单体为选自具有如下通式I的嘧啶-基单体其中Ri选自氢、哌啶子基、C2—u-烷氧基；R2和R3独立地选自可聚 合基团。
12. 根据权利要求ll的水相容分子印迹聚合物，其中R2和R3独立 地选自OCH2、 -C(CH3)=CH2。
13. 生产根据权利要求l的水相容分子印迹聚合物的方法，包括:(a) 提供靶或模板、或其结构类似物，(b) 在含有选择的自由基引发剂的合适的聚合介质或溶剂中，提供 一种或多种选择的功能性单体、任选的亲水性共聚单体、以及一种或 多种选择的交联剂，该一种或多种选择的交联剂是任选亲水的；(c) 在所述模板类似物存在下，使所述功能性单体和所述交联剂在 所述聚合介质中共聚，(d) 通过溶剂萃取或通过光化学方法除去所述模板类似物，(e) 获得水相容分子印迹聚合物，(f)任选地对所述水相容分子印迹聚合物进行后改性("亲水化")， 以减少非特异性的疏水性结合，其中存在所述亲水性单体或所述亲水性交联剂中的至少一种；或 进行步骤(f );或存在所述亲水性单体或所述亲水性交联剂中的至少 一种并进行步骤(f);导致非特异性的疏水性结合的抑制。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述模板是含酰亚胺的模板或 其结构类似物。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述含酰亚胺的模板或其结构 类似物选自节基尿嘧啶、核黄素或其类似物。
16. 根据权利要求15的方法，其中所述核黄素的结构类似物选自 核黄素四羧酸酯。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述核黄素四羧酸酯选自核黄 素乙酸四酯、核黄素丙酸四酯和核黄素甲酸四酯。
18. 根据权利要求13的方法，其中所述亲水性共聚单体当存在时 选自甲基丙烯酸2-羟基乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、甲基丙 烯酰胺、甘油-l-甲基丙烯酸酯和甘油-l-丙烯酸酯。
19. 根据权利要求13的方法，其中当进行亲水化步骤时，使用氩 氧化四烷基铵。
20. 根据权利要求1-12中任一项的水相容分子印迹聚合物用于 从固体和液体食品中提取核黄素或其类似物的用途。
21. 根据权利要求20的用途，其中食品为哗酒。
22. 根据权利要求1-12中任一项的水相容分子印迹聚合物用于 分析样品的预处理、用于色谱技术中的制备性分离、用于化学传感器 中基于膜的分离、基于间歇方式的分离，和作为合成生物活性化合物 反应器的用途。
23. 根据权利要求1-12中任一项的水相容分子印迹聚合物用于 从富水介质中提取亲水性生物分子的用途。
全文摘要
本发明涉及能在水或含水介质中选择性地结合靶分子如核黄素或其类似物的一类新型的与水相容的分子印迹聚合物(AquaMIP)，并涉及其合成和其在食品加工与提取或分离工艺中的用途。
文档编号B01J20/26GK101310855SQ200810099889
公开日2008年11月26日 申请日期2004年1月29日 优先权日2003年1月30日
发明者A·J·霍尔, B·塞勒格伦, P·马内塞奥提斯 申请人:Mip技术股份公司