专利名称：一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法
技术领域：
本发明涉及到- 种双歧杆菌制剂，特别是一种双歧杆菌微胶囊制剂，属于益生菌产品制备技术领域。
背景技术：
双歧杆菌对人体的生理和保健功能已渐渐为人们所熟知。但双歧杆菌的良好益生功能必需要求有大量 的存活菌通过胃环境到达肠道并能够定殖于肠粘膜上。在发酵乳制品中，氧的损伤、胃肠道中胃酸、胆盐 等的作用都会使双歧杆菌的活菌数会大量下降，因而研究如何对双歧杆菌进行有效保护具有重要意义。
微胶囊技术(Microencapsulation)是近年来新兴的一门技术，指采用特殊手段将固、液、气物质包埋成 微小致密胶囊。在双歧杆菌的微胶囊化的制备工艺中，壁材的选择很大程度上决定了微胶囊化的效果。包 埋双歧杆菌的壁材必须考虑以下因素生物安全性，壁材成膜性，包埋率、肠溶性以及微胶囊粒径大小等 因素。
A前制备已报道的应用-T双歧杆菌微胶囊化的壁材分为两类碳水化合物类和蛋白质类。碳水化合物 类的包埋载体以海藻酸钠研究最多，海藻酸钠具有价格低廉、生物相容性好等特点，但是得到的微胶囊产 品粒径偏大，不适合在食品中直接应用，而且在加工过程中经常发生粘连现象，影响产品的得率和菌种的 包埋率。常用的蛋白质类的微胶囊壁材有明胶、阿拉伯胶、果胶等，特点是价格低廉、来源广泛，且菌种 的包埋率也较高，但是得到的产品粒径难以控制，由于明胶等在肠道中的消化率不高，导致产品的肠溶性 很差，大量的双歧杆菌没有被释放，达不到应有的效果。因此，发明一种包埋率高、粒径合适、肠溶性高 的包埋材料可以有效促进双歧杆菌微胶囊制备技术的革新和产业化。
本发明用脱脂乳作为壁材来源，通过乳蛋白和凝乳酶相互作用形成微胶囊。该发明可以解决微胶囊包 埋率低、粒径偏大以及分布不均匀等问题；以食源性的脱脂乳作为壁材，不存在食用安全性的问题；脱脂 乳中的蛋白容易被肠道中的蛋白酶水解，可以有效解决肠溶性差的问题。该发明无论是壁材选择还是成胶 方式在国内外微胶囊技术领域都尚属首次。本研究即以乳蛋白为壁材，利用乳蛋白和凝乳酶的相互作用制 备双歧杆菌微胶囊，通过对关键工艺参数进行优化，得到稳定的、粒径大小均一的双歧杆菌微胶囊，以进 一步提高双歧杆菌在产品及胃肠道中的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，通过制备过程的关键工艺参数的优化(包 括脱脂乳浓度、凝乳时间、植物油添加比例以及搅拌转速等〕，使微胶囊具有最好的包埋效果，促进益生 菌产品制备技术的革新和产业化。
本发明提供的双歧杆菌微胶囊化的方法，壁材由脱脂乳中的蛋白和凝乳酶的相互作用形成，其特征在 于，壁材可以和双歧杆菌均匀的混合并且形成一个微球形的颗粒，可以有效的保护双歧杆菌不受空气和胃 液的影响，到达肠道后能有效的释放。
为实现上述目的，.本发明采用了以下技术方案
(1)将长双歧杆菌BBMN68 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检菌株形态，将活化 菌株以107cfu/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。(2) 将(1)得到菌液4000rpra， 10min离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 配制一定浓度的脱脂乳，62°C 30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混 合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为l-2xl0lflCfU/ml。
(4) 将30g脱脂乳菌悬液冷却至4'C，加入20(^1凝乳酶后4'C下静置。 一段时间后加入200pL 10% (W/V) CaCl2。
(5) 随后将混合物加入一定量植物油中，5'C下搅拌5min。之后将温度升至4(TC，继续搅拌15min。 当温度到达18-2(TC时胶粒开始形成。500rpm lmin离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗 涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。
所述的双歧杆菌为木实验室从广西巴马长寿老人肠道中分离得到，具备一定的益生功能。双歧杆菌 微胶囊化关键工艺参数的设定见表-1 。
表1.双歧杆菌微胶囊化关键工艺参数 Table 1 key processing parameters of Microencapsulation of bifidobacteria
序号参数参数设定值
1脱脂乳浓度％20， 25, 30， 35， 40
2凝乳时间min30, 60, 90' 120
3花生油混合比例10:1, 5: 1， 3: 1， 2: 1
4搅拌转速rpm100' 250, 500, 750， 1000
其中，脱脂乳浓度优选20%~40%,尤其优选25%~35%，最优选30%。凝乳时间优选30min 120min, 尤其优选30 90min，最优选60min。花生油混合比例优选10: 1~2: 1，尤其优选10: 1~3: 1，最优选5: 1。搅拌速度优选100rpin 1000rpm，尤其优选500 1000rpm，最优选750rpm。
1.脱脂乳浓度对BB68包埋率和粒径大小的影响
凝乳时间恒定为60min，花生油混合比例定为10: 1,搅拌转速恒定为500rpm，脱脂乳的浓度分别设 定为20%、 25%、 30%、 35%、 40%。考察脱脂乳浓度对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图1所示， 随着脱脂乳浓度的升高，微胶囊的包埋率和粒径大小都有明显增加；当浓度达到30%和35%时包埋率最高 且二者之间无显著性差异(P>0.05)， 30%形成的粒径略小于35% (p<0.05),并且微胶囊的粒径分布范 围较窄，成球形较好。脱脂乳浓度低于30%时，也能形成粒径很小的胶囊(80um左右)，但包埋率与30% 和35%的浓度有显著差异；当脱脂乳浓度达到40%时，包埋率和30%、 35%的浓度相比没有显著差异(P >0.05),但形成的微胶囊粒径显著增大，达到120um左右，不适合实际的生产和应用。所以，脱脂乳的 最佳浓度选择为30%。
2.凝乳酶作用时间对BB68包埋率和粒径大小的影响
脱胎乳浓度恒定为35%,花生油混合比例定为10: 1，搅拌转速恒定为500rpm，凝乳酶的作用时间分 别设定为30min、 60min、 90min、 120min。考察凝乳时间对BB68包埋率和粒径大小的影响，'结果如图2 所示。其它条件不变的情况下，随着凝乳酶低温作用时间的增长，包埋率在90min以后明显下降，而粒径 大小在60min后就没有显著的差距。凝乳酶作用60min和90min得到的微胶囊粒径比120min时得到的微 胶囊粒径相比没有明显差异，但显著高于作用30min后的粒径大小。凝乳酶作用30min、 60min和90min的包埋率没有显著差异，而作用120min的包埋率明显降低。
3. 花生油的添加比例对BB68包埋率和粒径大小的影响
凝乳时间恒定为60min，脱脂乳浓度恒定为35%，搅拌转速恒定为500rpm，花生油的添加比例分别设 定为10: 1, 5: 1, 3: 1， 2: 1。考察花生油的添加比例对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图3 所示。在其它条件不变的情况下，随着油添加比例的减小，微胶囊包埋率降低，粒径增大。油和脱脂乳比 例为10: l和5: 1制得的微胶囊在粒径和包埋率没有显著性差异(P>0.05)。最终选择油和脱脂乳比例为
4. 乳化时搅拌速度对BB68包埋率和粒径大小的影响
凝乳时间恒定为60min，脱脂乳浓度恒定为35%，花生油混合比例定为10: 1,搅拌速度分别设定为 100rpm、 250rpm、 500rpm、 750rpm、 1000rpm。考察乳化搅拌速度对BB68包埋率和粒径大小的影响，结 果如图4所示。在其它条件不变的情况下，随着转速的提高，胶囊的粒径大小明显降低(p<0.05)，而包 埋率先升高后降低；转速过高时，粒径下降的同时，包埋率也明显下降，；250 750rpm的转速条件下，包 埋率无显著差异(p>0.05),而粒径差异明显(p<0.05),以750rpm条件下的粒径最小。因此选择750rpm 为乳化过程的最佳转速。
5. BB68微胶囊化工艺优化前后效果比较
优化后的工艺为脂乳浓度30%,凝乳酶作用时间为60min，植物油泡合比例为5: 1，乳化时搅拌 转速为750rpm。优化后的工艺与原工艺进行比较，结果如表2:
表2 . BB68微胶囊化丄艺优化前后效果比较
方法包埋率(％)粒径(nm)
优化前15.67±0.5178.0±2.6
优化后19.33±0.5869.4±2.5
从表1结果可以看出，优化前后包埋率提高了 23.3% (p<0.05),粒径大小降低了 11.0% (p<0.05),
优化的效果显著。
6.微胶囊化的双歧杆菌在酸奶中的应用
微胶囊化的双歧杆菌在酸奶中结果如图5所示。4'C条件下贮藏12天内，活菌数无明显变化(pX).05)， 贮藏21天后，活菌数相比丁'O犬，F降了 0.65个数量级，但活菌数依然达到了2xl(/cfu/ml。因此，在酸 奶贮藏期内，微胶囊化的双歧杆菌性能稳定，达到实际应用的要求。
附图1:脱脂乳浓度对BBMN68包埋率和粒径大小的影响 附图2:凝乳时间对BBMN68包埋率和粒径大小的影响 附图3:油的添加比例对BBMN68包埋率和粒径大小的影响 附图4:转速对BBMN68包埋率和粒径大小的影响
附图5:酸奶中微胶囊的稳定性。
具体实施方式
实施例1-9
(1) 将保藏的长双歧杆菌BBMN68 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检培养液菌株 形态，将活化菌株以107cfti/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。
(2) 将(1)得到菌液4000rpm, 10min离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 配制一定浓度的脱脂乳，62°C 30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菡菌体混 合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为l-2xl01()cfu/ml。
(4) 将30g脱脂乳菌悬液冷却至4°C,加入200^1凝乳酶后4'C下静置。 一段时间后加入200pL 10% (W/V) CaCl2。
(5) 凝乳后，后将混合物加入一定量植物油中，5'C下以一定的转速搅拌15min。温度升至40'C， 继续搅拌15min。当温度到达18-20'C时胶粒开始形成。500rpm lmin离心将胶粒从油相中分离出来。得到 的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。
其中，脱脂乳浓度、凝乳时间、花生油的添加比例、乳化时搅拌速度是双歧杆菌微胶囊效果的关键工 艺。工艺参数的设置如表3.工艺参数脱脂乳浓度凝乳时间花生油添加搅拌速度包埋率(％)粒径(l^m)
(%)(min)比例(rpm)
实施例130605:175019.3369.4
实施例220605:175012.1273.1
实施例340-605:175018.9877.9
实施例430305:175017.2171.4
实施例5301205:175014.8768.9
实施例6306010:175019.1170.1
实施例730602:175013.2173.4
实施例830605:110013.8992.1
实施例930605:1100012.5465.权利要求
1、一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，其特征在于，制备方法为(1)将长双歧杆菌BBMN68(保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检菌株形态，将活化菌株以107cfu/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。(2)将(1)得到菌液4000rpm，10min离心得到菌体，收集菌泥。(3)配制20％～40％的脱脂乳，62℃，30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为1-2×1010cfu/ml。(4)将30g脱脂乳菌悬液冷却至4℃，加入200μl凝乳酶后4℃下静置。30min～120min后加入200μL10％(W/V)CaCl2。(5)凝乳后，向混合物加入质量比为10∶1～2∶1的花生油，5℃下100rpm～1000rpm搅拌5min。之后将温度升至40℃，继续搅拌15min。当温度到达18-20℃时胶粒开始形成。500rpm 1min离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。
2、 如权利要求1所述的微胶囊化双歧杆菌的制备方法，其特征在于，制备方法为(1) 将长双歧杆菌BBMN68 (保藏亍中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检菌株形态，将活化 菌株以107cfu/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。(2) 将(1)得到菌液4000rpm， 10min离心得到菌体，收集菌泥。(3) 配制30%的脱脂乳，62°C， 30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合， 搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为l-2xl(Tcfu/ml。(4) 将30g脱脂乳菌悬液冷却至4'C，加入200nl凝乳酶后4'C下静置。60min后加入2C)(HiL 10% (W/V) CaCl2。(5) 凝乳后，向混合物加入质量比为5: 1的花生油，5'C下750rpm搅拌5mim之后将温度升至40°C， 继续搅拌15min。当温度到达18-20'C时胶粒开始形成。500rpm lmin离心将胶粒从油相中分离出来。得到 的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。
3、 一种微胶囊化的双歧杆菌，其特祉在于是由如权利要求1-2中任一种制备方法制得的。
全文摘要
本发明公开了一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，采用脱脂乳作为相分离凝聚法的壁材来源，通过凝乳酶和乳蛋白的相互作用形成微胶囊。技术方案包括脂乳浓度20％～40％，凝乳酶作用时间为30min～120min，植物油混合比例为10∶1～2∶1，乳化时搅拌转速为100rpm～1000rpm。本发明制备的微胶囊化双歧杆菌具有包埋率高、粒径合适、肠溶性高和安全性好等优点，可有效促进双歧杆菌微胶囊制备技术的革新和产业化。
文档编号B01J13/02GK101597604SQ20091013651
公开日2009年12月9日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者任发政, 储一衫, 刘晓飞, 明 张, 杨海莺, 亮 赵 申请人:任发政