专利名称：在变性条件下蛋白纯化的方法
在变性条件下蛋白纯化的方法本发明涉及蛋白纯化的方法以及为此合适的试剂盒和缓冲液体系。为了在变性条件下通过固定化金属亲和色谱(以下IMAC)纯化蛋白，通常或者使 用含盐酸胍的缓冲液(参见Hochuli等人，1988)，或者使用高度浓缩的含尿素的缓冲液。相 对于含盐酸胍的缓冲液，含尿素的缓冲液提供以下优点用含尿素的缓冲液纯化的蛋白可 以直接在SDS凝胶上分析。蛋白与基质的最佳结合、洗涤步骤的严格性以及感兴趣蛋白的 有效洗脱决定性地取决于单个缓冲液的PH值。然而，本领域已知的含尿素的缓冲液随时间失去其缓冲作用，特别是因为其pH值 升高。由此降低洗涤步骤的严格性以及由此的蛋白纯化的选择性。由于较高的PH值，蛋白 非特异性地结合到基质上，并且不再能有效地洗出。洗脱效率也下降。为了在变性条件下 通过IMAC纯化His标记的重组蛋白，由此在每次应用前必须新鲜配制所使用的含尿素的缓 冲液或必须校正其PH值，S卩，重新调节。这是费时的且相应地是不利的。由此出发本发明的目的在于，提供蛋白纯化的改进方法。通过在权利要求1-16中所述的方法、试剂盒和缓冲液体系获得上述问题的解决方案。根据本发明的一个具体实施方式
，提供用于在变性条件下通过IMAC纯化蛋白的 应用缓冲液的方法，该方法的特征在于，将具有预定PH值的预定量的缓冲液浓缩物与预定 量的变性浓缩物，优选尿素浓缩物混合，由此提供具有预定PH值的应用缓冲液。在本发明的上下文中，使用术语“缓冲液浓缩物”和“应用缓冲液”。术语“缓冲液 浓缩物”是指不直接用于纯化而是先与尿素混合的缓冲液，以获得实际的应用缓冲液。缓冲 液浓缩物优选不具有尿素。首先，尿素不以干扰的量存在。术语“应用缓冲液”用于已与尿 素混合并可以直接用于蛋白纯化的缓冲液，例如作为结合缓冲液、洗涤缓冲液或洗脱缓冲 液。本发明的核心是分开提供用于蛋白纯化所必需的、彼此相互反应并由此导致pH 值升高的组分。根据本发明，提供至少一种与尿素浓缩物分开的、具有预定的且相应预调 PH值的缓冲液浓缩物。预定量的尿素浓缩物只在应用前才与预定量的缓冲液浓缩物混合， 由此获得具有预定组成和预定且相应的所期望PH值的应用缓冲液。分开提供浓缩物的优 点在于，单个组分(缓冲液浓缩物和尿素浓缩物)是贮存稳定的并且分开贮存的浓缩物的 PH值在长时间保持恒定(图3中也可见)。通过仅混合2种组分，即缓冲液浓缩物和尿素 浓缩物，在浓缩物长时间贮存后能够自行产生具有预定组成和预定PH值的应用缓冲液(见 图4)。在本发明方法中，与现有技术不同之处在于，在蛋白纯化之前或期间，重新调节pH值 由此是不必要的。也不必完全新配制应用缓冲液。在混合浓缩物之后可直接使用应用缓冲 液。对于用户而言，相应于“即刻可用”反应剂的使用特别是以试剂盒的形式是易于操作和 时间节省的。因为根据本发明总是产生相同组成且具有预定(相同)PH值的应用缓冲液， 因此纯化结果是可重复的且保持相同的质量。避免了应用缓冲液的受PH值限制的波动以 及与此相关的错误根源。根据本发明的方法不仅在手动方式上是用户友好的，此外而且是 可自动化的，因为仅需彼此相互混合组分，而无需精确调整或需要新配制应用缓冲液。用现有技术中已知的缓冲液体系和方法进行自动化是不太可能的。此外，由于缺乏PH稳定性， 能贮存的、封闭的试剂盒理念(在该理念下用户不用改变缓冲液)也是不可能的，因为用户 必须改变所提供的缓冲液(例如调节PH值)。根据本发明的方法，借助Ni2+-NTA(镍-次氮基三乙酸)_色谱特别有用于组氨酸 标记的蛋白纯化。根据本发明方法的具体实施方式
，提供三种缓冲液浓缩物，其各自具有不同的、已 预调的PH值。缓冲液浓缩物的组成可以相同或不同。通过将该浓缩物与预定量的尿素混 合获得至少三种各自具有不同PH值的应用缓冲液。该方法的三个基本步骤，结合到基质、 洗涤基质和随后由基质洗脱感兴趣的蛋白分别需要具有特别合适的，即经调节的PH值的 缓冲液(见上文)。通过提供具有不同PH值的至少三种缓冲液浓缩物，通过与预定量的尿 素浓缩物混合制备至少三种应用缓冲液，该应用缓冲液不仅具有预定的组成，而且具有预 定的和针对各步骤合适的或必需的PH值。该应用缓冲液可直接使用，即无需由用户进一步 改变，或者可在自动方法中使用。根据本发明方法的具体实施方式
，用于制备用于结合的应用缓冲液的缓冲液浓缩 物具有碱性PH值，优选在约7. 0-9. 0的PH值范围内，特别优选约7. 5的PH值。通过将该 缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混合产生具有相同或更高PH值的应用缓冲液。根据 本发明的具体实施方式
，用于结合的应用缓冲液具有碱性PH值，优选7. 0-9. 0的pH值，特 别优选约8的pH值。结合缓冲液也可以作为溶解缓冲液使用且反之亦然。根据该具体实施方式
，用于制备洗涤基质的应用缓冲液的缓冲液浓缩物具有的弱 酸性PH值，优选5. 0-7. 0的pH值，特别优选约5. 6的pH值。通过将这些缓冲液浓缩物与 预定量的尿素浓缩物混合，产生具有较高PH值的应用缓冲液。根据具体实施方式
，用于洗 涤基质和溶解非特异性结合的蛋白的应用缓冲液具有弱酸性至中性的PH值，优选5. 5-7. 0 的PH值，特别优选6-6. 5的pH值。根据具体实施方式
，用于制备洗脱蛋白的应用缓冲液的缓冲液浓缩物具有酸性pH 值，优选小于4的pH值，特别优选小于3. 5的pH值。通过将这些缓冲液浓缩物与预定量的 尿素浓缩物混合，产生具有较高PH值的应用缓冲液。根据具体实施方式
，用于从基质中洗 脱待纯化的蛋白的应用缓冲液具有酸性PH值，优选小于5. 5的pH值，特别优选小于5或在 约4.5的pH值。该缓冲液浓缩物的pH值在长时间保持稳定，如由图3中可见的那样。相对于现有 技术中已知的缓冲液，该PH稳定性的重要原因是在缓冲液浓缩物中不存在干扰量的尿素。 通过将确定量的缓冲液浓缩物与尿素浓缩物有针对性地混合，应用缓冲液实现预先可确定 的或预定的组成和预先可确定的或预定的PH值。通过该pH稳定性和组成恒定，蛋白纯化 方法的结果是可重复的且在质量上是类似的。因为用户不必自己配制缓冲液，避免了在组 成上的波动。由浓缩物产生的应用缓冲液的PH值在浓缩物长时间贮存下保持恒定，如由图 4中可见的那样。该缓冲液浓缩物优选含有生物缓冲液。生物缓冲液以多种形式被使用于生物学和 分子生物学领域。与经典的、无机缓冲的物质不同之处在于，它们不会不利地影响待检测的 体系。生物缓冲液通常含有兼性离子。对生物缓冲液的综述例如在SigmaAldrich的主页 (www. siRmaaldrich. com)上可以找到。
根据本发明的具体实施方式
，用于制备所述结合应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有 在碱性中(优选在约7. 0-9.0的范围内)具有缓冲能力的缓冲液。HEPES(2-(2-羟乙 基)-1-哌嗪基)_乙磺酸)、MES (2-(N-吗啉代)乙磺酸)、磷酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液、 琥珀酸缓冲液或醋酸缓冲液在此作为可能的、根据本发明可使用的缓冲液被提及。优选使 用含胺的缓冲液。生物的、含胺缓冲液的优选实例是Tris缓冲液。根据本发明的具体实施方式
，用于制备所述洗涤应用缓冲液和洗脱应用缓冲液的 缓冲液浓缩物含有在中性至酸性中(优选在约4. 0-7. 5的范围内)具有缓冲能力的缓冲 液。柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液或醋酸缓冲液在此是根据本发明合适的缓冲液。对于生 物缓冲液特别合适的实例是Bis-Tris。用于制备所述洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的缓冲液浓缩物可以具有相同的组分，然 而其中它们具有不同的PH值。所述洗涤浓缩物的pH值高于所述洗脱浓缩物的pH值。根据具体实施方式
，缓冲液浓缩物此外含有盐，例如NaCl、KCl或KH2PO4,优选 NaH2PO4 和 / 或非离子型表面活性剂，例如 TritonXlOO、Triton Xl 14、NP-40、CHAPS、DDM、 b-OG、NG、Brij35或洋地黄皂苷，或优选吐温。根据具体实施方式
，缓冲液浓缩物额外地具 有防腐剂，优选Ni^3。根据本发明方法的具体实施方式
，用于制备应用缓冲液所使用的缓冲液浓缩物含 有25-500mM，优选50-300mM，特别优选100-250mM的三(羟甲基)_氨基甲烷(特别是用于 制备结合缓冲液)或双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(特别是用于制备洗涤 或洗脱缓冲液)，以及额外的125-750mM，优选250_500mM，特别优选300_450mM的NaH2P04 和 / 或 0. 025-0. 5% (ν/ν)，优选 0. 05-0. 3% (ν/ν)，特别优选 0. 1-0. 25% (ν/ν)非离子型 表面活性剂和/或0. 0025-0. 05%，优选0. 005-0. 03%，特别优选0. 01-0. 025%的NaN3。优 选以三(羟甲基)_氨基甲烷氯化物或双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷氯 化物的形式使用三(羟甲基)_氨基甲烷或双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲 焼。根据本发明方法的具体实施方式
，用于制备应用缓冲液的分开提供的尿素浓缩物 是具有8-10M尿素的水溶液；根据优选的具体实施方式
，尿素浓缩物是具有9. 3-9. 8M尿素 的水溶液，优选9. 6M的尿素。根据本发明的具体实施方式
，将1份缓冲液浓缩物与3. 7份尿素浓缩物混合，以获 得根据本发明的应用缓冲液。根据具体实施方式
，将这种混合比例用于制备所有应用缓冲 液。本发明还涉及尿素浓缩物用于制备具有预定pH值的应用缓冲液用途，其中将预 定量的尿素浓缩物与预定量的缓冲液浓缩物混合。通过分开提供尿素浓缩物和其与缓冲液 浓缩物的混合物，在应用前即刻获得不仅具有预定的组分，而且具有确定的、之前预定的PH 值的应用缓冲液。这有助于在蛋白纯化中改善和尤其可标准化的条件。所述优点、尿素和 缓冲液浓缩物的组成的细节已在上文中详细阐明。参照上文公开内容，其也适用于与用途 相关的方面。此外，根据特别的具体实施方式
，提供在变性条件下通过IMAC纯化蛋白的试剂 盒，其具有尿素浓缩物和至少一种具有预定PH值的缓冲液浓缩物用于制备至少一种具有 预定PH值的应用缓冲液。
根据具体实施方式
，该试剂盒具有至少三种分别具有不同的、预定的PH值的缓冲 液浓缩物，其通过分别与预定量的尿素浓缩物混合产生至少三种不同的具有预定组成和预 定PH值的应用缓冲液。由于分开提供浓缩物，根据本发明的试剂盒是稳定的且由此以有利地方式可以贮 存。通过少量且能直接使用的组分明显构成试剂盒，并且对于用户是安全的且能快速使用 的。不需要通过用户调节缓冲液条件，由此产生可重复的且在质量恒定的结果。该试剂盒也 可由很少受过训练的人员使用，因为其降低了出错性。由此其尤其适于高探针处理量。此 外该试剂盒可以与自动化方法结合使用。该试剂盒也可形成在变性条件下通过IMAC纯化蛋白的缓冲液体系，其具有尿素 浓缩物和至少一种具有预定PH值的缓冲液浓缩物，该尿素浓缩物通过与缓冲液浓缩物混 合产生具有预定PH值的应用缓冲液。缓冲液浓缩物、尿素浓缩物以及由此产生的应用缓冲液的详细情况在上文中已详 细地描述。参照上文的实施方式，其也适于与试剂盒相关的方面且是相应公开内容的组成 部分。根据本发明方法的具体实施方式
，用于制备应用缓冲液所使用的缓冲液浓缩物含 有25-500mM，优选50-300mM，特别优选100-250mM的三(羟甲基)_氨基甲烷(特别是用于 制备结合缓冲液)或双三(双O-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(尤其是用于制备洗 涤或洗脱缓冲液)，以及额外的125-750mM，优选250_500mM，特别优选300_450mM的NaH2PO4 和 / 或 0. 025-0. 5% (ν/ν)，优选 0. 05-0. 3% (ν/ν)，特别优选 0. 1-0. 25% (ν/ν)非离子型 表面活性剂和/或0. 0025-0. 05%，优选0. 005-0. 03%，特别优选0. 01-0. 025%的NaN3。优 选以三(羟甲基)_氨基甲烷氯化物或双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷氯 化物的形式使用三(羟甲基)_氨基甲烷或双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲 焼。根据本发明的具体实施方式
，尿素浓缩物是具有8-10M尿素的水溶液；根据本发 明优选的具体实施方式
，尿素浓缩物是具有9. 3-9. 8M，优选9. 6M尿素的水溶液。根据具体实施方式
，对于至少100天，优选150天，试剂盒组分(缓冲液浓缩物、尿 素浓缩物)改变其PH值不超过+/-0.5，优选+/-0.3或+/-0.1。由此它们是能贮存的，且 作为封闭的试剂盒理念能使用的。该能贮存的试剂盒组分优选在至少100天，优选150天的贮存时间后，在将缓冲液 浓缩物与尿素浓缩物混合时产生具有预定PH值+/-0. 5的应用缓冲液。此外，试剂盒可以具有MAC基质，优选Ni2+-NTA基质。其还可以以珠子，优选磁性 颗粒的形式提供。附1 显示了现有技术中已知缓冲液体系的缺乏pH稳定性的问题，该体系按标准 用于6x组氨酸标记蛋白的变性纯化。以下缓冲液组分用于结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱 缓冲液(应用缓冲液)。IOOmM NaH2PO4UOmM Tris、8M尿素和0. 05%吐温20。将结合缓冲液(缓冲液B-T) 的PH值调到pH 8. 0，洗涤缓冲液(缓冲液C-T)的pH值调到pH 6. 3并将洗脱缓冲液(缓 冲液E-T)的pH值调到pH4.5。如图la)_c)所示，各缓冲液的pH值在数天后已线性上升。
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图la)显示用于将蛋白结合到基质上的含尿素的结合缓冲液“缓冲液B-T”的pH 值发展过程。如在图中清晰可见的那样，首先调节到PH 8.0的缓冲液的pH值在数天后线 性上升，并在约2月后达到pH值8. 4。图lb)显示用于从基质中洗涤和溶解非特异性结合蛋白的含尿素的应用缓冲液 “缓冲液c-τ”的PH值发展过程。如在图中清晰可见的那样，首先调节到pH 6. 3的缓冲液 的PH值已经在数天后线性上升，并在约2月后已达到中性pH值7。在这种条件下不能再提 供基质的有效洗涤，PH值必须重新调节。图Ic)显示用于从基质中洗脱感兴趣蛋白的含尿素的应用缓冲液“缓冲液E-T”的 PH值发展过程。如在图中清晰可见的那样，首先调节到pH 4. 5的缓冲液的pH值已经在数 天后线性上升，并在约2月后已达到pH值超过6.5。此处蛋白的有效洗脱已不再可能，pH 值必须重新调节。由于pH升高，蛋白结合到基质上不再是最佳的；此外，损害洗涤步骤的严格性且 洗脱效率下降。在使用这种缓冲液时必要的是经较长时间的按照规律的PH校正。图2 含尿素的缓冲液的pH值升高可以基于此处所述的反应顺序。尿素可以与 Tris反应成过渡化合物，然后由其裂解成氨、强碱。然后通过产生氨，缓冲液的PH值迅速变 成碱性。此外，由于尿素与Tris反应损失了 Tris分子，因此其不能再用于缓冲作用。图3 显示根据本发明的缓冲液浓缩物随时间的pH值稳定性。在不同的时间点 进行8次pH测定。选择以下组分用于缓冲液浓缩物370mM的NaH2P04、185mM的TrisCl、 0. 185% (ν/ν)吐温20,0. 02%的NaR3用于结合缓冲液浓缩物；370mM的NaH2P04U85mM的 Bis-Tris盐酸、0. 185% (ν/ν)吐温20、0. 02%的NaN3用于洗涤缓冲液浓缩物和结合缓冲 液浓缩物。甚至在超过100天后，预调节到pH 7. 5的结合缓冲液浓缩物(此处ΝΤΤ-7. 5)无 波动地保持其PH值。同样，甚至在超过100天后，预调节到pH 5. 6的洗涤缓冲液浓缩物 (此处ΝΤΤ-5. 6)无波动地保持其pH值或保持不值一提的pH值改变。甚至在超过100天 后，预调节到PH 3.0的结合缓冲液浓缩物(此处ΝΤΤ-3.0)没有值得一提的波动地保持其 PH值。该实验显示根据本发明所使用的浓缩物的pH稳定性，由此因其贮存稳定性还可将其 用于封闭的试剂盒体系。图4 显示根据本发明由浓缩物(缓冲液浓缩物和尿素浓缩物)制备的应用缓冲 液的PH值稳定性的实施例(BP=结合缓冲液；WP=洗涤缓冲液；EP=洗脱缓冲液)。为了 制备应用缓冲液，选择具有在图3中所述组分和pH值的缓冲液浓缩物。该尿素浓缩物由 9. 6Μ尿素水溶液组成，由此制成的应用缓冲液具有7. OM尿素。用于结合的应用缓冲液(pH 8. 0)通过将预定量的pH 7. 5的结合缓冲液浓缩物 (见上文)与尿素浓缩物混合而产生。用于洗涤的应用缓冲液(pH 6. 3)通过将洗涤缓冲液 浓缩物(见上文)与尿素浓缩物混合而产生。将应用缓冲液分别在检测前由贮存的浓缩物 (缓冲液浓缩物和尿素浓缩物)混合。由浓缩物产生的用于结合的和用于洗涤的应用缓冲 液直至150天时没有显示值得一提的pH值变化。相应地的结果也符合洗脱缓冲液。用于洗脱的缓冲液(pH 4. 5)通过将预定量的pH 3. 0的缓冲液浓缩物(见上文) 与尿素浓缩物混合。在超过250天的测定时间段时，该洗脱缓冲液浓缩物仅显示微小的、可 以接受的由4. 5到约4. 9的pH值的升高。这显示，即使在较长贮存后，由各浓缩物通过简单混合能获得具有预定组成的和预定的、所期望的PH值的应用缓冲液。其优点已在上文详 细阐明。
权利要求
1.制备用于在变性条件下通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白的应用缓冲液 的方法，其特征在于，将具有预定PH值的预定量的缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混 合，由此提供具有预定PH值的应用缓冲液。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，将分别具有不同PH值的至少三种缓冲液浓缩 物与预定量的尿素浓缩物混合，由此提供分别具有不同预定PH值的三种应用缓冲液。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于以下一种或多种特征a.该缓冲液浓缩物具有碱性PH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于结 合的应用缓冲液；和/或b.该缓冲液浓缩物具有7.0-9. 0的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用 于结合的应用缓冲液；和/或c.该缓冲液浓缩物具有约7.5的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于 结合的应用缓冲液；和/或d.该缓冲液浓缩物具有弱酸性pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于 洗涤的应用缓冲液；和/或e.该缓冲液浓缩物具有5.5-7. 0的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用 于洗涤的应用缓冲液；和/或f.该缓冲液浓缩物具有约5.6的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于 洗涤的应用缓冲液；和/或g.该缓冲液浓缩物具有酸性PH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于洗 脱的应用缓冲液；和/或h.该缓冲液浓缩物具有小于4的pH值，优选小于3.5，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩 物混合后是用于洗脱的应用缓冲液。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于以下一种或多种特征a.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于结合的应用缓冲液具有碱性pH 值；和/或b.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于结合的应用缓冲液具有 7. 0-9. 0的pH值；和/或c.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于结合的应用缓冲液具有约8的 PH值；和/或d.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于洗涤的应用缓冲液具有弱酸性 至中性的PH值；和/或e.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于洗涤的应用缓冲液具有 5. 5-9.0的pH值；和/或f.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于洗涤的应用缓冲液具有6-6.5 的PH值；和/或g.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于洗脱的应用缓冲液具有酸性PH 值；和/或h.通过将缓冲液浓缩物与尿素浓缩物混合产生的用于洗脱的应用缓冲液具有小于 5. 5，优选小于5的pH值。
5.根据权利要求1-4任一项或多项的方法，其特征在于，所述具有预定pH值的缓冲液 浓缩物含有生物缓冲液。
6.根据权利要求1-5任一项或多项的方法，其特征在于，a.用于制备结合应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有在碱性中具有缓冲能力的缓冲液，优 选iTris ；和b.用于制备洗涤缓冲液和应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有在中性至酸性中具有缓冲 能力的缓冲液，优选Bis-Tris ；和/或c.缓冲液浓缩物含有盐，优选NaH2PO4和/或去污剂，优选吐温和/或防腐剂，优选NaN3O
7.根据权利要求1-6任一项或多项的方法，其特征在于，使用具有8-10M，优选 9. 3-9. 8M尿素的水溶液作为尿素浓缩物。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于，以1 3. 7的比例混合尿素浓缩物和 至少一种缓冲液浓缩物。
9.尿素浓缩物用于制备具有预定pH值的应用缓冲液的用途，其中将预定量的尿素浓 缩物与具有预调PH值的预定量缓冲液浓缩物混合。
10.用于在变性条件下通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白的试剂盒，包含用于 制备具有预定PH值的应用缓冲液的至少一种具有预定pH值的缓冲液浓缩物以及至少一种 尿素浓缩物。
11.根据权利要求10的试剂盒，含有用于制备至少3种各自具有不同预定pH值的应用 缓冲液的至少3种具有不同预定pH值的缓冲液浓缩物以及尿素浓缩物。
12.根据权利要求10或11的试剂盒，其特征在于以下一种或多种特征a.该缓冲液浓缩物具有碱性pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于结 合的应用缓冲液；和/或b.该缓冲液浓缩物具有7.0-9. O的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用 于结合的应用缓冲液；和/或c.该缓冲液浓缩物具有约7.5的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于 结合的应用缓冲液；和/或d.该缓冲液浓缩物具有弱酸性至中性pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后 是用于洗涤的应用缓冲液；和/或e.该缓冲液浓缩物具有5.5-7. O的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用 于洗涤的应用缓冲液；和/或f.该缓冲液浓缩物具有约5.6的pH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于 洗涤的应用缓冲液；和/或g.该缓冲液浓缩物具有酸性PH值，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩物混合后是用于洗 脱的应用缓冲液；和/或h.该缓冲液浓缩物具有小于4的pH值，优选小于3.5，该缓冲液浓缩物在与尿素浓缩 物混合后是用于洗脱的应用缓冲液。
13.根据权利要求10-12任一项或多项的试剂盒，其特征在于，所述具有预定pH值的缓 冲液浓缩物含有生物缓冲液。
14.根据权利要求1-13任一项或多项的试剂盒，其特征在于，a.用于制备结合应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有在碱性中具有缓冲能力的缓冲液，优 选iTris ；和b.用于制备洗涤缓冲液和应用缓冲液的缓冲液浓缩物含有在中性至酸性中具有缓冲 能力的缓冲液，优选Bis-Tris ；和/或c.缓冲液浓缩物含有盐，优选NaH2PO4和/或去污剂，优选吐温和/或防腐剂，优选NaN3O
15.根据权利要求10-14任一项或多项的试剂盒，其特征在于，是缓冲液体系。
16.根据权利要求10-14任一项或多项的试剂盒，其特征在于以下一种或多种特征a.对于至少100天，优选至少150天，试剂盒组分改变其pH值不超过+/-0.1 ；和/或b.在贮存至少100天，优选150天后，通过混合缓冲液浓缩物与尿素浓缩物，试剂盒组 分产生具有预定PH值+/-0. 5的应用缓冲液；和/或c.所述试剂盒具有基质，优选IMAC，优选Ni2+-NTA；和/或d.所述试剂盒能用于自动化应用。
17.根据权利要求1-16任一项或多项的试剂盒，其特征在于，试剂盒具有IMAC基质，优 选以磁性颗粒的形式。
全文摘要
本发明涉及制备用于在变性条件下通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化蛋白的应用缓冲液的方法，其特征在于，将具有预定pH值的预定量的缓冲液浓缩物与预定量的尿素浓缩物混合，由此提供具有预定pH值的应用缓冲液。根据本发明还提供相应的试剂盒。其组分是贮存稳定的且通过混合产生具有预定pH值的预定组成的应用缓冲液。本发明由此是能自动化和作为封闭试剂盒理念能使用的。
文档编号B01D15/38GK102076394SQ200980124098
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月27日
发明者F·斯查弗, H·布洛克, T·德特斯克曼 申请人:快而精有限公司