专利名称：一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法
技术领域：
一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法，属于生物制品的 加工技术领域。
背景技术：
L-缬氨酸属于分支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人体必需氨 基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及调味剂、动物饲料和化妆品的制造， 在医学研究和治疗中的作用也日益受到重视。近年来在我国科技人员的努力下，我国发酵法生产缬氨酸的上游技术也取得长足 进步，基本达到了工业化水平。但缬氨酸发酵过程中产生的0.5%左右的丙氨酸和亮氨酸与 其化学性质相近、分离困难。传统的离子交换等分离方法制取的成品中缬氨酸含量低，杂质 多，大部分只符合食品添加剂的质量标准，制约了其价格。无锡晶海氨基酸有限公司宁健飞等人在专利号为CN101503366的《膜分离与工 业色谱分离联用提取分离L-缬氨酸的方法》中使用膜分离与工业色谱分离联用提取分离 L-缬氨酸的方法有较高的收率与产品纯度，但是使用存在效率低、时间长、成本高等缺点。 彭奇均等在专利号CN101168512的《一种从缬氨酸液中分离提纯缬氨酸的方法》中，设计了 一种五区模拟移动床分离缬氨酸的方法，但该方法仅能得到纯度为93%左右的缬氨酸，无 法得到更高纯度的缬氨酸，另外其采用的金属鳌合树脂对缬氨酸的特异性吸附较差，导致 了分离纯度的下降。万贵红等人(模拟移动床技术分离缬氨酸和丙氨酸，食品与发酵工业， 2005，31 (12)，50-53)也报道了一种模拟移动床色谱分离缬氨酸的方法，但需采用氨水等试 剂，对环境会产生很大的污染，而且产品纯度也较低。
发明内容
本发明的目的在于针对当前缬氨酸分离过程中存在的问题，本发明以水为流动 相，以先前发明的缬氨酸分离专用树脂为固定相，并设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性 的模拟移动床色谱分离装置，可以完全去除缬氨酸发酵液中的杂质丙氨酸与亮氨酸，使产 品纯度达到99. 7%以上，达到药用标准，可实现连续化生产，有较高的回收率和生产强度。本发明的技术方案一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方 法，设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以缬 氨酸分离专用树脂为固定相，对缬氨酸发酵液中缬氨酸进行连续分离纯化，步骤如下
(1)设计了开放式五区模拟移动床色谱分离装置，该装置共有5区，每个区由1-3根色 谱柱组成，并串联联接，所有色谱柱的规格完全相同，柱直径为l-50cm，色谱柱采用夹套加 热保温；每两根柱子中间有3个出口，3个入口，分离过程除了区5和区1之间有两个出、 入口可用外，其它区/柱中间只有一个出、入口可用，不用的出、入口均处于关闭状态；区 1-区2-区3-区4-区5的方向为液流方向，区5-区4-区3-区2-区1-区5为柱切换方
3向；柱内装有缬氨酸专用分离树脂；区1和区5之间的开放结构保证了填料被充分清洗，从 而可以制备得到高纯度的缬氨酸。附图中实线为液流方向，虚线为柱切换方向，设备运行 的基本原理可参见之前发明人已发表的文章(模拟移动床色谱技术及其应用，色谱，2004， 22(2)，111-115)。柱内装有自主研发的缬氨酸专用分离树脂，中国专利200910231735.4已 公开，该树脂对缬氨酸具有很强的特异性吸附能力。(2)缬氨酸发酵过程结束后，用盐酸将发酵液pH调节到2-5，离心去除菌体、蛋白 质和多糖杂质，然后将得到的清液用活性炭脱色；
(3)将脱色后的缬氨酸发酵液在60°C真空减压浓缩，控制清液中缬氨酸质量浓度为70 -80 g/L ；或者发酵液不经浓缩直接进行分离；
(4)将清液放入步骤(1)所述的模拟移动床色谱分离装置中进行分离，从出口1中 得到高纯度的缬氨酸溶液，再经浓缩、结晶得到固体缬氨酸成品；流动相为水，水温控制在 20-800C ；5个区中的液体线速度控制在2-lOOcm/min ；出口 2中得到弱吸附杂质，出口 3中 得到强吸附杂质，这些杂质包括未发酵完的葡萄糖、发酵过程中产生的丙氨酸、异亮氨酸， 少量杂蛋白质。所述中国专利200910231735. 4已公开的缬氨酸分离专用大孔吸附树脂的制备方 法，步骤为
(1)用蒸馏水配制水相物质其中聚乙烯醇质量浓度0.1%-2%，和NH4SO4质量浓度 0. 5%-6% ；
(2)配制有机相物质取交联剂与极性单体混合，交联剂与极性单体重量比为 10:1-2. 5:1，向其中加入混合物1-3倍体积的致孔剂，使极性单体与交联剂进行悬浮共聚 合，得到有机相物质；
(3)树脂制备将水相物质升温至30-40°C，边搅拌边将有机相物质和二碳酸二叔丁酯 倒入水相物质中，完成混合后升温至70-80°C，聚合反应4-5小时，水相与有机相的质量比 例为20:1-5:1，二碳酸二叔丁酯占反应体系总重量的0. 1%-1% ；
(4)后处理滤出树脂，用水清洗，真空干燥，真空度为lOOPa，干燥温度40°C，得到 120-150 μ m粒径成品大孔吸附树脂；
所述的交联剂选用苯乙烯、二乙烯苯、三乙烯苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基苯、二乙烯 基二甲苯、二乙烯基乙基苯中的一种或几种；
所述的极性单体选用丙烯酸乙酯、醋酸丙烯酯、醋酸烯丙酯或甲基乙烯基吡咯烷酮； 所述的致孔剂选用甲苯、二甲苯、200#汽油、庚烷、异辛烷、正丁醇或叔戊醇。所述的NH4SO4 可以用 NaSO4, NaCl，MgCl2 或 MgSO4 替代。所述的交联剂选用二乙烯苯与苯乙烯以质量比1 1的比例使用。所述的极性单体与交联剂的比例是0. 18 1。所述的致孔剂是甲苯或200#汽油，致孔剂的加量为单体混合物总量的2倍体积。本发明的有益效果1、得到高纯度的缬氨酸，同时也可以得到较高纯度的丙氨酸 和亮氨酸；2、采用连续色谱进行分离，使树脂得到有效的利用；3、生产过程完全自动化，生 产强度低；4、生产过程用水做流动相，成本低廉，基本没有污染物产生，有利于保护环境。
图1模拟移动床色谱柱分区图。
具体实施例方式实施例1
发酵结束后缬氨酸浓度约为30g/L，用盐酸调节到pH2，3000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量5%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80g/ L0模拟移动床内柱的直径为5cm，1-5区的柱的数目为2、2、2、2、2，1-5区的流速度分别为 25、15、20、16、30 cm/min，系统温度控制在60°C，发酵清液的处理量为98 mL/min。最终从 出口 1得到的缬氨酸产品浓度为32g/L，纯度达99. 5%，回收率为80%。实施例2:
发酵结束后缬氨酸浓度约为35 g/L，用盐酸调节到pH5，8000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量10%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为70g/ L0模拟移动床内柱的直径为1cm，1-5区的柱的数目为1、1、1、1、1，1_5区的流速度分别为 30、22、27、18、50 cm/min，系统温度控制在80°C，发酵清液的处理量为3. 9mL/min。最终从 出口 1得到的缬氨酸产品浓度为32. 8 g/L，纯度达99. 1%，回收率为75 %。实施例3:
发酵结束后缬氨酸浓度约为20g/L，用盐酸调节到pH3，10000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量4%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为75g/ L0模拟移动床内柱的直径为20cm，1-5区的柱的数目为3、3、3、3、3，1_5区的流速度分别 为35、25、32、16、40 cm/min，系统温度控制在20°C，发酵清液的处理量为2. 2 L/min。最终 从出口 1得到的缬氨酸产品浓度为37. 8 g/L，纯度达99. 0%，回收率为72 %。实施例4:
发酵结束后缬氨酸浓度约为30g/L，用盐酸调节到pH4，5000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量10%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80g/ L0模拟移动床内柱的直径为50cm，1-5区的柱的数目为2、3、3、1、2，1_5区的流速度分别 为37、20、30、15、35 cm/min，系统温度控制在70°C，发酵清液的处理量为19. 6 L/min。最终 从出口 1得到的缬氨酸产品浓度为35. 8 g/L，纯度达99. 3%，回收率为76 %。实施例5:
发酵结束后缬氨酸浓度约为30g/L，用盐酸调节到pH3，7000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量6%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80g/ L0模拟移动床内柱的直径为30cm，1-5区的柱的数目为2、2、3、1、3，1_5区的流速度分别 为28、19、26、17、32 cm/min，系统温度控制在50°C，发酵清液的处理量为4. 9 L/min。最终 从出口 1得到的缬氨酸产品浓度为46. 6 g/L,纯度达99. 6%，回收率为75 %。实施例5
发酵结束后缬氨酸浓度约为32g/L，用盐酸调节到pH3，8000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量4%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为70 g/ L。模拟移动床内柱的直径为10cm，1-5区的柱的数目为2、1、2、1、3，1-5区的流速度分别为 8、2、7、3、10cm/min，系统温度控制在30°C，发酵清液的处理量为392mL/min。最终从出口 1得到的缬氨酸产品浓度为42 g/L，纯度达99. 1%，回收率为72 %。
实施例6:
发酵结束后缬氨酸浓度约为35g/L，用盐酸调节到pH3，5000转/min离心后得到上清 液，加入清液重量4%的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80 g/ L0模拟移动床内柱的直径为50cm，1-5区的柱的数目为2、1、2、1、3，1_5区的流速度分别 为100、60、90、70、100 cm/min，系统温度控制在30°C，发酵清液的处理量为58. 9L/min。最 终从出口 1得到的缬氨酸产品浓度为17. 9 g/L，纯度达99. 0%，回收率为68 %。
权利要求
一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法，其特征在于设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以缬氨酸分离专用树脂为固定相，对缬氨酸发酵液中缬氨酸进行连续分离纯化，步骤如下(1)设计了开放式五区模拟移动床色谱分离装置，该装置共有5区，每个区由1 3根色谱柱组成，并串联联接，所有色谱柱的规格完全相同，柱直径为1 50cm，色谱柱采用夹套加热保温；每两根柱子中间有3个出口，3个入口，分离过程除了区5和区1之间有两个出、入口可用外，其它区/柱中间只有一个出、入口可用，不用的出、入口均处于关闭状态；区1 区2 区3 区4 区5的方向为液流方向，区5 区4 区3 区2 区1 区5为柱切换方向；柱内装有缬氨酸专用分离树脂； (2)缬氨酸发酵过程结束后，用盐酸将发酵液pH调节到2 5，离心去除菌体、蛋白质和多糖杂质，然后将得到的清液用活性炭脱色；(3)将脱色后的缬氨酸发酵液在60℃真空减压浓缩，控制清液中缬氨酸质量浓度为70 80 g/L；或者发酵液不经浓缩直接进行分离；(4)将清液放入步骤(1)所述的模拟移动床色谱分离装置中进行分离，从出口1中得到高纯度的缬氨酸溶液，再经浓缩、结晶得到固体缬氨酸成品；流动相为水，水温控制在20 80℃；5个区中的液体线速度控制在2 100 cm/min；出口2中得到弱吸附杂质，出口3中得到强吸附杂质，这些杂质包括未发酵完的葡萄糖、发酵过程中产生的丙氨酸、异亮氨酸，少量杂蛋白质。
全文摘要
一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法，属于生物制品加工技术领域。本发明设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以先前发明的缬氨酸分离专用树脂(中国专利200910231735.4已公开)为固定相，采用本发明方法可以完全去除缬氨酸发酵液中的杂质丙氨酸与亮氨酸，使产品纯度达到99.7%以上，达到药用标准，可实现连续化生产，有较高的回收率和生产强度，克服了当前缬氨酸分离纯化过程中存在的纯度低、效率低和污染大等缺点。
文档编号B01D15/18GK101948399SQ20101050281
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者丁彦蕊, 廖祥儒, 张伟国, 张大兵, 李枝玲, 王亚辉, 罗军侠, 蔡宇杰 申请人:江南大学