专利名称：组合搅动器的制作方法
技术领域：
本发明报道一种搅拌器、一种包括该搅拌器的装置和该搅拌器用于细胞培育的用途。该搅拌器包括至少一个轴向输送元件和至少一个径向输送元件，例如作为径向输送元件的锚式叶轮和作为轴向输送元件的一个或多个倾斜叶片式叶轮的组合。使用该搅拌器使得改善了渗析过程中的混合且特别是降低了生物淤积(biofowl)并提高了传质速率。
背景技术：
借助于原核细胞和真核细胞产生重组蛋白质、疫苗和抗体在现代药品生产中起到重要作用。为了产生复杂的翻译后修饰的蛋白质和抗体，主要使用动物衍生细胞。然而，使用动物衍生细胞由于这些细胞的特定特征例如培养介质、对限制和抑制(例如受乳酸盐、 CO2、氨酸盐等限制和抑制)的敏感、敏感的外隔膜(剪切应力)、低比率(specific rate) 和对培养条件的变化的敏感(例如，由于局部不同质、PH变化、p02变化等)而对发酵过程的需求高。当设计生物反应器时且对于过程控制必须考虑这些特性。近年来，已开发各种用于培养细胞的反应器。不论类型如何，反应器都必须能够满足以下基本技术功能充足的悬浮及同质化、充足的材料和热传递以及细胞上最小化的剪切应力。搅拌罐式反应器尤其适合工业使用。在这种反应器中，通过机械搅拌传入满足基本功能所需的能量。为了实现高产品滴定度和符合规格的产品质量，除细胞株发育、介质组分和反应器设计以外该反应器的操作模式特别地起到重要作用。一般采用以下操作模式分批过程、 补料分批过程、保留或不保留细胞的连续过程(例如灌注或恒化)以及半连续过程例如内部渗析或外部渗析。为了防止营养限制，以浓缩溶液的形式对反应器添加补料溶液(所谓的补料分批过程)。为了避免受细胞新陈代谢的最终产物抑制，必须从反应器或者从反应器中的培养介质去除细胞的新陈代谢产物。这例如能够通过灌注或渗析来执行。在渗析的情况下，外部渗析与内部渗析之间有一定区别。EP 1474223报道了一种动态混合器。DE 102005053333中报道了一种动物细胞培养装置，该动物细胞培养装置包括用于摄取细胞悬浮液的容器、用于将气体供给到细胞悬浮液内和从细胞悬浮液排出气体的装置和用于在细胞悬浮液中产生电流的装置。EP 0224800中报道了用于细胞培养的方法和设备。Nomura, Τ.等人，J. Chem. Eng. Jap. 29(1996) 134-138报道了用于圆底烧瓶的折叠锚式叶轮的发育和混合特征。WO 01/41919中报道了一种用于在搅拌罐式反应器中混合气体-液体的叶轮通气管式搅拌系统。US 4，438，074中报道了一种连续聚合式反应器。EP-A 0200886中报道了一种用于将气体转移到液体中的搅拌系统和方法。EP-B 0049229中报道了一种具有搅拌装置的烹饪设备
发明内容
如本文报道的搅拌器至少i)与其它搅动器相比允许培养介质的快速混合，例如， 以用于经由液体或培育介质表面导入诸如酸或碱之类的修正剂，ii)减少泡沫形成，iii) 减少渗析过程中的生物积垢，和iv)由于作为不同的输送元件的组合的结果的朝渗析模块的直接正交流动而增加渗析过程中的传质。本文报道一种搅拌器(组合搅动器)，该搅拌器包括相对于搅拌器的轴的至少一个轴向输送元件和至少一个径向输送元件，其中所述至少一个轴向输送元件的最大直径等于或小于径向输送元件的内径屯。如本文报道的一方面是一种搅拌器，该搅拌器包括-包括至少两个搅动器叶片的一个径向输送元件，和- 一个或多个轴向输送元件，每个轴向输送元件都包括至少两个搅动器叶片，其中径向输送元件的搅动器叶片彼此平行并与搅拌器的轴心线(shaft axis)平行，并且其中所有轴向输送元件的外径等于或小于径向输送元件的内径，并且其中所有轴向输送元件单独连接到径向输送元件，并且其中所有轴向输送元件位于径向输送元件内，并且其中所有输送元件相对于彼此和相对于搅拌器的轴心线具有固定的空间取向。在一个实施例中，该搅拌器包括1至5个轴向输送元件，或者，在另一个实施例中， 包括1至3个轴向输送元件，或者，在再一个实施例中，包括1个或2个轴向输送元件。在一个实施例中，所述至少一个轴向输送元件位于从搅拌器的头部确定的搅拌器的上部五分之四中并与搅拌器的头部相距最大距离h4/5。在再一个实施例中，一个轴向输送元件从径向输送元件的叶片顶部位于80%的最大距离处(S卩，相距0.他的最大距离)和/或一个轴向输送元件从径向输送元件的叶片顶部位于20%的最大距离处(即，相距0. 2h的最大距离)。 在又一个实施例中，所述至少一个轴向输送元件和所述至少一个径向输送元件一起形成单个元件。在另一个实施例中，径向输送元件的相对的搅动器叶片通过轴向输送元件的两个相对的搅动器叶片彼此连结。在一个实施例中，所有轴向输送元件的直径相同。在另一个实施例中，从旋桨式搅拌器、斜叶式(pitched-blade)搅拌器或倾斜叶片式搅拌器中彼此独立地选择轴向输送元件。如果轴向输送元件的直径小于径向输送元件的内径，则轴向输送元件的搅动器叶片的末端与径向输送元件的内缘之间的空间距离通过连接器搭接/桥接。在一个实施例中，该连接器选自金属丝、杆、薄板和盘状件。在又一个实施例中，所有输送元件——即轴向输送元件及径向输送元件——当搅拌器在培育器皿中操作时以每时间单位相同的转数围绕搅拌器的轴心线旋转。在一个实施例中，输送元件被永久地结合在一起并且搅拌器由一个部件组成，即，两种元件由同一旋转轴驱动并且围绕搅拌器的轴心线每时间单位具有相同的转数。搅拌器直径(d)与培育器皿直径(D)的比例d/D在一个实施例中为从0.2至0.8， 在另一个实施例中为从0. 3至0. 6，并且在再一个实施例中为从0. 33至0. 5。叶片高度(h) 与搅拌器直径(d)的比例h/d在另一个实施例中为从0.5至5，在另一个实施例中为从1 至4，并且在再一个实施例中为从1至3。搅拌器叶片宽度(b)与搅拌器直径(d)的比例 b/d在再另一个实施例中为从0. 05至0. 3，在另一个实施例中为从0. 1至0. 25。术语“为从...至”表示包括所列边界值的范围。在另一个实施例中，搅拌器直径(d)选自500mm、 600mm、700mm、800mm、1000mm、1200mm、1400mm、1600mm、1800mm 和 2000mm。在又一个实施例中，搅拌器叶片宽度(b)选自 42mm、60mm、89mm、108mm、133mm。 在一个实施例中，所述一个径向输送元件是锚式叶轮。在又一个实施例中，连接径向输送元件的单独的搅动器叶片的元件是轴向输送元件的搅动器叶片(连接用搅动器叶片)。在一个实施例中，连接用搅动器叶片起到轴向输送元件作用的20%至100%，在另一个实施例中，起到轴向输送元件作用的50%到100%，并且在再一个实施例中，起到轴向输送元件作用的大约100%。术语“大约”表示给出的值是跨越该值左右+/-10%的范围的中心点。如果该值是百分比值，则“大约”还表示平均(数)+/-10%，但不能超过值100%。在又一个实施例中，轴向输送元件是倾斜叶片式搅动器。在另一个实施例中，径向输送元件是锚式叶轮并且轴向输送元件是倾斜叶片式搅动器，其中该倾斜叶片式搅动器设计成起到锚式叶轮的叶片的连接元件的作用。在另一个实施例中，径向输送元件的所有相对的叶片经由轴向输送元件的叶片彼此连接。在一个实施例中，搅拌器由一个或两个轴向输送元件和一个径向输送元件相对于搅拌器的轴心线的组合组成。在另一个实施例中，径向输送元件是锚式叶轮并且轴向输送元件是两个倾斜叶片式搅动器，其中倾斜叶片式搅动器的叶片设计成起到相对的锚式叶轮叶片的连接元件的作用。轴向输送元件的高度与径向输送元件的叶片宽度的比例hSB/b为从0. 5至4，在另一个实施例中为从0. 8至3，并且在再一个实施例中为从1至2。在另一个实施例中，倾斜叶片式搅动器的搅动器叶片相对于搅拌器的轴心线的倾角/俯仰角为从10°至80°，在又一个实施例中为从至60°，并且在再一个实施例中为从40°至50°。在一个实施例中，径向输送元件具有1至8个搅动器叶片，在另一个实施例中具有 1至4个搅动器叶片，并且在再一个实施例中具有4个搅动器叶片。轴向输送元件在一个实施例中具有1至10个搅动器叶片，在另一个实施例中具有2至6个搅动器叶片，并且在再一个实施例中具有4个搅动器叶片。在另一个实施例中，径向输送元件和轴向输送元件具有相同的搅动器叶片数。在一个实施例中，搅拌器的轴上的锁紧装置从搅拌器头部看去位于下部三分之一中并且缩小部分(减缩部，渐缩部)的高度OO与紧固盖的高度OO的比例hu/hm为从ο. 05 至1，在另一个实施例中为从0. 2至0. 8，并且在再一个实施例中为从0. 3至0. 5。搅拌器在一个实施例中具有至少200mm的高度，在另一个实施例中具有从200mm 至5000mm的高度。在另一个实施例中，搅拌器的高度是径向输送元件的叶片的高度h。本文一方面还报道了一种包括培育器皿和如本文报道的搅拌器的装置。在一个实施例中，搅拌器和培育器皿形成功能单元，即，搅拌器位于培育器皿内并且能够不受任何空间限制地在培育器皿内旋转。在一个实施例中，该装置还包括渗析模块。在一个实施例中， 培育器皿为搅拌罐式反应器。在又一个实施例中，培育器皿是充气的或浸入充气搅拌罐式反应器。在一个实施例中，培育器皿包括从2至4个挡板。在另一个实施例中，挡板在培育器皿的内表面的圆周周围等距地隔开。搅拌器直径(d)与培育器皿直径(D)的比例d/D在一个实施例中为从0.2至0.8， 在另一个实施例中为从0. 3至0. 6，并且在再一个实施例中为从0. 33至0. 5。在另一个实施例中，反应器皿的填充高度(H)与培育器皿直径(D)的比例H/D为从1.0至2. 5，在又一个实施例中为从1. 1至2.0，并且在再一个实施例中为从1.4至1.8。在一个实施例中，培育器皿具有从5L至25，000L的工作容积。本文在一方面还报道了如本文报道的搅拌器或装置的用途。在一个实施例中，该用途是用于培育细胞以用于产生多肽，即，用于培育表达由异源核酸编码的多肽的细胞。在一个实施例中，所述培养为渗析。在又一个实施例中，在浸入充气搅拌罐式反应器中执行所述培育。在另一个实施例中，所述细胞是真核细胞。在再一个实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在再又一个实施例中，所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、COS细胞、PER. C6细胞、Sp2/0细胞和HEK 293细胞。在一个实施例中，所述多肽是抗体。在又一个实施例中，所述抗体是抗 CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA, CD56、VEGF, VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受体或IGF-1受体的抗体。本文在一方面还报道了一种用于产生多肽的方法，该方法包括a)提供包含编码多肽的核酸的细胞，b)提供如本文报道的装置，c)在装置中在培育介质中培育细胞，其中搅拌器在培育器皿中提供湍流，和d)从细胞或培育介质回收多肽并由此产生多肽。在一个实施例中，该方法用于培育表达由异源核酸编码的多肽的细胞。在一个实施例中，所述培育为渗析。在又一个实施例中，在浸入充气搅拌罐式反应器中执行所述培育。在另一个实施例中，所述细胞是真核细胞。在再一个实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在再又一个实施例中，所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、COS细胞、PER. C6 细胞、Sp2/0细胞和HEK 293细胞。在一个实施例中，所述多肽是抗体。在另一个实施例中， 所述抗体是抗 CD20、CD22、HLA-DR, CD33、CD52、EGFR, G250、GD3、HER2、PSMA, CD56、VEGF, VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受体或IGF-1受体的抗体。本发明的详细描述本文报道一种搅拌器，该搅拌器为组合搅动器，包括轴向输送元件和一个或多个限定和一体的轴向输送元件。术语“元件”表示搅动器叶片的(功能)单元，该搅动器叶片关于距离和角度相对于彼此处于固定的空间构型。径向输送元件表示搅动器叶片相对于轴心线不具有俯仰角的搅动器。轴向输送元件表示搅动器叶片相对于轴心线具有一俯仰角的搅动器。在一个实施例中，输送元件的搅动器叶片是矩形板，不过可以使用其它几何形状。 相对于搅拌器的轴心线来表示元件的输送方向。轴向输送元件，尤其是其单独的叶片，作为连接件布置在径向输送元件的叶片之间。本文还报道了一种包括该搅拌器和培育器皿的装置。还报道了该搅拌器和该装置在细胞培育方面的用途，特别是在诸如内部渗析或外部渗析的半连续过程中的用途。
图1示出如本文报道的搅拌器的示例性实施例。输送元件中的每一个都由限定数量的搅动器叶片组成。每个叶片要么与旋转轴直接连接，要么经由轮毂与旋转轴连接。独立于输送元件的每个搅动器叶片具有外缘和内缘。 每个搅动器叶片的与轴心线的距离最大的部分被表示为叶片的末端。每个输送元件都具有外径和内径。例如，轴向输送元件的外径是相对的搅动器叶片的末端之间的最大距离并且径向输送元件的内径是相对的搅动器叶片的内缘之间的最小距离。在如本文报道的搅拌器中，轴向输送元件位于径向输送元件内。因此，(所有)轴向输送元件的外径等于或小于径向输送元件的内径，从而允许轴向输送元件被安放在径向输送元件内部。轴向输送元件(中的每一个)的一些搅动器叶片连接径向输送元件的相对的搅动器叶片。由于径向输送元件未通过该连接彼此直接连接，因此轴向输送元件(中的每一个)单独(即，自行)与径向输送元件连接。轴向输送元件的连接搅动器叶片不需要作为用于径向输送元件的搅动器叶片之间的整个距离的搅动器叶片形成。因此，轴向输送元件的连接叶片不需要在整个距离上具有轴向输送功能，即，不必在整个距离上作为搅动器叶片形成。也就是说，轴向输送元件的搅动器叶片可以比与径向输送元件的搅动器叶片的内缘的空间距离短。该空间间隙由不具有特殊形式但可供用于将轴向输送元件的叶片末端与径向输送元件的叶片内缘连接的连接器填充。径向输送元件的高度h大于轴向输送元件的高度hSB的10倍。因此，轴向输送元件中的每一个能够被安放在相对于径向输送元件的高度不同的位置。在一个实施例中，轴向输送元件位于(即，被安放在)径向输送元件相对于搅拌器的头部K的总高度h的80% 的最大距离内。这表示轴向输送元件与搅拌器的头部的最大距离为0.他。旋转轴(也称为驱动轴)延伸通过其中使用了搅拌器的培育器皿的纵向轴线。对主径向输送叶轮、例如对锚式叶轮的修改是一体形成在径向输送元件的上部和 /或中部和/或下部区域内的(沿轴向)向下输送的倾斜叶片式搅动器。如本文报道的搅拌器尤其提供了液体溶液的改善的混合，例如以便经由液体表面导入修正剂，例如，酸或碱、营养溶液、消泡剂或者还有(X)2或02。此外，该搅拌器减少了泡沫形成且在渗析过程中减少了生物积垢并且通过向渗析模块的直接正交流动而增加了传质。已发现，另外的轴向输送元件出乎意料地并未增加剪切应力，同时改善了渗析模块中的混合和传质。在半连续培养过程例如外部渗析或内部渗析中，跨隔膜将基质供给至反应器并同时抑制所培养的细胞的成分/新陈代谢产物被引走。通过扩散进行这种材料交换。因此， 主要影响因素是占主导的浓度差、隔膜材料、隔膜表面、隔膜材料内部的相应化合物的扩散系数和由抵靠隔膜的流动决定的相界面的厚度。当在高细胞密度发酵中采用渗析时，该渗析是类似于灌注的半连续过程，其中附装于反应器内的(中空纤维)渗析模块提供培养介质与新鲜营养介质之间的交换区。营养介质经渗析模块从存储容器泵送并此后再次回到存储容器内(示意图参见图幻。该渗析模块能够位于反应器外部(外部渗析)或反应器内(内部渗析)。相同的物理定律适用于两种操作模式。因此，本文报道了一种包括如本文报道的搅拌器和培育器皿的装置。在一个实施例中，该装置还包括渗析模块。该装置的构件以如下方式确定尺寸，即，它们能够发挥它们的预期作用，即，培育器皿能够摄取培育介质，搅拌器能够混合介质并且将添加的化合物分散到其中，并且渗析模块能够提供新鲜介质并引走由所培育的细胞分泌的新陈代谢化合物。因此，该搅拌器具有允许在有渗析模块和无渗析模块的情况下都可以在器皿内不受妨碍地旋转的直径。已发现，在如本文报道的装置下，能够有利地执行作为灌注培育或者作为渗析培育的高细胞密度培育。在一个实施例中，在能够实现到培育介质的独立于雷诺数的恒定功率输入的搅拌器转速下执行培育，即，在培育期间在培育器皿中提供湍动的培育介质流。在如本文报道的装置下，与已知的搅动器相比可以在较低的搅拌器转速但在相同的功率输入下培育对剪切敏感的哺乳动物细胞。培育器皿的形式不受限制。在一个实施例中，培育器皿是圆柱形器皿。在另一个
8实施例中，培育器皿为搅拌罐式反应器。培育器皿可具有任何尺寸。在一个实施例中，培育器皿具有从5L至25，000L的工作容积。来自新鲜营养介质的成分从渗析模块的内部经半渗透中空纤维膜扩散到反应器内，同时所培育的细胞的代谢物借助于浓度差沿反方向从反应器扩散到营养介质中。其目的在于保持抑制反应器中的代谢物的绝对浓度尽可能低(稀释)并同时将必需营养物的浓度尽可能长时间地维持在最佳培育水平。这使得培育条件与不进行渗析的过程相比得到改善，从而能够实现更高的最大细胞密度或产品滴定度。渗析模块中的传输过程能够以等同的方式被描述为与第一菲克(Fick’ s)定律相结合地通过双膜理论在气泡上传质。因此，假设线性梯度基于中空纤维渗析模块的交换面积AH，那么根据方程1有效传递的扩散通量Jrff为
权利要求
1.一种搅拌器，包括-包括至少两个搅动器叶片的一个径向输送元件，和-一个或多个轴向输送元件，每个轴向输送元件都包括至少两个搅动器叶片，其中所述径向输送元件的所述搅动器叶片彼此平行，其中所有轴向输送元件的外径等于或小于所述径向输送元件的内径，其中所有轴向输送元件单独连接到所述径向输送元件，其中所有轴向输送元件位于所述径向输送元件内，并且其中所有输送元件相对于彼此具有固定的空间取向。
2.根据权利要求1所述的搅拌器，其特征在于，所述轴向输送元件的数量为1或2或3。
3.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，一个轴向输送元件位于从所述径向输送元件的所述叶片的顶部80%的最大距离处和/或一个轴向输送元件位于从所述径向输送元件的所述叶片的顶部20%的最大距离处。
4.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述径向输送元件的相对的搅动器叶片通过轴向输送元件的两个相对的搅动器叶片彼此连结。
5.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述径向输送元件是锚式叶轮。
6.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述轴向输送元件是倾斜叶片式搅动器。
7.根据权利要求6所述的搅拌器，其特征在于，所述倾斜叶片式搅动器的所述搅动器叶片相对于所述搅拌器的轴心线的俯仰角介于10°与80°之间。
8.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述径向输送元件具有1 至8个搅动器叶片。
9.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述一个或多个轴向输送元件具有彼此独立的1至10个搅动器叶片。
10.根据前述权利要求中任一项所述的搅拌器，其特征在于，所述径向输送元件具有至少为200mm的高度。
11.一种在培育器皿内包括根据权利要求1至10中任一项所述的搅拌器的装置。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，还包括渗析模块。
13.根据权利要求11或12所述的装置，其特征在于，所述培育器皿为搅动罐式反应器。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的装置，其特征在于，所述培育器皿是浸入充气搅动罐式反应器。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的装置，其特征在于，搅拌器直径(d)与培育器皿直径⑶的比例d/D为从0. 2至0. 8。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的装置，其特征在于，所述培育器皿的充装高度(H)与培育器皿宽度⑶的比例H/D为从1. 0至2. 5。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的搅拌器或根据权利要求11至16中任一项所述的装置用于培育表达多肽的细胞的用途。
18.一种用于产生多肽的方法，包括a)提供包含对所述多肽进行编码的核酸的细胞，b)提供如本文报道的装置，c)在所述装置中在培育介质中培育细胞，其中所述搅拌器在所述培育器皿内提供湍流，和d)从所述细胞或培育介质回收所述多肽并由此产生多肽。
19.根据权利要求17所述的用途或根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述培育为渗析。
20.根据权利要求17或19所述的用途或根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞。
21.根据权利要求20所述的用途或方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、COS细胞、PER. C6细胞、Sp2/0细胞、或HEK 293细胞。
22.根据权利要求17和19至21中任一项所述的用途或根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽为抗体。
全文摘要
本发明申请描述一种搅拌器，该搅拌器包括至少一个轴向输送元件和至少一个径向输送元件相对于搅拌器的旋转轴的组合，其中所述至少一个轴向输送元件的最大直径等于或小于径向输送元件的内径di。在一个实施例中，根据本发明的搅拌器是一个锚式搅动器与至少一个倾斜叶片式搅动器的组合。此外，描述了根据本发明的搅拌器在渗析方法中用于培养细胞的用途。
文档编号B01F7/00GK102458629SQ201080024799
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月5日
发明者A·肖尔茨, C·雷泽, H·特贝, M·延茨施, M·波尔沙伊特, M·莱希纳 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司