改进的色谱介质的制备方法以及使用方法

专利名称：改进的色谱介质的制备方法以及使用方法
技术领域：
本发明涉及用来制备具有共价键合的聚合物链的多孔聚合介质的方法。所述介质可以用于色谱纯化，获得具有改进的蛋白质结合容量、动力学性质和选择性的多孔基材，本发明还涉及所述介质的制备和使用方法。
背景技术：
在现代卫生保健当中，由活性有机体制得的治疗用蛋白质的重要性在日益提高。 这些蛋白质提供了很多优于常规药物的优点，包括对目标疾病的专一性和功效的提高。哺乳动物的免疫系统使用很多蛋白质来控制和消除疾病威胁。随着基因和蛋白质工程学的发展，人们能够开发出许多“设计的”或者重组蛋白质疗法。这些疗法可能基于单独的蛋白质、 化学改性的蛋白质、蛋白质片段或蛋白质结合体。在这些生物药物的生产中，人们广泛地采用色谱分离。随着工业日趋成熟，如果能够采用新颖的/先进的技术和方法来提高分离效果，将使得生物药物制造商能够将这些药物以更低的价格提供给更多的病人。用来纯化蛋白质的常用色谱法包括亲和色谱法、生物亲和色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲水性相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法和混合模式色谱法(包括树脂的上述种类的组合)等。这些种类的色谱的应用和效率取决于溶质分子与色谱系统的固定相(色谱介质)之间的表面-表面相互作用的选择性，所述溶质分子和固定相各自都与液体流动相发生相互作用。很多种固定相色谱载体材料可以在市场上购得。将产品与杂质成功分离的关键通常在于以下对象的正确组合固定相、基础基质 (化学组成和孔结构)和配体性质(配体种类、配体密度、配体分布、配体长度和材料组成)，以及流动相或者溶液性质(缓冲剂种类、PH和电导性)。基础基质和配体的具体设计得到了色谱介质，色谱介质的特征包括一些关键属性，包括蛋白质结合容量、选择性、床渗透性、化学稳定性或处理通量。纯化方法包括主要结合产品(结合和洗脱)、主要结合杂质 (流过)以及上述情况的组合(所谓的弱分配等)。在设计这些技术的时候，最关键的一点是控制上述色谱介质的性质，以便能够进行和确保可靠的分离，以得到纯化的蛋白质产品。可以在很多种多孔基材或基础基质上进行蛋白质分离。用于树脂或珠粒结构的常用材料包括多糖(琼脂糖、纤维素)、合成聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和聚丙烯酰胺)以及陶瓷材料，例如二氧化硅、氧化锆和孔受控的玻璃。薄膜和整体料也常用于色谱，特别是用于流通应用。常规的薄膜组合物包括合成聚合物，例如聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚醚砜、尼龙和多糖，例如纤维素。人们已经由以下材料开发出了整体料聚苯乙烯、多糖、聚甲基丙烯酸酯和其他合成聚合物、多糖和陶瓷。薄膜和整体型色谱与珠粒的区别在于，前者将蛋白质吸附在相同的“对流孔”中，所述对流孔控制薄膜和整体料的渗透性。常规的薄膜和整体型对流孔的孔径约为0.6-10微米。可以通过各种开发成熟的技术(包括本文件列出的那些)向这些基材添加配体。通过使用聚合配体“延伸物”改进蛋白质结合能力和改进树脂选择性的做法包括例如通过接枝将功能聚合物链偶联在基础基质上，所述配体从基础基质的表面延伸出来。配体延伸剂通常产生更大的结合容量，这是因为配体延伸物增大了官能团的可达性， 使得目标分子的结合超过了表面上单层吸附的情况。该配体技术的一种这样的应用在US 2004/0059040中有描述。美国专利公开第2004/0059040号揭示了一种用于色谱法的吸附剂材料，其包含涂覆在载体上的聚合物，聚合物主链通过一种或多种连接基团(包括一个或多个酰胺基)连接于载体。US 2004/0059040还揭示了聚合物与载体反应，形成共价连接。该方法可以用来在颗粒表面上提供表面涂层，从而保护颗粒表面，使其不会与流动相发生相互作用(例如防止二氧化硅颗粒被高PH值的流动相溶解)。该方法允许将配体涂覆在颗粒(包括珠粒)的表面上，但是并未提供伸入孔内的配体，以为生物分子提供高容量。通过将聚合物延伸剂添加到多孔材料表面提供了改进的蛋白质结合容量、结合动力学性质，以及蛋白质选择性的潜在的变化。但是，随着蛋白质分离的要求变得更高，人们更迫切需要开发出新的更高效的技术和方法，以制造新颖的聚合结构。因此，人们希望开发出一种多孔聚合基材，其具有改进的蛋白质结合容量，以及在用于蛋白质分离的时候具有改进的或改良的蛋白质选择性。针对上述对用于蛋白质分离的具有改进的蛋白质结合容量和树脂选择性的新的多孔聚合物基材的需求，我们开发了一种用来将聚合物延伸剂接枝到多孔聚合基材上的新方法，在此方法中，制得的聚合延伸剂配体具有能够随后与聚合载体发生反应的官能端基。

发明内容
本发明涉及用来通过共价键将聚合物配体固定于聚合载体的方法。通过进行本发明的方法，减少或尽可能减少在更常用的自由基接枝技术中发生的副反应，从而改进所得的官能化聚合基质的稳定性。本发明还涉及用来制备具有共价键合的聚合物配体链的大孔聚合介质的方法。所述接枝可以用于色谱纯化。在本发明的一个方面，提供了一种用于色谱法的吸附剂材料，其包含固定在聚合载体上的聚合物配体，所述聚合物配体通过一种或多种连接基团(包括一个或多个官能团)连接于聚合物载体。在第二个方面，本发明提供了一种制备用于色谱法的吸附剂材料的方法，所述方法包括将聚合物配体固定在聚合载体上，其中，所述聚合载体与包含聚合物主链的聚合物配体反应，从而在聚合物主链和聚合载体之间形成一个或多个连接基团，每个连接基团包括一种或多种官能团。在本发明的第三个方面，提供了一种用来从混合物分离化合物的方法，该方法包括使所述混合物与用于色谱法的吸附剂材料接触，所述吸附剂材料包含固定在聚合载体上的聚合物配体，其中所述聚合物主链通过一个或多个连接基团结合于所述载体，所述连接基团包括一种或多种官能团。
具体实施例方式如本文中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。
在本文中，术语“聚合物配体”和“聚合配体”是同义词，术语“聚合载体”和“聚合物载体”也是同义词。在本文中，术语“优选”、“更优选”和“最优选”不是为了指出一定更佳的形式，而
是表示较宽的范围或组之内合适的更窄的范围。在本文中，所有的范围都包括端值且可以组合。在本文中，所谓“多孔的”表示材料能够通过“扩散孔”吸附蛋白质，所述“扩散孔” 的孔径通常约为200人至3，000A。在本发明用来制备聚合树脂颗粒的方法的一些实施方式中，成孔剂与后面全部单体的总重量的重量比大于或等于0. 1 ；大于或等于0. 25 ；或者大于或等于0. 5。在本发明用来制备聚合树脂颗粒的方法的一些实施方式中，成孔剂与后面全部单体的总重量的重量比小于或等于10 ；小于或等于5 ；或者小于或等于2. 5。本发明的聚合载体包括任意聚合珠粒，所述聚合珠粒适合通过使单体混合物聚合来制备，所述单体混合物包含至少一种乙烯基单体，所述乙烯基单体具有至少一种活性基团。合适的活性基团的例子包括亲电基团，或者能够转化为亲电基团的基团，或者亲核基团，或者能转化为亲核基团的基团。 本发明的聚合载体可以通过悬浮聚合、乳液聚合或分散聚合来制备。适合用来制备本发明的聚合载体的乙烯基单体包括但不限于具有单个乙烯基的乙烯基单体、具有多个乙烯基的乙烯基单体以及它们的混合物。一些合适的乙烯基单体包括例如乙烯基羧酸酯、 乙烯基氨基甲酸酯单体、乙烯基芳族单体、(甲基)丙烯酸酯、取代的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺以及它们的混合物。乙烯基丙烯酸酯的一个合适的例子是乙酸乙烯酯。乙烯基氨基甲酸酯单体的一个合适的例子是三烯丙基异氰尿酸酯。合适的乙烯基芳族单体的例子包括苯乙烯、二乙烯基苯以及它们的取代形式(例如α-甲基苯乙烯)。一些合适的取代的(甲基)丙烯酸酯包括例如多元醇与(甲基)丙烯酸的酯，例如甲基丙烯酸缩水甘油酯、 二甲基丙烯酸乙二酯、甲基丙烯酸羟乙酯、二甲基丙烯酸甘油酯、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，以及它们的混合物。一些合适的取代的(甲基)丙烯酰胺是盐酸(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺和羟乙基甲基丙烯酰胺。所述聚合载体材料可以是颗粒材料，或者为小块、片材、管状、棒状或毛细涂层的形式。较佳的是，所述载体材料是颗粒材料，其体均粒度适合约为0. 5-500微米，优选约为0.7-200微米，最优选约为10-120微米。所述颗粒优选基本为球形。所述颗粒材料优选包括孔。所述颗粒载体材料的孔径、孔体积和比表面积可以根据使用的载体材料的种类、要连接到载体上的聚合物的特性以及使用时所需的分离特性变化。所述孔径适合约为 20-4000 A ,优选约为50-1500 A。对于灌注孔，所述孔径适合约为2000-80000Α,优选约为5000-50000 A。孔体积适合约为0. 1-4毫升/克，优选约为0. 3-2毫升/克，最优选约为0. 5-1. 5毫升/克。比表面积适合约为1-1000米7克，优选约为25-700米7克，最优选约为50-300米7克。聚合物配体的至少一种活性基团共价键合于本发明的聚合载体。聚合物配体上能与本发明的聚合载体反应的合适的活性基团包括但不限于亲电试剂，例如烷基卤化物、芳基卤化物、醛类、活性酯类、活性醇、环氧化物、碳酸酯类、碳正离子和合成等价物以及它们的组合，或者亲核基团，例如醇、胺、碳负离子和合成等价物、硫醇以及羧酸盐/酯以及它们的组合，或者自由基受体，例如不饱和双键。
聚合载体上能与本发明的聚合物配体反应的合适的活性基团包括但不限于亲电试剂，例如烷基卤化物、芳基卤化物、醛类、活性酯类、活性醇、环氧化物、碳酸酯类、碳正离子和合成等价物以及它们的组合，或者亲核基团，例如醇、胺、碳负离子和合成等价物、硫醇以及羧酸盐/酯以及它们的组合，或者自由基受体，例如不饱和双键。包含可用于本发明的聚合配体的聚合物的例子包括但不限于丙烯酸类、甲基丙烯酸类、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、多糖以及它们的混合物。可以用于本发明的聚合配体上的官能团包括但不限于离子交换基团、疏水性相互作用基团、亲水性相互作用基团、亲硫性相互作用基团、金属亲和性基团、亲和性基团、生物亲和性基团以及混合模式的基团(上述的组合)。可用于本发明的合适的官能聚合配体的例子包括但不限于强阳离子性交换基团，例如磺丙基、磺酸；强阴离子型交换基团，例如氯化三甲基铵；弱阳离子交换基团，例如羧酸；弱阴离子交换基团，例如N，N-二甲基氨基或 DEAE ；疏水性相互作用基团，例如苯基、丁基、丙基、己基；以及亲合性基团，例如蛋白质A、 蛋白质G以及蛋白质L和能够进一步转化为另外的官能团的非官能单体或中间单体(例如甲基丙烯酸缩水甘油酯，其转化为离子交换配体或亲合性配体)，以及它们的混合物。在一个实施方式中，所述官能聚合配体通过在存在双官能链转移剂的情况下，经由官能单体的自由基聚合形成。加入链转移剂影响聚合物配体的分子量，并使其与聚合载体的反应。在聚合反应过程中，双官能链转移剂与单体的反应形成用官能端基封端的聚合配体。合适的双官能链转移剂同时包括两种基团，一种基团允许自由基链传递，另一种官能团适合用于所述聚合配体与聚合载体的反应。合适的链转移基团包括例如卤代甲烷、二硫化物、硫醇和金属络合物。另外的合适的链转移剂包括各种包含至少一个容易被抽提的氢原子的其它化合物，以及它们的混合物。合适的活性基团包括但不限于亲电试剂，例如烷基卤化物、芳基商化物、醛类、活性酯类、活性醇、环氧化物、碳酸酯类、碳正离子和合成等价物以及它们的组合，或者亲核基团，例如醇、胺、碳负离子和合成等价物、硫醇以及羧酸盐/酯以及它们的组合，或者自由基受体，例如不饱和双键。链转移剂可以一次或多次加入，或者以线性或非线性的形式连续加入，可以在大部分或整个反应期间加入，或者在反应期间的有限的部分加入。可以将链转移剂以0.01% _5%、更优选0. 1% -1%的量加入反应中。可以将交联剂、支化剂和非官能单体连接于聚合配体，用来控制聚合配体的形貌或相互作用。但是，这些交联剂或支化剂在聚合配体上的量很低，优选< 5%，更优选 < 1 %。合适的交联剂或支化剂包括但不限于单体，例如二甲基丙烯酸乙二酯、二乙烯基苯、 三甲基丙烯酸三甲基丙酯和亚甲基二丙烯酸酯，或者多官能链转移剂。可以用于本发明的“自由基引发剂”的例子包括但不限于能够与乙烯基单体反应而形成聚合配体的任意自由基引发剂，例如过氧化物，如氢过氧化叔丁基、氢过氧化枯烯； 过乙酸化物，例如过乙酸、氯过苯甲酸；过硫酸盐，例如过硫酸铵、过硫酸钠、过二硫酸钾； 偶氮引发剂，例如4，4’ -偶氮二 (4-氰基戊酸)、Irgacure ^59[纽约州霍桑市汽巴-嘉吉公司(Ciki-Geigy，Hawthorn，N. Y.)]、盐酸2，2'-偶氮二(2-脒基-丙烷)，等等，以及它们的混合物。所述接枝反应可以通过本领域已知的方法引发，优选采用热引发(加热)或紫外辐射。所述自由基引发剂可以是水溶性或油溶性的。将自由基引发剂以0. 01% -15%、 更优选0. 1% -2%的量加入反应中。所述聚合物配体能够适当地与聚合载体共价键合。所述聚合物配体适于以溶液形
6式加入聚合载体的悬浮液中。然后优选通过本领域普通技术人员已知的方法，适当地将聚合配体过滤、洗涤和交替干燥。反应过程中的温度适合约为25-90°C，优选约为50-80°C。在一个实施方式中，混合物保持在惰性气氛下。本发明还包括在色谱分离法中将吸附剂材料用于色谱。所述色谱分离方法可以是例如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲水性相互作用色谱、亲硫性相互作用色谱、金属亲合性色谱、亲合性色谱、生物亲合性色谱以及混合模式(上述情况的组合)，超临界流体色谱(SFC)和以及模拟移动床(SMB)。本发明还包括在色谱分离法中将吸附剂材料用于色谱。这些色谱分离法可以是例如低压液相色谱、中压液相色谱、HPLC、超临界流体色谱(SFC)和模拟移动床(SMB)。本发明还包括一种从混合物分离化合物的方法，该方法包括使所述混合物与本发明的用于色谱的吸附材料接触。本发明的主要优点是利用预先制备的聚合物配体接枝形成高容量离子交换树脂， 该树脂用于分子(更具体来说是生物分子)的色谱俘获和/或纯化。实施例实施例中包含的材料由以下来源获得。GE 卫生保健公司(GE healthcare) :Q_S印harose 费舍尔科学公司(Fisher Scientific) :HC1，三(羟甲基)氨基甲烷西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich) =BSA,注射过滤器，(3_丙烯酰氨丙基)三甲基铵，盐酸-2-氨基乙硫醇，2，2’ -偶氮二甲基丙脒)实施例1-聚合配体的制备在独立的称量皿中称取0. 111克盐酸2-氨基乙硫醇(AET -HC1)和0. 186克二盐酸-2，2’ -偶氮二 O-甲基丙脒)(ABMPA· 2HC1)，加入250毫升的圆底烧瓶中，用38克水淋洗。将30克氯化(3-丙烯酰氨丙基)三甲基铵(AAPTMAC)和32克水直接称取加入烧瓶中。将温度计和水冷凝器(带有队鼓泡器)与烧瓶连接安装。将组分加入烧瓶中，然后反应混合物在78°C搅拌5小时。实施例2-吸收剂材料的生成(聚合配体与聚合载体的反应)将90克冷却的实施例1形成的聚合物配体溶液和10. 6克聚GMA-GlyDMA湿饼加入圆底烧瓶中。在队气氛下，在65°C，用顶挂式搅拌器QOOrpm)将浆状溶液搅拌16小时。 对所得的冷却的悬浮液进行过滤，用水洗涤GX200mL)。阴离子交换树脂以浆状液水溶液的形式储存。阴离子交换树脂的牛血清白蛋白(BSA)容量为155毫克/毫升。用于吸收剂材料的BSA容量测试溶液1 (50mM Tris/HCl, pH 8. 61)的制备将12. 1克三(羟甲基)氨基甲烷加入2升的容量瓶中。然后将N/100HC1溶液加入容量瓶中至2升的刻度。给容量瓶盖上盖子，对其中的物料进行振摇。将溶液静置5分钟，然后再次检查溶液体积。再加HC1，将体积调节到2升的刻度。检测pH，为8.61。溶液放入冰箱，贴标签(溶液1)。溶液2 O毫克/毫升BSA溶液)的制备在玻璃广口瓶中称取0. 806克BSA，将其加入403克溶液1中。手工轻轻混合该物料，使其溶解。溶液静置0. 5小时，以确保BSA完全溶解。给该溶液贴上标签(溶液2)。
将1毫升去离子水缓慢地加入一个Bio-Rad Poly-Pr印色谱柱中，以免夹杂空气。 使用永固油墨笔标记水的高度。将端塞从柱子取下。在通风橱中将所述柱子与总管相连。 向所述柱子中加入更多的去离子水，对柱子施加轻度真空，直至柱子底部保留1-2厘米的水，以免夹杂空气。将浆状阴离子交换树脂溶液加入所述柱子中。始终在树脂上方保持水头。用移液管缓慢地加入稀树脂浆液，直至填充床达到1毫米高度，从而在柱子中量出1毫升的树脂。 施加轻度真空，除去树脂上方的溶液，仅在树脂上方留下1-2厘米的溶液。当树脂水平位置落至低于1毫升标记以下的时候，在施加额外的真空的条件下，加入更多的树脂浆液。注意不要将空气引入树脂床(在床接触空气之前解除真空)。根据需要使用更多的去离子水，保持树脂珠粒不与空气接触。填充的1毫升树脂用大约10毫升的去离子水淋洗，以代替浆状溶液，使液体排掉，直至水平面高出填充床1-2厘米。然后填充的1毫升的树脂用10毫升的溶液1冲洗。施加真空，以使溶液1从柱子抽出，使得空气被抽过整个柱子1分钟。将包含湿饼的一次性柱子从总管取下。用刮刀将从柱子中取出的湿饼转移到8盎司的玻璃瓶中，加入200毫升BSA溶液 2(来自下一步)。将200毫升2毫克/毫升的BSA溶液2转移到玻璃瓶中。将盖子固定在玻璃瓶上。用帕拉膜(Parafilm)密封该玻璃瓶。将所述玻璃瓶水平放置在振荡器上，将样品轻轻振荡18小时。18小时之后，将样品从振荡器取出，使得树脂沉淀15分钟。15分钟后，打开所述 8盎司的玻璃瓶，用5毫升的注射器从玻璃瓶取出3毫升样品。将0. 22um的过滤器放置在注射器上，然后对注射器施加压力，将BSA溶液缓慢地压过过滤器，使其进入一次性UV比色皿中。在培养18小时之后，测量过滤后的上清液BSA溶液在278纳米处的紫外吸收结果， 来测定BSA结合容量。
权利要求
1.一种用于色谱法的吸附剂材料，所述吸附剂材料包含固定在聚合载体上的聚合物配体，所述聚合物配体通过一种包括一个或多个官能团的连接基团连接于所述聚合物载体。
2.如权利要求1所述的吸附剂材料，其特征在于，所述聚合载体是通过使包含以下组分的单体混合物聚合而制备的至少一种乙烯基单体，其包含能够与聚合载体反应的基团以及一种或多种官能团。
3.如权利要求2所述的吸附剂材料，其特征在于，所述能够与聚合载体反应的基团包括亲电试剂，例如烷基卤化物、芳基卤化物、醛类、活性酯类、活化的醇、环氧化物、碳酸酯类、碳正离子和合成等价物以及它们的组合，或者亲核基团，例如醇、胺、碳负离子和合成等价物、硫醇以及羧酸盐/酯以及它们的组合，或者自由基受体，例如不饱和双键。
4.如权利要求1所述的吸附剂材料，其特征在于，所述聚合载体的体均粒度约为 0. 5-500 微米。
5.一种制备用于色谱法的吸附剂材料的方法，所述方法包括将聚合物配体固定在聚合载体上，其中，所述聚合载体与包含聚合物主链的聚合物配体反应，从而在聚合物主链和聚合载体之间形成一个连接基团，每个连接基团包括一种或多种官能团。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚合物配体是在存在双官能链转移剂的情况下，使包含以下组分的单体混合物聚合而制备至少一种乙烯基单体，其包含能够与所述聚合载体反应的基团以及一种或多种官能团。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述能够与聚合载体反应的基团包括亲电试剂，例如烷基卤化物、芳基卤化物、醛类、活性酯类、活化的醇、环氧化物、碳酸酯类、碳正离子和合成等价物以及它们的组合，或者亲核基团，例如醇、胺、碳负离子和合成等价物、硫醇以及羧酸盐/酯以及它们的组合，或者自由基受体，例如不饱和双键。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚合载体的体均粒度约为0.5-500微米。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述聚合物配体以溶液的形式加入所述聚合载体的悬浮液中。
10.一种用来从混合物分离化合物的方法，该方法包括使所述混合物与用于色谱法的吸附剂材料接触，所述吸附剂材料包含固定在聚合载体上的聚合物配体，其中聚合物主链通过一个连接基团结合于所述载体，所述连接基团包括一种或多种官能团。
全文摘要
本发明涉及用来制备具有共价键合的季铵聚合物链的大孔聚合介质的方法。所述介质可以用于色谱纯化，获得具有改进的蛋白质结合容量和树脂选择性的多孔基材，本发明还涉及所述介质的制备和使用方法。
文档编号B01J20/30GK102343256SQ20111022275
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月27日 优先权日2010年7月28日
发明者J·J·迈克纳, M·J·迪兹 申请人:罗门哈斯公司