专利名称：艾滋病毒亲和吸附柱及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种引起人类免疫缺陷综合征的艾滋病毒从血液中快速高效去除治疗技术，具体涉及一种蛋白亲和吸附柱，可特异性清除血液中艾滋病病毒颗粒，并对患者治疗后进行定性和定量的检测。
背景技术：
艾滋病毒
艾滋病毒(AIDS病毒)正式命名为人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus)属于反转录科(Retroviridae)的慢病毒亚科(Lentiviridae),衣壳为20面体立体对称，外膜包裹呈球形，直径约为llOnm，病毒内芯含有两段相同的核酸链和病毒反转录酶(DNA聚合酶，核酸酶，整合酶)。核酸类型为单股正链RNA，既可作为反转录成cDNA的模板，又可作为mRNA直接翻译蛋白质，基因组大小约为9. 3kb左右。基因组的两侧有长末端重复序列(LTR),3个结构基因(gag、pol、env)和至少6个调控基因(tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx)oHIV的靶细胞主要为Th细胞，⑶4+T细胞是最主要的宿主细胞，简称为Τ4淋巴细胞，它是人体免疫系统中最重要的细胞之一。HIV病毒利用外层壳体糖蛋白gpl20附着于Τ4淋巴细胞上的CD4蛋白上，两者融合后再将自身的一整套遗传物质RNA注入到T4淋巴细胞内，复制时经反转录作用形成RNA-DNA的重组体，然后以双链DNA形式整合到宿主细胞DNA链上，细胞酶系在病毒的长末端重复序列(LTR)指导下将整合的HIV DNA转录成RNA。其中一部分的RNA分子作为mRNA翻译出子代病毒的结构和功能蛋白，另一部分成为子代病毒的遗传物质装入病毒体中。成熟的子代病毒通过芽生方式从细胞内释放。新复制的病毒体将感染其他的T4淋巴细胞，并导致人体的T4淋巴细胞数缓慢持续减少，因而其数量会逐渐减少直到机体显示出艾滋病的征兆。T4淋巴细胞数的缺乏将危及人体免疫系统的安全。当人体每毫升血液中的T4淋巴细胞数减少到20万以下，一般可被认定为患上了艾滋病，HIV —旦感染将是永久型的。艾滋病艾滋病(AcquiredImmunedeficiency Syndrome, AIDS)又称获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency syndrome),是由人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus, HIV)引起的一种严重传染病。其主要传播方式为经血、性接触和母婴垂直传播等3种。HIV病毒感染人体后，主要经历4个阶段急性感染期、无症状感染期、持续性全身淋巴结肿大综合征期及艾滋病期。在疾病发展病程中，因为辅助性T淋巴细胞细胞膜上的⑶4分子是艾滋病病毒的主要受体，HIV可侵犯和破坏辅助性T淋巴细胞(⑶4 + T淋巴细胞)，使机体细胞免疫功能受损，可并发各种严重的机会性感染和肿瘤，不及时治疗最后可导致死亡。
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体后，一般不会立即发病，大多有一段较长的潜伏期，平均为12年至13年。在长达几年或十几年的潜伏期内，可以没有任何症状，而潜伏期的长短，一方面固然与病毒的种类、毒力等因素有关，另一方面还与受感染者的健康状况、营养情况、精神因素等有关。从感染到发病的漫长过程，在不同阶段，与HIV相关的临床表现也是多种多样的。艾滋病传染性较强且目前尚无有效药物可以根治，对全人类的健康造成了严重的威胁。艾滋病的治疗据世界卫生组织(WHO)截止到2010年底，全世界现存3，500万人以上HIV感染者，我国卫生部通报截止2010年10月31日，我国艾滋病病毒感染者和病人370393例，其中病人132440例；死亡68315例。而专家估计艾滋病感染者至少75万。艾滋病(AIDS)在世界上的蔓延对人类健康和社会经济发展构成了巨大的威胁，治疗和预防艾滋病重要性日益紧迫。AIDS的治疗主要包括抗病毒治疗、免疫调节治疗和机会感染治疗等。I.抗病毒治疗近年来，使用较多的化学治疗药物主要有核苷类逆转录酶抑制剂如齐多夫定(AZT)、地丹诺辛(ddl)、扎西他宾(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)等；非核苷类逆转录酶抑制剂如奈韦那平(Nevirapine)等；蛋白酶抑制剂如沙奎那韦(SquinavJr)、利杜那韦(Ritonavir)等。已有7种核苷类和3种非核苷类逆转录酶抑制剂及5种蛋白酶抑制剂共15种抗HIV药物通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。高效抗逆转录病毒疗法(HighlyActive antiretroviral Therapy, HAART)又称“鸡尾酒疗法”的出现，对于AIDs的治疗具有重大意义，可以使艾滋病患者的机会性感染减低，生存期明显延长。1995年，美籍华人科学家何大一教授首先提出应用两类药物中的三种药联合治疗艾滋病患者，这种治疗方法被称作高效抗逆转录病毒疗法(Highly Activeantiretroviral Therapy,HAART)。联合疗法具有较强地抗病毒作用，并可避免耐药株的出现。AZT和3TC联合治疗是抗HIV感染最有效的二联疗法之一，在改善⑶4细胞和降低病毒载量方面优于单一的任何药物；由二种核苷类逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成的三联疗法对降低病毒载量效果十分明显。但是，由于病毒变异和病毒在细胞内潜伏感染，HAART目前尚不能完全清除HIV-I感染者体内的病毒。在长期治疗并且不能清除患者体内的HIV-I的情况下，耐药毒株的不断增多和药物副作用的频繁出现给当前HIV-I治疗带来了严重的挑战。目前又出现了计划性间断疗法(SIT)，SIT是希望能在维持患者血液低病毒血症的同时，减少一段时间的用药，使病毒载量反弹，再次刺激机体免疫系统，使之恢复对HIV的特异性免疫反应，最后让免疫系统本身通过特异性和非特异性免疫反应的协同作用来控制体内的HIV。2.免疫调节治疗主要药物有干扰素300万U，皮下或肌肉注射，每周3次，3-6个月为I个疗程；白细胞介素-II250万U，连续静脉点滴24小时，每周5次，共4-8周；丙种球蛋白定期使用， 减少细菌感染。另外，一些中药或其某些成分对免疫功能调节也有积极作用，如中药甘草中的甘草甜素、灵芝的成分三萜烯、天花粉的提取物天花粉蛋白、丹参、柴胡、黄芩苷及黄芩苷元等等均对艾滋病的治疗起积极作用。
3.机会感染的治疗在不同地区或国家的艾滋病病人中流行的机会感染种类有所不同，WHO推荐把这两种比较廉价的预防性治疗措施作为对发展中国家HIV感染者的最基本医疗内容。此外，国内外研究较多的两种预防性治疗方法为一是针对母婴传播的问题；另一个是针对职业暴露后的预防性治疗问题。国外有关艾滋病预防与治疗的研究仍在不断进行用于预防艾滋病毒的疫苗包括HIV基因工程疫苗、HIV核酸疫苗、HIV活载体疫苗等正在研究之中。总体来说，抗病毒治疗疗效频繁，毒副作用大，易产生耐药毒株，成本高；免疫治疗法作用不直接，专一性较差，治疗效果不明显，机会治疗治疗难度大，周期性长，易控难度大。目前仍然缺少一种低副作用、低成本且能够有效治疗艾滋病的手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有艾滋病治疗方法存在的缺点和不足，提供一种艾滋病毒免疫亲和吸附柱，其能快速简便地去除艾滋病毒颗粒，达到减缓及治疗艾滋病的目的。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，所述活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。其中，所述亲和蛋白优选选自⑴主要受体⑶4分子、gpl20抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种。上述亲和吸附柱，其可以包括以下亲和微球中的一种或多种1)连接有主要受体⑶4分子的亲和微球；2)连接有gpl20抗体的亲和微球；3)连接有辅助受体CXC趋化因子受体4的亲和微球；或，5)连接有CC趋化因子受体5的亲和微球。本发明的吸附柱可以是包含上述任一种或多种固定一种亲和蛋白微球的吸附柱，也可以是包含上述任一种或多种固定多种亲和蛋白微球的吸附柱。在实际使用时，可以根据需要搭配不同亲和微球。优选在同一微球上固定上述4种亲和蛋白。上述亲和吸附柱，其在柱体两端分别具有分离膜，其将亲和微球封闭于柱体中。所述分离膜可具有孔径为10 μ m-100 μ m的过滤孔。上述微球可以是玻璃微球、葡聚糖微球或壳聚糖交联微球。例如所述亲和微球为直径大于Imm的玻璃微球、直径大于500 μ m的壳聚糖交联微球或直径100-300 μ m的葡聚糖微球。本发明亲和吸附柱可以用于分离艾滋病毒，尤其是分离血液中的艾滋病毒。本发明还提供一种制备所述亲和吸附柱的方法，其包括如下步骤I)活化，将微球表面活化使其表面分布能连接亲和蛋白的基团；2)连接，将亲和蛋白连接到微球表面的基团上，使其固定到微球的表面；3)封闭，封闭微球表面未结合的基团，得到活化亲和微球；4)装住，将活化亲和微球填装入吸附柱中；5)封膜，在吸附柱两端分别用分离膜封闭固定。所述亲和蛋白可以通过基因工程手段获得，其制备方法如下①设计合成引物；
②以Trizol法提取总RNA，RT-PCR得到编码亲和蛋白的cDNA ；③构建cDNA毕赤酵母表达载体；④制备毕赤酵母感受态细胞，并将表达载体转化该细胞；⑤在毕赤酵母中高密度诱导表达外源基因；⑥SDS-PAGE检测表达蛋白并测定表达蛋白浓度；⑦分离纯化。 本发明具有如下优点本发明免疫亲和吸附柱，主要由柱体和吸附剂组成，吸附剂选用亲和微球，作为原料，来源丰富，质量稳定，价格便宜，与血液的相容性好。免疫吸附治疗法与传统的艾滋治疗方法相比，抗病毒治疗疗效频繁，毒副作用大，易产生耐药毒株，成本高；免疫治疗法作用不直接，专一'丨生较差，治疗效果不明显，机会治疗治疗难度大，周期性长，易控难度大，而该免疫吸附柱创新性地运用各种亲和微球作为吸附载体，安全性高，专一性好，吸附量高，毒副作用小，治疗时间短，操作简单。本发明免疫吸附柱利用抗原抗体之间的特异性结合的特点，将人类T细胞表面的⑶4分子这种小分子蛋白、gpl20抗体及辅助受体蛋白CXCR-4和CCR-5固定在载体上，制备成免疫亲和吸附微球，装入带有分离膜的层析柱内。将HIV感染者的血液通过管道输入到装有制备好的免疫亲和微球的层析柱内，血液中的HIV病毒颗粒通过其表面抗原与固定在载体上的受体蛋白特异性结合，而将HIV颗粒从血液中吸附掉，最后再将灌流后的不含艾滋病毒的干净血液重新输回人体内者体内。经过几个小时的体外血液循环，HBV患者血液中的HBV颗粒含量降低，最终达到缓减病症，达到治疗艾滋病的目的。
图I是毕赤酵母整合型分泌表达载体pPic9k的质粒图谱；图2是SDS-PAGE检测⑶4的表达结果；图3是Western blot检测0)4的表达结果。
具体实施例方式以下结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I亲和蛋白的克隆、表达及纯化亲和蛋白有⑶4分子、0^-5、0乂0 -4、8 120抗体，均可由真核酵母表达系统表达。以下以主要受体CD4分子为例。人CD4分子是一类相对分子质量约为55kDa的单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面。其在T细胞发育、成熟T细胞的活化以及信号转导中发挥重要作用，是适应性免疫应答发生的重要效应分子，在维护机体正常生理功能中作用巨大。
人0)4分子cDNA序列长约3100bp,编码序列长1377bp (GenBank登录号NM_000616)，编码区前75bp为信号肽基因序列，终止密码子后有PolyA加尾信号。
⑶4分子前体由458个氨基酸残基(AA)组成包括信号肽25个AA，胞膜外区371个AA，跨膜区24个AA以及胞质区38个AA。成熟CD4分子属于免疫球蛋白超家族，其胞外区由4个免疫球蛋白样的结构域组成，从N-端到C-端分别命名为D1(1 98)，D2(99 178)，D3 (179 291)和 D4 (292 371)。①引物设计参照GenBank数据库中的人OMmRNA序列(GenBank登录号NM_000616),应用软件Premier5. O分析人⑶4基因序列，根据真核毕赤酵母表达载体Ppic9k的多克隆位点序列，人⑶4起始密码子ATG前加上2个碱基CG及EcoRI酶切位点GAATTC ;在终止密码子AUG后加上5个碱基TTCCT及SnaBI酶切位点；设计一对引物如下上游引物为Al 5~CGGAATTCATGAACCGGGGAGTCC-3 (EcoR I)，下游引物为 A2 5~TTCCTTACGTATCAAATGGGGCTACATGTCTT~3(SnaBI)上下游引物理论上的扩增片段大小为约1356bp，以Jurkat细胞株cDNA为模版扩增基因，基因片段经SnaB I和EcoR I双酶切后定向插入经相同酶切的Ppic9k表达载体中。连接产物转化ToplOF’大肠杆菌后，对PCR双酶切筛选阳性的菌株进行测序。②以Trizol法提取总RNA本实验采用Trizol法提取Jurkat细胞株(ATCC，美国典型培养物保藏中心，保藏号CRL-1990)总的RNA，用反转录试剂盒合成第一条链，再以其为模板进行PCR扩增，最后用1%琼脂糖电泳分析PCR产物，以不加模板作为空白对照。Trizol法提取总RNA的具体步骤如下I.提取Jurkat细胞株的细胞RNA时，离心沉淀细胞，每5-10X IO6个细胞加ImlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将Jurkat细胞株的细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15_30°C下放置5min ；3.在上述EP管中，按照每Iml Trizol加O. 2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15s，在室温下(15°C 30°C)放置2 3min后，12000rpm(2°C 8°C )离心15min ；4.取上层水相置于新EP管中，按照每Iml Trizol加O. 5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15°C -30°C )放置 lOmin，12000rpm(2°C 8°C )离心 IOmin ；5.弃上清，按照每Iml Trizol加Iml 75 %乙醇进行洗漆，祸旋混合，7500rpm(2°C 8°C )离心 5min,弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.加 DEPC 水溶 RNA 沉淀。RT-PCR 以提取的RNA为模板，逆转录生成⑶4的cDNA链。RT-PCR 体系为
权利要求
1.一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，其特征在于，所述活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。
2.如权利要求I所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述亲和蛋白选自(I)主要受体CD4分子、gpl20抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种。
3.如权利要求I所述的亲和吸附柱，其特征在于，其包括以下亲和微球中的一种或多 种 1)连接有主要受体⑶4分子的亲和微球；2)连接有gpl20抗体的亲和微球；3)连接有辅助受体CXC趋化因子受体4的亲和微球；或4)连接有CC趋化因子受体5的亲和微球。
4.如权利要求Γ3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述柱体两端分别具有分离膜，其将亲和微球封闭于柱体中。
5.如权利要求Γ3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述分离膜具有孔径为10-100 Mm的过滤孔。
6.如权利要求Γ3任一项所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述微球为玻璃微球、葡聚糖微球或壳聚糖交联微球。
7.如权利要求6所述的亲和吸附柱，其特征在于，所述亲和微球为直径大于Imm的玻璃微球、直径大于500 Mm的壳聚糖交联微球或直径100-300 μ m的葡聚糖微球。
8.权利要求Γ6任一项所述的亲和吸附柱在分离艾滋病毒中的应用。
9.一种制备权利要求1飞任一项所述亲和吸附柱的方法，其包括如下步骤 O活化，将微球表面活化使其表面分布能连接亲和蛋白的基团； 2)连接，将亲和蛋白连接到微球表面的基团上，使其固定到微球的表面； 3)封闭，封闭微球表面未结合的基团，得到活化亲和微球； 4)装柱，将活化亲和微球填装入吸附柱中； 5)封膜，在吸附柱两端分别用分离膜封闭固定。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述亲和蛋白选自(I)主要受体CD4分子、gpl20抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4或CC趋化因子受体5中的一种或多种，其制备方法如下 ①设计合成引物； ②以Trizol法提取总RNA，RT-PCR得到编码亲和蛋白的cDNA； ③构建cDNA毕赤酵母表达载体； ④制备毕赤酵母感受态细胞，并将表达载体转化该细胞； ⑤在毕赤酵母中高密度诱导表达外源基因； ⑥SDS-PAGE检测表达蛋白并测定表达蛋白浓度； ⑦分离纯化。
全文摘要
本发明公开了一种艾滋病毒亲和吸附柱，包括柱体和位于柱体中的至少一种活化亲和微球，该活化亲和微球连接有艾滋病毒亲和蛋白，所述亲和蛋白能与艾滋病毒结合。亲和蛋白包括主要受体CD4分子、gp120抗体、辅助受体CXC趋化因子受体4(CXCR-4)和CC趋化因子受体5(CCR-5)。亲和微球可以为大小1mm的玻璃微球、直径大于500μm的壳聚糖交联微球，也可以为葡聚糖微球。本发明适用于清除艾滋病患者血液中的艾滋病毒，减缓、治疗艾滋患者的免疫缺陷综合症，与传统的治疗方法相比较，该免疫吸附柱安全性高，专一性好，毒副作用小，操作简单。
文档编号B01J20/30GK102631891SQ201210118840
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者刘红莲, 王业富, 王曼 申请人:武汉大学