一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高凝血因子VIII及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的简单、快捷方法。此方法将亲水性凝胶微球作为基质在活化剂中制成活化基质，然后以偶联法对活化基质键合凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体，实现基质与凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体共价连接。本发明的分离介质配合亲和层析色谱或扩展床吸附用于凝血因子VIII工业化大规模生产，极具成本优势，仅一步可从血液、血清、血浆、血浆组分、细胞培养液、细胞均化液或基因工程细胞培养液等生物原料中直接提取生产高纯度的凝血因子VIII产品，省时省事。
【专利说明】—种用于分离纯化凝血因子Vl I I的介质及其制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法，属于生物分离材料领域。具体地说涉及一种用于以亲和层析色谱或扩展床吸附法从血液、血清、血浆、血浆组分、细胞培养液、细胞均化液等生物原料中分离纯化凝血因子VIII的新型生物分离材料及其制备方法。
[0002]发明背景
[0003]生物分离介质是专门用于提纯和精制生物相关产品的一类材料。分离介质广泛用于医药行业、发酵行业、生物制品、血液制品、疫苗和基因工程产品分离。在纯化产品时，分离介质具有分离效果好、产品纯度高、使用范围广，而且还具有可以进行大规模连续自动化生产的特点，使之成为目前对高纯度和高附加值产品进行分离的首选方法。依赖分离介质的产品涵盖基因重组药物、抗体、疫苗、诊断试剂、生化产品、血液净化、基因芯片以及抗生素等。
[0004]凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。凝血因子VIII基因位于X染色体长臂末端(Xq28)，长为186kb，由26个外显子组成，其中第14号外显子为3.lkb，是目前发现的人类最大的外显子之一。凝血因子VIII mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体多肽.去除N端19个残基的个信号肽后，成熟蛋自由2332氨基酸组成.氨基酸顺序分析表明，凝血因子VIII蛋白由3个A结构域，一个B结构域及2个C结构域组成。各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2，从血浆中及从重组细胞培养上清中分离纯化得到的凝血因子VIII是由两条肽链所组成，重链由A1-A2-B或A1-A2组成，分子量为90~200kDa不等；轻链由A3-C1-C2所组成，分子量为80kDa，二条肽链间由Ca2+连接。目前的研究表明，B结构域对凝血因子VIII的凝血活性并非必需。
[0005]凝血因子VIII为血友病病人的救命药。然而，不论是以血浆为原料的凝血因子VIII生产法还是以表达基因重组凝血因子VIII细胞为原料的生产法，由于目前生产过程复杂，并且全部使用十分昂贵的抗体，即采用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析技术以纯化凝血因子VIII，致使其价格居高不下，且存在很多安全隐患(Clonis YD, Affinitychromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop.JChromatogr A.2006,1101(1-2):1-24 ;Lowe CR, Lowe AR, Gupta G., New developmentsin affinity chromatography with potential application in the production ofbiopharmaceuticals.J Biochem Biophys Methods.2001,49 (1-3):561-74)。尤其在中国，基因重组凝血因子VIII生产法技术迟迟未过关(拜耳属于进口技术除外)，而血浆制品市场来源有限，长期供应紧张，中国又限制血液制品进口，致使凝血因子VIII产品不但价格奇贵，而且总是缺货、断货。总体来说，全球凝血因子VIII药品目前主要的开发方向是，优化凝血因子VIII分离效率、纯化效率与生物比活性的方法，以便在保障其安全性的前提下，降低其生产成本。其中一个主要目标是研发替代生产用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析的纯化技术。小鼠源单克隆抗体亲和柱层析纯化法除成本高外，另有其它潜在问题或风险:例如，抗体或其片断在产品洗脱过程中受到某些不利的作用(酸碱、高温、蛋白酶等)会从固定相脱落，或形成碎片、进入流动相、进入人体，或是凝血因子活性降低，或带来潜在免疫原或由该抗体生产过程所带来的病毒以及未知病原体等(Mejan O, Fert V, Delezay M,Delaage M,Cheballah R,Bourgois A., Immunopurification of human factor VIII/vffFcomplex from plasma.Thromb Haemost.1988,59(3):364-71 ;Gomperts E, Lundblad R,Adamson R., The manufacturing process of recombinant factor VIII, recombinate.,Transfus Med Rev.1992,6(4):247-51)。寻找可以替代上述抗体的小分子，是世界众多生物制药科学家及同行的重要课题。因此，本发明主要是设计选择性更好的小肽亲和配体，固定在亲水凝胶微球的表面，特异性地吸附凝血因子VIII，更有效地实现凝血因子VIII的分离纯化。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是，针对目前用于凝血因子VIII分离纯化的大分子抗体配体亲和分离介质的诸多问题，提出一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法。这一方法具有如下具体特征:
[0007]1、本发明所述的一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法，其特征在于将亲水性凝胶微球作为基质悬浮于活化剂中制成活化基质，然后以偶联法对活化基质键合活化基质键合凝血因子VIII特异性亲和小肽配体，实现基质与凝血因子VIII特异性亲和小肽配体共价连接。
[0008]2、本发明所述的所述的介质，其特征在于，其特征在于，构成所述介质的基质为亲水性凝胶微球，包括亲水性琼脂糖凝胶微球、亲水性葡聚糖凝胶微球、亲水性聚丙烯酰胺凝胶微球；但优选亲水性琼脂糖凝胶微球作为基质材料；基质的粒径为50-160微米，交联度为4-10%范围。
[0009]3、本发明所述的介质，其特征在于，构成所述介质的基质与配体可以通过-0-(醚键)，-NH-, -S-(硫醚键)相连接。
[0010]4、本发明所述的介质，其特征在于，构成所述介质的基质配体之间还可以以包括但不限于下列一种加长的连接臂相连接:
[0011]-0-CH2-CH2-CH2-X-，其中 X = 0，N，S
[0012]-0-CH2-CH(0H) -CH2—X-，其中 X = 0，N，S
[0013]-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-X，其中 X = 0，N，S。
[0014]5、本发明所述的介质，其特征在于，其特征在于，构成所述介质的基质与配体之间还可以以包括但不限于下列一种加长的连接臂相连接:
[0015]-0-CH2-CH2-CH2-X-，其中 X = 0，N，S
[0016]-0-CH2-CH(0H) -CH2—X-，其中 X = 0，N，S
[0017]-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-X，其中 X = 0，N，S。
[0018]5、根据权利要求1所述的介质，其特征在于，构成所述介质的小肽配位体(包括其化学改性异构体)结构式为:
[0019]NH2-(X-EYlC)-C00H
[0020]式中:NH2为小肽氨基端的α -氨基、X表示小肽氨基端的氨基酸亚级结构序列(包括:w、EYHSff等)或为3-吲哚乙酸(3-1AA)、E为谷氨酸、Yl为酪氨酸或与其左侧谷氨酸所形成肽键被还原成CH2的改性酪氨酸、C为半胱氨酸、COOH表示小肽羧基端羧基。按照上式，典型的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽有:
[0021]LI = EYHSffEYC ；
[0022]L2 = WEYC ；
[0023]L3 = 3-1AA-EYC，Y表示E-Y之间肽键上羰基未被还原；
[0024]L4 = 3-1AA-EY1C，Yl表示E-Y之间肽键上羰基被还原成CH2。
[0025]6、本发明所述的介质制备方法，其特征在于，其特征在于，所述制备介质所使用的活化剂可以是环氧氯丙烷、二乙烯砜、羰基二咪唑或其它能活化基质的试剂。
[0026]本发明以均活化亲水凝胶微球为基质，同时连接前述特征的凝血因子VIII特异性亲和小肽配体，大大提高了分离介质与凝血因子VIII结合的选择性，且实现对凝血因子VIII的选择性的PH可调性特点，并以以亲和层析色谱或扩展床吸附法从血液、血清、血浆、血浆组分、细胞培养液、细胞均化液等生物原料中分离纯化凝血因子VIII。此项技术未见任何报道。
【具体实施方式】
[0027]以下通过实例对本发明作进一步描述:
[0028]实施例1:
[0029]量取保存于20%乙醇水溶液中的S印harose FF介质20ml (沉降体积)，用过量去离子水反复洗涤，以除去乙醇，置于G3烧结玻璃漏斗中真空抽干5min ;后依次用40ml20%、50 %、70 %的二甲亚砜水溶液清洗抽滤后的介质各5min ；向处理后的介质中依次加入一定量的二甲亚砜(30% )、二氯乙烷、环氧氯丙烷(10% )、氢氧化钠(0.SM)、水；介质悬液于震荡条件下40°C反应2小时。反应后用过量去离子水反复洗涤至清洗液中午残留环氧基团，得到环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶微球，琼脂糖环氧修饰密度为60 μ mol/ml凝胶。
[0030]实施例2:
[0031 ] 将8.5体积的0.2M的K2HP04溶液与1.5体积的0.2M的KH2P04溶液混合，制成偶联缓冲液。取5g实例I中的环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶微球，悬于IOml偶联缓冲液中。取一定量的小肽配体溶解到偶联用的缓冲溶液中，使其完全溶解，最低浓度为200ymol配基/ml凝胶。将凝胶悬浮液与偶联缓冲溶液以1: 0.5到1:1的比例混合悬浮反应，在20°C_45°C的水浴中密封持续搅拌(或震荡、摇晃)20小时。用偶联缓冲液洗涤除去多余配体。将反应完洗涤过的凝胶悬浮到Im01/L乙醇胺(PH8)的溶液中，在40°C _50°C最少反应4小时或者室温反应过夜，以消除介质表面残余活性基团。在反应完后，用含有0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)和含有0.5M NaCl的偶联缓冲液(pH8.3)交替洗涤，至少重复以上循环洗涤3次。所得介质配体密度50 μ mol/ml。将其保存于含0.02%叠氮酸钠(w/v)的醋酸钠溶液(0.2M，ρΗ5.4)中待用。
【权利要求】
1.一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法，其特征在于将亲水性凝胶微球作为基质悬浮于活化剂中制成活化基质，然后以偶联法对活化基质键合活化基质键合凝血因子VIII特异性亲和小肽配体，实现基质与凝血因子VIII特异性亲和小肽配位体共价连接。
2.根据权利要求1所述的介质，其特征在于，构成所述介质的基质为亲水性凝胶微球，包括亲水性琼脂糖凝胶微球、亲水性葡聚糖凝胶微球、亲水性聚丙烯酰胺凝胶微球；但优选亲水性琼脂糖凝胶微球作为基质材料；基质的粒径为50-160微米，交联度为4-10%范围。
3.根据权利要求1所述的介质，其特征在于，构成所述介质的基质与配体可以通过-O-(醚键)，-NH-, -S-(硫醚键)相连接。
4.根据权利要求1所述的介质，其特征在于，构成所述介质的基质与配体之间还可以以包括但不限于下列一种加长的连接臂相连接: -0-CH2-CH2-CH2-X-，其中 X = O，N，S
-0-CH2-CH(0H)-CH2-X-，其中 X = O, N, S
-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-X，其中 X = O，N，S。
5.根据权利要求1所述的介质，其特征在于，构成所述介质的小肽配位体(包括其化学改性异构体)结构式为:
NH2-(X-EYlC)-COOH 式中:NH2为小肽氨基端的α-氨基、X表示小肽氨基端的氨基酸亚级结构序列(包括:W、EYHSff等)或为3-吲哚乙酸(3-ΙΑΑ)、E为谷氨酸、Yl为酪氨酸或与其左侧谷氨酸所形成肽键被还原成CH2的改性酪氨 酸、C为半胱氨酸、COOH表示小肽羧基端羧基。按照上式，典型的凝血因子VIII特异性亲和作用配位小肽有:
LI = EYHSffEYC ；
L2 = WEYC ； L3 = 3-1AA-EYC，Y表示E-Y之间肽键上羰基未被还原； L4 = 3-1AA-EY1C，Yl表示E-Y之间肽键上羰基被还原成CH2。
6.根据权利要求1所述的介质制备方法，其特征在于，所述制备介质所使用的活化剂可以是环氧氯丙烷、二乙烯砜、羰基二咪唑或其它能活化基质的试剂。
7.根据权利要求1，所述介质用于以亲和层析色谱和扩展床吸附法分离纯化抗体。
【文档编号】B01J20/24GK103506080SQ201210202168
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2012年6月19日
【发明者】汪志友 申请人:汪志友