一种载蛋白的磁性微球的制备方法

文档序号:5034671阅读:456来源:国知局
专利名称:一种载蛋白的磁性微球的制备方法
技术领域
本发明涉及生物分离材料技术领域,尤其是涉及一种磁性微球蛋白载体的制备方法。
背景技术
纳米超顺磁材料以其优越的性能被广泛应用于磁记录材料、电磁感应器件等工业领域。由于纳米超顺磁性铁氧体材料具有无毒、体内可代谢、磁场下操控性能好等优点,近年来在生物医学领域也得到了广泛应用,如用于生物分离与纯化、肿瘤磁热疗、靶向载药以及磁共振成像等领域。一般来说,适于生物医学领域的纳米超顺磁材料必须具备表面亲水性、水相中分散稳定、生物兼容性好、表面功能化、磁响应速度快等特点。作为最重要的磁性载体,磁性微球的研究始于20世纪70年代末,Ugelstad成功的采用活性溶胀方法制备了尺度均匀的单分散的磁性聚苯乙烯微球,但是微球尺度为微米尺度,在进行下步应用时必须将微球从生物分子表面再解离下来,因而影响下游操作。另外由于技术本身的限制,微球中磁性物质含量较低,而且疏水的聚苯乙烯的表面使得磁球在生物应用体系中易发生团聚而影响分离效果的稳定性。另一类得到市场广泛应用的是Meltenyi公司的葡聚糖包被的一类尺寸小于50nm磁性颗粒。由于尺寸小,对下游应用与操作没有显著影响,因此在进行生物分离纯化过程中无需从生物分子表面解离磁性颗粒,使用起来十分方便,但是此类材料磁响应程度很低,需要很强的外加磁场才能对其进行捕获,也限制其应用。对于生物体系而言,除了具备高磁含量、单分散以及表面功能特性外,微球应能在各种应用条件下保持良好的分散而不团聚。

发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本申请人提供了一种载蛋白的磁性微球的制备方法。本发明原料简单易得,易于放大,产品性能优越,可调控性强,适用于分离纯化免疫球蛋白及免疫沉淀等领域。本发明的技术方案如下
一种载蛋白的磁性微球的制备方法,包括以下步骤
(1)制备纳米Fe3O4颗粒将可溶性的三价铁离子盐及乙酸钠加入到乙二醇溶液中并搅拌均匀;然后将该混合溶液放入密闭容器中,在18(T30(TC条件下反应4 72h ;冷却后通过磁性分离,将所得产物洗涤后干燥,制得纳米Fe3O4颗粒;
(2)Fe3O4IgSiOdS壳结构的制备将步骤(I)制得的Fe3O4颗粒于盐酸溶液中溶解,然后磁性分离,将分离得到的颗粒洗涤;将洗涤后的颗粒分散于乙醇、蒸馏水、浓氨水的混合溶液中;向混合溶液中逐滴加入原硅酸四乙酯,室温搅拌6 24h后对产物进行磁性分离,并将其洗涤后干燥,得到Fe3O4OSiO2核壳结构,即Fe3O4OSiO2磁性微球;
(3)Fe3O4OSiO2磁性微球的环氧化将步骤(2)制得的Fe3O4OSiO2磁性微球于盐酸溶液中溶解,然后磁性分离,将分离得到的颗粒洗涤至中性并烘干;将烘干后的颗粒加入到经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散,然后在氮气氛围下加入环氧化试剂和经KOH干燥脱水的三乙胺,加热回流4 6h ;冷却至室温,通过磁性分离,将所得产物用甲苯和丙酮洗涤后干燥,得到环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球;
(4)载蛋白的磁性微球的制备将步骤(3)制得的环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球用PBS溶液清洗,加入PH为7、的蛋白溶液,于37°C摇床恒温偶联2 48h后再用PBS溶液清洗;然后加入封闭试剂对未反应的氨基于37°C中和2 12h后用PBS溶液清洗,得到载蛋白的磁性微球。步骤(3)中,所述环氧化试剂为Y-缩水甘油醚基三甲氧基硅烷。步骤(4)中,所述封闭 试剂为甘氨酸、脱脂奶粉、牛血清白蛋白、乙醇胺、氯化铵。所述蛋白为重组纯化蛋白A、重组纯化蛋白G、抗原、抗体、多肽、酶。步骤(I)中,乙酸钠的用量为可溶性的三价铁离子盐的2 20倍摩尔量;三价铁离子盐与乙二醇的用量关系为每Immol的三价铁离子盐加入3 20mL乙二醇。步骤(2)中,乙醇、蒸馏水、氨水的混合溶液比例为乙醇/蒸馏水/氨水=40/10/Γ60/10/1 ;所述氨水的浓度为25%。原硅酸四乙酯在乙醇、水、氨水混合溶液中的浓度为f40mmol/L。所述Fe3O4颗粒与原硅酸四乙酯的摩尔比为3: f 1:15。步骤(3)中,所述Fe3O4OSiO2磁性微球与环氧化试剂和经KOH干燥脱水的三乙胺的用量关系为每Ig的Fe3O4OSiO2磁性微球加入环氧化试剂O. 5 10mL,加入KOH干燥脱水的三乙胺I 15mL。步骤(4)中,环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球与蛋白溶液的用量关系为每Ig的Fe3O4OSiO2磁性微球加入O. 5 50mg蛋白溶液。PBS溶液为磷酸盐缓冲溶液。原硅酸四乙酯即TE0S,重组纯化蛋白A简称蛋白A,重组纯化蛋白G简称蛋白G。步骤(2)和(3)中,盐酸溶液的浓度均为O. 1M,用量为将样品充分溶解即可,即步骤(2)中“将步骤(I)制得的Fe3O4颗粒分散于盐酸溶液中超声分散”至充分溶解,和步骤
(3)中“将步骤(2)制得的Fe3O4OSiO2磁性微球于盐酸溶液中浸泡”至充分溶解。步骤(3)中“将烘干后的颗粒加入到经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散”,对所述甲苯溶液的使用量的要求是烘干后的颗粒能够分散于其中即可。本发明有益的技术效果在于
本发明采用超顺磁性的四氧化三铁和原硅酸四乙酯在碱性条件下生成含有羟基的Fe3O4OSiO2磁性微球,经环氧化试剂活化后,导入环氧基,将重组Protein A和Protein G共价偶联到该顺磁颗粒,得到可用于磁免疫纯化的免疫磁性微球。Protein A和Protein G磁珠是一种能用于少量分离纯化免疫球蛋白的亲和介质,其对来源于许多哺乳动物种属的IgG亚型具有较高亲和力,如人、兔和小鼠。截短型蛋白展示了对IgG Fe区更高的单位结合能力和更低的非特异结合。由于Protein A和Protein G与磁珠的偶联在较宽的pH范围内都是稳定且致密的,因此可以对来自腹水、血清或细胞培养上清物中的IgG进行磁免疫纯化,介质随后还可以进行再生而不影响结合容量。它们还可用于免疫沉淀法,用所选一抗将目的蛋白从细胞粗提液中沉淀。此外,利用Protein A或Protein G磁珠还可制成可重复使用的免疫共沉淀磁珠。特定的抗体通过化学键交联到被Protein A或Protein G包被的磁珠表面,形成一个可重复使用的免疫共沉淀磁珠,避免了抗体与目的抗原共同洗脱。本发明原料易得,成本低廉,工艺简单重复性好,便于工业化生产,产品性能优越,可调控性强,在分离纯化免疫球蛋白及免疫沉淀等领域拥有广阔的应用前景。


图1为根据实施例2制备的载蛋白的Fe3O4OSiO2磁性微球扫描电子显微镜图。
具体实施例方式实施例1 :
(I)溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒称取六水合三氯化铁O. Olmol (2. 7g)和乙酸钠O. 02mol (1. 64g)溶于30ml乙二醇中,超声分散至样品完全溶解。将二者混合,机械搅拌至完全溶解。将样品转移到反应釜中密封,在180°C保持72h,然后自然冷却至室温。将得到的磁性粒子分别用水和乙醇进行多次洗涤,然后于60°C真空干燥箱中干燥6h,制得纳米四氧化三铁颗粒,也称为Fe3O4粒子。(2) Fe3O4OSiO2 核壳结构的制备将制得的 Fe3O4 粒子 2. 59mmol (O. 6g)于 300mLO.1M的盐酸溶液中超声lOmin,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤;将洗涤后的Fe3O4粒子分散于480 mL乙醇、120 mL蒸馏水、12 mL (25%)浓氨水的混合溶液中;将O. 86mmol (O. 18g)原硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入到Fe3O4溶液中,室温搅拌24h后对产物进行磁性分离,经多次水洗,醇洗后,60°C真空干燥6h,得到Fe3O4OSiO2核壳结构,也称为Fe3O4OSiO2磁性微球。(3) Fe3O4OSiO2磁性微球的环氧化将制得的Fe3O4OSiO2磁性微球O. 5g于IOOmLO.1M的盐酸溶液中浸泡lh,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤至中性并烘干;将处理过的O. 5g磁性微球加入到20mL经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散,然后通入氮气,在氮气氛围下加入O. 25mL Y -缩水甘油醚基三甲氧基硅烷试剂和O. 5mL经KOH干燥脱水的三乙胺,于100°C下加热回流4h ;冷却至室温,通过磁性分离,将所得产物用甲苯和丙酮洗涤,60°C真空干燥4h得到环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球。(4)载蛋白A的磁性微球的制备将O. 5g Fe3O4OSiO2磁性微球用PBS溶液清洗三次,加入O. 25mg pH=7的蛋白A溶液于37°C摇床恒温偶联2h后,用PBS清洗六次。然后加Λ O.1mL 10mg/mL的甘氨酸对未反应的氨基于37°C中和2h后用PBS溶液清洗,得到载蛋白A的磁性微球。实施例2
(I)溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒称取六水合三氯化铁O. Olmol (2. 7g)和乙酸钠O. 088mol (7. 2g)溶于IOOml乙二醇中,超声分散至样品完全溶解。将二者混合,机械搅拌至完全溶解。将样品转移到反应釜中密封,在200°C保持12h,然后自然冷却至室温。将得到的磁性粒子分别用水和乙醇进行多次洗涤,然后于60°C真空干燥箱中干燥6h,制得纳米四氧化三铁颗粒,也称为Fe3O4粒子。(2) Fe3O4OSiO2 核壳结构的制备将制得的 Fe3O4 粒子 2. 59mmol (O. 6g)于 300mLO.1M的盐酸溶液中超声lOmin,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤;将洗涤后的Fe3O4粒子分散于600 mL乙醇、120 mL蒸馏水、12 mL (25%)浓氨水的混合溶液中;将5. 18mmol (1. 08g)原硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入到Fe3O4溶液中,室温搅拌12h后对产物进行磁性分离,经多次水洗、醇洗后,60°C真空干燥6h,得到Fe3O4OSiO2核壳结构,也称为Fe3O4OSiO2磁性微球。(3) Fe3O4OSiO2磁性微球的环氧化将制得的Fe3O4OSiO2磁性微球O. 5g于IOOmLO.1M的盐酸溶液中浸泡lh,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤至中性并烘干;将处理过的O. 5g磁性微球加入到20mL经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散,然后通入氮气,在氮气氛围下加入2. 5mL Y -缩水甘油醚基三甲氧基硅烷试剂和5mL经KOH干燥脱水的三乙胺,于100°C下加热回流4h ;冷却至室温,通过磁性分离,将所得产物用甲苯和丙酮洗涤,60°C真空干燥4h得到环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球。
(4)载蛋白A的磁性微球的制备将O. 5g Fe3O4OSiO2磁性微球用PBS溶液清洗三次,加入12. 5mg pH=8的蛋白A溶液于37°C摇床恒温偶联24h后,用PBS清洗六次。然后加入2. 5mL 10mg/mL的氯化铵对未反应的氨基于37°C中和7h后用PBS溶液清洗,得到载蛋白A的磁性微球。本实施例所制备的载蛋白的Fe3O4OSiO2磁性微球透射电子显微镜图见图1所示。从图中可以看到,本发明所得磁性微球结构明显分为两层,内层为Fe3O4粒子,外层为SiO2层和蛋白层。该磁性微球分布均匀,没有团聚现象,微球粒径分布范围为18(Γ350μπι,主要集中于25(Γ300 μ m。使用Fe3O4粒子作为磁核使材料具有较强的磁响应性,在磁场下能够进行快速分离。实施例3
(I)溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒称取六水合三氯化铁O. Olmol (2. 7g)和乙酸钠O. 2mol (16. 406g)溶于200ml乙二醇中,超声分散至样品完全溶解。将二者混合,机械搅拌至完全溶解。将样品转移到反应釜中密封,在250°C保持4h,然后自然冷却至室温。将得到的磁性粒子分别用水和乙醇进行多次洗涤,然后于60°C真空干燥箱中干燥6h,制得纳米四氧化三铁颗粒,也称为Fe3O4粒子。(2) Fe3O4OSiO2 核壳结构的制备将制得的 Fe3O4 粒子 2. 59mmol (O. 6g)于 300mLO.1M的盐酸溶液中超声lOmin,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤;将洗涤后的Fe3O4粒子分散于720 mL乙醇、120 mL蒸馏水、12 mL (25%)浓氨水的混合溶液中;将25. 9mmol (5. 4g)原硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入到Fe3O4溶液中,室温搅拌24h后对产物进行磁性分离,经多次水洗、醇洗后,60°C真空干燥6h,得到Fe3O4OSiO2核壳结构,也称为Fe3O4OSiO2磁性微球。(3) Fe3O4OSiO2磁性微球的环氧化将制得的Fe3O4OSiO2磁性微球O. 5g于IOOmL
O.1M的盐酸溶液中浸泡lh,然后磁性分离,将粒子用乙醇和去离子水洗涤至中性并烘干;将处理过的O. 5g磁性微球加入到20mL经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散,然后通入氮气,在氮气氛围下加入5mL Y -缩水甘油醚基三甲氧基硅烷试剂和7. 5mL经KOH干燥脱水的三乙胺,于100°C下加热回流6h ;冷却至室温,通过磁性分离,将所得产物用甲苯和丙酮洗涤,60°C真空干燥4h得到环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球。(4)载蛋白G的磁性微球的制备将O. 5g Fe3O4OSiO2磁性微球用PBS溶液清洗三次,加入25mg pH=9的蛋白G溶液于37°C摇床恒温偶联48h后,用PBS清洗六次。然后加入5mL 10mg/mL的牛血清白蛋白对未反应的氨基于37°C中和12h后用PBS溶液清洗,得到载蛋白G的磁性微球。
权利要求
1.一种载蛋白的磁性微球的制备方法,其特征在于包括以下步骤 (1)制备Fe3O4颗粒将可溶性的三价铁离子盐及乙酸钠加入到乙二醇溶液中并搅拌均匀;然后将该混合溶液放入密闭容器中,在18(T30(TC条件下反应4 72h ;冷却后通过磁性分离,将所得产物洗涤后干燥,制得Fe3O4颗粒; (2)Fe3O4IgSiOdS壳结构的制备将步骤(I)制得的Fe3O4颗粒于盐酸溶液中溶解,然后磁性分离,将分离得到的颗粒洗涤;将洗涤后的颗粒分散于乙醇、蒸馏水、浓氨水的混合溶液中;向混合溶液中逐滴加入原硅酸四乙酯,室温搅拌6 24h后对产物进行磁性分离,并将其洗涤后干燥,得到Fe3O4OSiO2核壳结构,即Fe3O4OSiO2磁性微球; (3)Fe3O4OSiO2磁性微球的环氧化将步骤(2)制得的Fe3O4OSiO2磁性微球于盐酸溶液中溶解,然后磁性分离,将分离得到的颗粒洗涤至中性并烘干;将烘干后的颗粒加入到经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中,搅拌分散,然后在氮气氛围下加入环氧化试剂和经KOH干燥脱水的三乙胺,加热回流4 6h ;冷却至室温,通过磁性分离,将所得产物用甲苯和丙酮洗涤后干燥,得到环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球; (4)载蛋白的磁性微球的制备将步骤(3)制得的环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球用PBS溶液清洗,加入PH为7、的蛋白溶液,于37°C摇床恒温偶联2 48h后再用PBS溶液清洗;然后加入封闭试剂对未反应的氨基于37°C中和2 12h后用PBS溶液清洗,得到载蛋白的磁性微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(3)中,所述环氧化试剂为Y-缩水甘油酿基二甲氧基娃烧。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(4)中,所述封闭试剂为甘氨酸、脱脂奶粉、牛血清白蛋白、乙醇胺、氯化铵。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(4)中,所述蛋白为重组纯化蛋白A、重组纯化蛋白G、抗原、抗体、多肽、酶。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(I)中,所述乙酸钠的用量为可溶性的三价铁离子盐的疒20倍摩尔量;三价铁离子盐与乙二醇的用量关系为每Immol的三价铁离子盐加入3 20mL乙二醇。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(2)中,所述乙醇、蒸馏水、氨水的混合溶液比例为乙醇/蒸馏水/氨水=40/10/1 60/10/1 ;所述氨水的浓度为25%。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(2)中,所述原硅酸四乙酯在乙醇、水、氨水混合溶液中的浓度为I"40mmo I/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(2)中,所述Fe3O4颗粒与原硅酸四乙酯的摩尔比为3:广1:15。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(3)中,所述Fe3O4OSiO2磁性微球与环氧化试剂和经KOH干燥脱水的三乙胺的用量关系为每Ig的Fe3O4OSiO2磁性微球加入环氧化试剂O. 5 10mL,加入KOH干燥脱水的三乙胺l 15mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(4)中,所述环氧化的Fe3O4OSiO2磁性微球与蛋白溶液的用量关系为每Ig的Fe3O4OSiO2磁性微球加入O. 5 50mg蛋白溶液。
全文摘要
一种载蛋白的磁性微球的制备方法(1)将三价铁离子盐及乙酸钠加入到乙二醇溶液中反应;磁性分离;(2)将Fe3O4颗粒于盐酸中溶解,磁性分离后分散于乙醇、蒸馏水、浓氨水的混合溶液中;加入原硅酸四乙酯搅拌,磁性分离;(3)将Fe3O4@SiO2磁性微球于盐酸中溶解,磁性分离,加入到甲苯溶液中,搅拌分散,在氮气氛围下加入环氧化试剂和三乙胺,加热回流;冷却,磁性分离;(4)将环氧化的Fe3O4@SiO2磁性微球加入蛋白溶液,37℃摇床恒温偶联;加入封闭试剂对未反应的氨基于37℃中和,得到载蛋白的磁性微球。本发明原料简单易得,易于放大,产品性能优越,可调控性强,适用于分离纯化免疫球蛋白及免疫沉淀等领域。
文档编号B01J13/02GK103007846SQ201210540578
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者徐卫, 宋芳, 曹松峰 申请人:无锡百运纳米科技有限公司
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